Epigenetische Conversie als een veilige en eenvoudige methode om insuline-afscheidende cellen van volwassen huidfibroblasten

Summary

Here, a new method that allows the conversion of adult skin fibroblasts into insulin-secreting cells is presented. This technique is based on epigenetic conversion, does not involve the use of retroviral vectors nor the acquisition of a stable pluripotent state. It is therefore highly promising for translational medicine applications.

Abstract

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such cells are not readily available, they can be obtained using different approaches that include, among the many, reprogramming and trans-differentiation, with advantages and limitations that are specific of the different techniques. Here a new strategy for the conversion of an adult mature fibroblast into an insulin-secreting cell, arbitrarily designated as epigenetic converted cells (EpiCC), is described. The method has been developed, based on the increasing understanding of the mechanisms controlling epigenetic regulation of cell fate and differentiation. In particular, the first step uses an epigenetic modifier, namely 5-aza-cytidine, to drive adult cells into a "highly permissive" state. It then takes advantage of this brief and reversible window of epigenetic plasticity, to re-address cells toward a different lineage. The approach is designated "epigenetic cell conversion". It is a simple and robust way to obtain an efficient, controlled and stable cellular inter-lineage switch. Since the protocol does not involve the use of any gene transfection, it is free of viral vectors and does not involve a stable pluripotent state, it is highly promising for translational medicine applications.

Introduction

Een fundamentele doelstelling van de regeneratieve geneeskunde is het genereren van nieuwe, functionele cellen die kunnen worden gebruikt voor het repareren of vervangen van beschadigde, ontaardde weefsels. Herbouwen gemakkelijk beschikbaar volwassen cellen in nieuwe, door ze te converteren van de ene cel naar het andere, is een bijzonder aantrekkelijke benadering, vooral wanneer de gewenste celpopulatie niet overvloedig of moeilijk toegankelijk. Echter, volwassen cellen opmerkelijk stabiel. Zij krijgen hun gedifferentieerde toestand via een geleidelijke beperking van hun mogelijkheden en, als ze eenmaal de volwassen terminal specialisatie te bereiken, ze stabiel te ....

Protocol

Opmerking: Alle hieronder beschreven procedures moeten worden uitgevoerd onder laminaire stroming kap onder steriele omstandigheden. Zorg ervoor dat alle cultuur procedures worden uitgevoerd op thermostaatkraan podia bij 37 ° C gedurende hun behandeling uitgevoerd en cellen worden gehandhaafd.

1. Skin Fibroblast Isolation

1. Bereid Cultuur Dish Coating Solution
   1. Los 0,1 g varkensgelatine in 100 ml water (eindconcentratie 0,1%). Steriliseren oplossing met een autoclaaf.
   2. Voeg 1,5 ml steriel 0,1% varkensgelatine tot 35 mm petrischalen. Wacht 2 uur om de vacht, het behoud van hen bij kamertemperatuur.
      Opmerking: menselijke huid bi....

Results

Oprichting van primaire kweek van de huid biopsieën
Skin biopsies werden in kleine stukken gesneden en in gelatine vooraf beklede schalen. Na 6 dagen, fibroblasten gaan groeien uit het weefsel fragmenten en vormden een monolaag van cellen (Figuur 1A). Cellen vertoonden typische langwerpige vorm en, zoals verwacht, vertoonden een uniforme immuun-positiviteit voor fibroblast specifieke marker vimentine (Vim, figuur 1B).

Discussion

Dit manuscript beschrijft een werkwijze die de omzetting van menselijke huidfibroblasten in insulineproducerende cellen toestaat, door een voorbijgaande en korte blootstelling aan 5-aza-CR, gevolgd door een weefselspecifieke inductieprotocol. Deze benadering maakt een overstap van mesoderm naar endoderm gerelateerde cellen, zonder dat de geforceerde expressie van transcriptiefactoren of microRNAs, noch de verwerving van een stabiele pluripotente toestand, dat cellen meer instabiel en gevoelig voor fouten ¹⁴ m.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma	D5652	PBS; for cell wash and solution preparation
Antibiotic Antimycotic Solution	Sigma	A5955	Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media
100 mm Petri dish	Sarstedt	83.3902	For Fibroblast isolation
Porcine Gelatin	Sigma	G1890	For dish coating
Water	Sigma	W3500	For solution preparation
35 mm Petri dishes	Sarstedt	83.39	For Fibroblast isolation
DMEM, high glucose, pyruvate	Life Technologies	41966052	For Fibroblast culture medium
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10500064	FBS; Component of Fibroblast and HP media
L-Glutamine solution	Sigma	G7513	Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924	For Fibroblast dissociation
KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS	Hycor Biomedical	87144	Cell counting
5-Azacytidine	Sigma	A2385	5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts
Ham's F-10 Nutrient Mix	Life Technologies	31550031	For HP medium
DMEM, low glucose, pyruvate	Life Technologies	31885023	For HP medium
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828028	Component of HP medium
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Life Technologies	11140035	Component of HP and Pancreatic Basal media
2-Mercaptoethanol	Sigma	M7522	Component of HP and Pancreatic Basal media
Guanosine	Sigma	G6264	Nucleoside mix stock component of HP medium
Adenosine	Sigma	A4036	Nucleoside mix stock component of HP medium
Cytidine	Sigma	C4654	Nucleoside mix stock component of HP medium
Uridine	Sigma	U3003	Nucleoside mix stock component of HP medium
Thymidine	Sigma	T1895	Nucleoside mix stock component of HP medium
Millex-GS 0,22 µm	Millipore	SLGS033SB	For sterilizing of solution
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein	Life Technologies	PHG0261	bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3311	BSA; Component of Pancreatic Basal medium
DMEM/F-12	Life Technologies	11320074	For Pancreatic Basal medium
B-27 Supplement Minus Vitamin A	Life Technologies	12587010	Component of Pancreatic medium
N-2 Supplement	Life Technologies	17502048	Component of Pancreatic Basal medium
Activin A Recombinant Human Protein	Life Technologies	PHG9014	For Pancreatic medium
Retinoic Acid	Sigma	R2625	For Pancreatic medium
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650	DMSO; for Retinoic Acid stock preparation
Insulin-Transferrin-Selenium	Life Technologies	41400045	ITS; for Pancreatic Final medium
Anti-Vimentin antibody	Abcam	ab8069	For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Sigma	32670	DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution  1 µg/ml
5-Methylcytidine	Eurogentec	MMS-900P-B	For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500
Anti-C Peptide antibody	Abcam	ab14181	For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100
Anti-PDX1 antibody	Abcam	ab47267	For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500
Mercodia Insulin ELISA	Mercodia	10-1113-10	For insulin release detection