Methodenartikel

Epigenetische Conversie als een veilige en eenvoudige methode om insuline-afscheidende cellen van volwassen huidfibroblasten

DOI:

10.3791/53880

⸱

18 maart 2016

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biomedical Embryology, Unistem, Centre for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een nieuwe methode gepresenteerd die de omzetting van volwassen huidfibroblasten in insulineproducerende cellen mogelijk maakt. Deze techniek is gebaseerd op epigenetische omzetting, gebruikt geen retrovirale vectoren en vereist geen verkrijging van een stabiel pluripotente toestand. Het is daarom zeer veelbelovend voor toepassingen in de translationele geneeskunde.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Regeneratieve geneeskunde vereist nieuwe, volledig functionele cellen die aan patiënten worden geleverd om gedegenereerd of beschadigd weefsel te herstellen. Wanneer dergelijke cellen niet direct beschikbaar zijn, kunnen ze worden verkregen met behulp van verschillende benaderingen, waaronder reprogrammering en transdifferentiatie, met voor- en nadelen die specifiek zijn voor de verschillende technieken. Hier wordt een nieuwe strategie beschreven voor de omzetting van een volwassen volwassen fibroblast in een insuline-afscheidende cel, willekeurig aangeduid als epigenetisch geconverteerde cellen (EpiCC). De methode is ontwikkeld op basis van het toenemende begrip van de mechanismen die de epigenetische regulatie van celbestemming en differentiatie controleren. In het bijzonder gebruikt de eerste stap een epigenetisch modificator, namelijk 5-aza-cytidine, om volwassen cellen in een "zeer permissieve" toestand te brengen. Het profiteert vervolgens van deze korte en omkeerbare venster van epigenetische plasticiteit, om cellen opnieuw te richten naar een andere lijn. De aanpak wordt aangeduid als "epigenetische celconversie". Het is een eenvoudige en robuuste manier om een efficiënte, gecontroleerde en stabiele celinter-lijnswitch te verkrijgen. Aangezien het protocol geen gebruik maakt van gentransfectie, het is vrij van virale vectoren en omvat geen stabiel pluripotente toestand, het is zeer veelbelovend voor toepassingen in de translationele geneeskunde.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een fundamentele doelstelling van de regeneratieve geneeskunde is het genereren van nieuwe, functionele cellen die kunnen worden gebruikt voor het repareren of vervangen van beschadigde, ontaardde weefsels. Herbouwen gemakkelijk beschikbaar volwassen cellen in nieuwe, door ze te converteren van de ene cel naar het andere, is een bijzonder aantrekkelijke benadering, vooral wanneer de gewenste celpopulatie niet overvloedig of moeilijk toegankelijk. Echter, volwassen cellen opmerkelijk stabiel. Zij krijgen hun gedifferentieerde toestand via een geleidelijke beperking van hun mogelijkheden en, als ze eenmaal de volwassen terminal specialisatie te bereiken, ze stabiel te houden dat 1.

In de afgelopen jaren een aantal protocollen ontwikkeld, dat de herprogrammering mogelijk om pluripotentie van een somatische cel (iPS) gerealiseerd door geforceerde expressie van een aantal transcriptiefactoren 2,3. Als alternatief kan de cel conversie worden verkregen door directe afstamming transdifferentiatie, de invoering van een enkele 4 of een combinatie van transcriptiefactoren 5-7. Deze strategie is niet de overgang door middel van een-de gedifferentieerde toestand te betrekken, maar vereist een hoge expressie van het specifieke transcriptiefactoren 8.

We hebben onlangs een conversie protocol gebaseerd op de korte blootstelling van volwassen cellen aan de demethylerende eigenschappen van het cytidine analoog 5-azacytidine (5-aza-CR), een goed gekarakteriseerde DNA-methyltransferase inhibitor. De demethylering stap wordt onmiddellijk gevolgd door een differentiatie protocol 9-11 waarmee de vereiste terminal fenotype te verkrijgen. Deze methode kan rijpe, gedifferentieerde cellen omgezet in cellen van een ander geslacht en heeft aanzienlijke voordelen voor zowel het gebruik van virale vectoren en transfectie van elke exogene transcriptiefactoren voorkomen. De overname van een stabiele pluripotente toestand, en de daarmee samenhangende verhoogde gevoeligheid voor instabiliteit cel wordt ook vermeden.

De gedetailleerde protocol dat de omzetting van volwassen menselijke huid fibroblasten in volledig functionele insuline uitscheidende cellen te bestuderen wordt hier gepresenteerd. Het is echter opgemerkt dat de techniek toegepast op verschillende celtypes en positieve resultaten heeft gegenereerd, bij het adresseren cellen aan verschillende differentiatieomzettingswegen. Bovendien is epigenetische omzetting met succes gebruikt in de humane en varkens 9-13 en bij honden (manuscript ingediend) suggereert een grote effectiviteit en robuustheid van de benadering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: Alle hieronder beschreven procedures moeten worden uitgevoerd onder laminaire stroming kap onder steriele omstandigheden. Zorg ervoor dat alle cultuur procedures worden uitgevoerd op thermostaatkraan podia bij 37 ° C gedurende hun behandeling uitgevoerd en cellen worden gehandhaafd.

1. Skin Fibroblast Isolation

  1. Bereid Cultuur Dish Coating Solution
    1. Los 0,1 g varkensgelatine in 100 ml water (eindconcentratie 0,1%). Steriliseren oplossing met een autoclaaf.
    2. Voeg 1,5 ml steriel 0,1% varkensgelatine tot 35 mm petrischalen. Wacht 2 uur om de vacht, het behoud van hen bij kamertemperatuur.
      Opmerking: menselijke huid biopten worden verzameld door excisie onder plaatselijke verdoving een avasculaire gebied van het voorste aspect van de onderarm en opgeslagen in Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 2% antibiotica-antimycotische oplossing bij 4 ° C vóór gebruik.
  2. Wassen biopten met nieuwe PBS gesupplementeerd met 2% antibiotische antimycotische oplossing.
  3. Plaats biopsieën in een 100 mm petrischaal en snijd ze in ongeveer 2 mm 3 fragmenten met steriele scalpels.
  4. Verwijder de overmaat bekledingsoplossing direct voorafgaand aan uitplaten fragmenten.
  5. Plaats 5-6 huid fragmenten in de pre-gecoate 35 mm petrischaal.
  6. Bereid fibroblast kweekmedium: 77% Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) hoog glucose, 20% foetaal runderserum (FBS), 1% L-Glutamine-oplossing en 2% antibiotica antimycotische oplossing.
  7. Voeg een druppel fibroblast medium dan elk fragment (meestal 100 pl per fragment) en kweken ervan bij 37 ° C in 5% CO2.
  8. Na 24 uur, voeg 500 pl fibroblast kweekmedium via fragmenten om ze vochtig houden 37 ° C in 5% CO2.
  9. Verander het medium met een pipet ten minste eenmaal per 48 uur.
  10. Na 6 dagen incubatie, verwijder weefsel fragmenten voorzichtig en gooi ze weg.
    Let op: Na 6 dagen, fibroblasts beginnen te groeien uit het weefsel fragmenten en beginnen een cel monolaag te vormen.
  11. Vernieuwen medium, voeg 2 ml fibroblast kweekmedium en blijven cel monolaag cultuur bij 37 ° C in 5% CO 2 incubator.

2. Fibroblast Cultuur

  1. Fibroblasten kweek bij 37 ° C in 5% CO2 tot 80% confluentie
  2. Voor passage, aspireren fibroblast kweekmedium uit weefselkweek gerechten. Was de cellen drie keer met 4 ml PBS aangevuld met 1% antibioticum antimycoticum oplossing.
  3. Voeg een dunne laag (10% van het kweekmedium volume) van trypsine-EDTA-oplossing (0,5 g / l varkens trypsine en 0,2 g / l EDTA) en incubeer bij 37 ° C tot cel monolaag begint los van de bodem van het weefsel cultuur schotel en cellen distantiëren.
  4. Verdun celsuspensie met 9 delen van fibroblast kweekmedium trypsine actie te neutraliseren. Centrifugatie niet noodzakelijk.
  5. Plaat cellen in nieuwe cultuur gerechten (metuit gelatine) en de cultuur bij 37 ° C in 5% CO 2 incubator. Houd de doorgang verhouding tussen 1: 2 en 1: 4, afhankelijk van de groeisnelheid.
  6. Wanneer de cellen bereikt ongeveer 80% confluentie passage daarvan (meestal twee keer per week).

3. fibroblast Plating voor Epigenetische Conversion

  1. Voeg 0,26 ml / cm 2 of 0,1% varkensgelatine (bereid zoals beschreven in 1.1) naar celkweekschalen. Wacht 2 uur tot vacht.
  2. Verwijder de overtollige coatingoplossing 10-30 min voorafgaand aan uitplaten fibroblasten.
  3. Verwijder fibroblast kweekmedium van cultuur gerechten. Was de cellen drie keer met PBS aangevuld met 1% antibioticum antimycoticum oplossing.
  4. Voeg een dunne laag (10% van het kweekmedium volume) van trypsine-EDTA-oplossing (0,5 g / l varkens trypsine en 0,2 g / l EDTA) en incubeer bij 37 ° C tot cel monolaag begint los van de bodem van het weefsel cultuur schotel en cellen distantiëren.
  5. Verdun celsuspensie met 9 delen fibroblast kweekmedium trypsine actie te neutraliseren.
  6. Aantal cellen met behulp van een telkamer onder een microscoop bij kamertemperatuur. Bereken het vereiste volume van fibroblast kweekmedium om cellen te resuspenderen, een celconcentratie van 7,8 x 10 4 fibroblasten / cm2 verkregen. Dit zal afhangen van het specifieke type gebruikte kamer.
    Cellen / l = Gemiddeld aantal cellen per kleine rooster x 90 (vermenigvuldigingsfactor) x verdunning
  7. Centrifugeer celsuspensie bij 150 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen met de eerder berekende volume van fibroblast kweekmedium.
  8. Plaat cellen op 0,1% gelatine vooraf beklede schalen en kweken ervan gedurende 24 uur bij 37 ° C in 5% CO2 incubator.

4. Verhoog Cell Plasticiteit De demethyleren Agent 5-aza-CR

  1. dag 0
    1. Bereid 5-aza-CR voorraadoplossing door het oplossen van 2,44 mg van 5-aza-CR 10 ml DMEM hoge glucose medium. Steriliseren door middel van filtratie. Bereid 5-aza-CR stock onmiddellijk voor gebruik.
    2. Verdun 1 pi van 5-aza-CR voorraadoplossing in 1 ml fibroblast kweekmedium (eindconcentratie 1 uM).
    3. Naar cel plasticiteit, 24 uur na plateren cell (post 3,8) toeneemt, verwijdert kweekmedium geënt fibroblasten en voeg 1 uM 5-aza-CR voorraadoplossing en kweek gedurende 18 uur bij 37 ° C in 5% CO2 incubator.
  2. Dag 1
    1. Vers bereid pluripotente menselijke (HP) medium volgens Tabel 1.
    2. Na incubatie met 1 uM 5-aza-CR, verwijderen medium en wassen cellen drie keer met PBS zodat 5-aza-CR wordt weggespoeld.
    3. Incubeer 5-aza-CR behandelde fibroblasten HP medium voor 3 uur (herstelperiode) bij 37 ° C in 5% CO2.
    4. Na de herstelperiode, te verwijderen medium, was drie keer met PBS.
    5. Om de efficiëntie van 5-aza-CR behandeling te controleren, controleren in deze stap fof de aanwezigheid van morfologische veranderingen (gespecificeerd in resultaten sectie). Cellen verliezen de typische langwerpige morfologie van fibroblasten en het verwerven van een ronde of ovale vorm, steeds kleiner in omvang, met vergrote kernen.
    6. Ga verder met pancreas differentiatie.

5. Pancreatic Differentiatie Protocol

  1. dagen 1-6
    1. Bereid Pancreatic Basale Medium zoals beschreven in Tabel 2.
    2. Bereid activine A voorraad: los 5 ug activine A recombinant humaan eiwit in 166,6 ul van steriel water.
    3. Cultuur 5-aza-CR behandelde fibroblasten in 0,26 ml / cm2 alvleesklier- Basal Medium, aangevuld met 1 ul / ml activine A voorraadoplossing (zie 5.1.2) gedurende 6 dagen bij 37 ° C in 5% CO2 incubator. Veranderen medium elke dag.
  2. dagen 7-8
    1. Bereid retinoïnezuur voorraadoplossing door het toevoegen van 16,6 ml dimethylsulfoxide (DMSO) om 50 mg reti- acid.
    2. Kweekcellen in 0,26 ml / cm2 Pancreatic basismedium gesupplementeerd met 1 ul / ml activine A voorraadoplossing (zie 5.1.2) en 1 ul / ml voorraadoplossing retinoïnezuur (zie 5.2.1) gedurende 2 dagen bij 37 ° C in 5% CO2. Veranderen medium elke dag.
  3. dagen 9-36
    1. Kweekcellen in 0,26 ml / cm2 Pancreatic basismedium gesupplementeerd met 1% (v / v) insuline-transferrine-selenium (ITS), 2% (v / v) B27 en 0,1% (v / v) recombinant humaan FGF basis- (bFGF) stockoplossing (zie tabel 1) bij 37 ° C in 5% CO2 incubator. Verander het medium dag gedurende de eerste 15 dagen.
    2. Vanaf dag 16 verder, verversen medium om de dag, onder een microscoop, aangezien vormende geaggregeerde cellen los van de bodem van de kweekschaal.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oprichting van primaire kweek van de huid biopsieën
Skin biopsies werden in kleine stukken gesneden en in gelatine vooraf beklede schalen. Na 6 dagen, fibroblasten gaan groeien uit het weefsel fragmenten en vormden een monolaag van cellen (Figuur 1A). Cellen vertoonden typische langwerpige vorm en, zoals verwacht, vertoonden een uniforme immuun-positiviteit voor fibroblast specifieke marker vimentine (Vim, figuur 1B).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit manuscript beschrijft een werkwijze die de omzetting van menselijke huidfibroblasten in insulineproducerende cellen toestaat, door een voorbijgaande en korte blootstelling aan 5-aza-CR, gevolgd door een weefselspecifieke inductieprotocol. Deze benadering maakt een overstap van mesoderm naar endoderm gerelateerde cellen, zonder dat de geforceerde expressie van transcriptiefactoren of microRNAs, noch de verwerving van een stabiele pluripotente toestand, dat cellen meer instabiel en gevoelig voor fouten 14 m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door Carraresi Foundation en de Europese Stichting voor de Studie van Diabetes (EFSD). GP wordt ondersteund door een post-doc fellowship van de Universiteit van Milaan. De auteurs zijn lid van de COST Actie FA1201 Epiconcept: Epigenetica en Periconception omgeving en de COST Actie BM1308 Sharing voorschotten op grote diermodellen (SALAAM). TALB is lid van de COST Actie CM1406 Epigenetische Chemical Biology (EPICHEM).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineSigmaD5652PBS; voor celwassing en oplossingsbereiding
Antibiotic Antimycotic SolutionSigmaA5955Component van Fibroblast, HP en Pancreatische media
100 mm Petri dishSarstedt83.3902Voor fibroblastisolatie
Porcine GelatinSigmaG1890Voor schaalcoating
WaterSigmaW3500Voor oplossingsbereiding
35 mm Petri dishesSarstedt83.39Voor fibroblastisolatie
DMEM, hoge glucose, pyruvateLife Technologies41966052Voor fibroblastcultuurmedium
Fetal Bovine SerumLife Technologies10500064FBS; Component van fibroblast- en HP-media
L-Glutamine solutionSigmaG7513Component van fibroblast-, HP- en pancreatische media
Trypsin-EDTA solutionSigmaT3924Voor fibroblastdissociatie
KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDSHycor Biomedical87144Celtelling
5-AzacytidineSigmaA23855-aza-CR, voor verhoging van celplasticiteit in fibroblasten
Ham's F-10 Nutrient MixLife Technologies31550031Voor HP-medium
DMEM, lage glucose, pyruvateLife Technologies31885023Voor HP-medium
KnockOut Serum ReplacementLife Technologies10828028Component van HP-medium
MEM Non-Essential Amino Acids SolutionLife Technologies11140035Component van HP- en pancreatische basaalmedium
2-MercaptoethanolSigmaM7522Component van HP- en pancreatische basaalmedium
GuanosineSigmaG6264Nucleoside mix voorraaddeling van HP-medium
AdenosineSigmaA4036Nucleoside mix voorraaddeling van HP-medium
CytidineSigmaC4654Nucleoside mix voorraaddeling van HP-medium
UridineSigmaU3003Nucleoside mix voorraaddeling van HP-medium
ThymidineSigmaT1895Nucleoside mix voorraaddeling van HP-medium
Millex-GS 0,22 µmMilliporeSLGS033SBVoor het steriliseren van oplossing
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human ProteinLife TechnologiesPHG0261bFGF; Component van HP- en pancreatische basaalmedium
Bovine Serum AlbuminSigmaA3311BSA; Component van pancreatisch basaalmedium
DMEM/F-12Life Technologies11320074Voor pancreatisch basaalmedium
B-27 Supplement Minus Vitamin ALife Technologies12587010Component van pancreatisch medium
N-2 SupplementLife Technologies17502048Component van pancreatisch basaalmedium
Activin A Recombinant Human ProteinLife TechnologiesPHG9014Voor pancreatisch medium
Retinoic AcidSigmaR2625Voor pancreatisch medium
Dimethyl sulfoxideSigmaD2650DMSO; voor bereiding van retinoïnezuurvoorraaddeling
Insulin-Transferrin-SeleniumLife Technologies41400045ITS; voor pancreatisch eindmedium
Anti-Vimentin antibody Abcamab8069Voor immunocytochemische analyse. Werkverdunning 1:100
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochlorideSigma32670DAPI. Voor immunocytochemische analyse. Werkverdunning  1 µg/ml
5-MethylcytidineEurogentecMMS-900P-BVoor immunocytochemische analyse. Werkverdunning 1:500
Anti-C Peptide antibody Abcamab14181Voor immunocytochemische analyse. Werkverdunning 1:100
Anti-PDX1 antibody Abcamab47267Voor immunocytochemische analyse. Werkverdunning 1:500
Mercodia Insulin ELISAMercodia10-1113-10Voor insuline-afgiftedetectie

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  3. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  4. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
  5. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  6. Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
  7. Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475, 386-389 (2011).
  8. Marro, S., et al. Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
  9. Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).
  10. Pennarossa, G., et al. Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).
  11. Brevini, T. A., et al. Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation. Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).
  12. Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).
  13. Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).
  14. Plath, K., Lowry, W. E. Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state. Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).
  15. Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
  16. Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression. Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).
  17. Do, J. T., Scholer, H. R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells. Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).
  18. Niwa, H. How is pluripotency determined and maintained? Development. 134 (4), 635-646 (2007).
  19. Kahan, B. W., et al. Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation. Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

behandeling met 5 aza cytidinepancreasdifferentiatieinductie met retino nezuursupplementatie met activine AITS B27 BFGS mediumPDX1 CPEP colocalisatieglucosegestimuleerde insulinerelase

Gerelateerde artikelen