Identificatie van de kritische Voorwaarden voor Immunokleuring in de erwtenbladluis Embryo's: Toenemende Tissue permeabiliteit en Afnemende Achtergrond kleuring

Samenvatting

Een protocol van gehele immuunkleuring op bladluisembryo's wordt gepresenteerd, waarin kritieke omstandigheden voor het verminderen van achtergrondkleuring en het verhogen van weefseldoorlaatbaarheid worden behandeld. Deze omstandigheden zijn specifiek ontwikkeld voor effectieve detectie van eiwitexpressie in de embryonale weefsels van bladluizen.

Samenvatting

De erwt Acyrthosiphon pisum, met een gefaseerde genoom en overvloedige fenotypische plasticiteit, is uitgegroeid tot een opkomende model voor genomische en ontwikkelingsstudies. Net als andere bladluizen, A. Pisum verspreiden zich snel via parthenogenetische levendbarende voortplanting, waar de embryo's ontwikkelen binnen ei kamers in een lopende band mode in de ovariole. Eerder hebben we een robuust platform van whole-mount in situ hybridisatie waardoor detectie van mRNA expressie in de bladluis embryo's vastgesteld. Voor het analyseren van de expressie van eiwitten, hoewel, vastgestelde protocollen voor immunokleuring de ovarioles van ongeslachtelijke levendbarende bladluizen leverde geen bevredigende resultaten te produceren. Hier melden wij voorwaarden geoptimaliseerd voor toenemende weefsel permeabiliteit en dalende achtergrond kleuring, die beide waren problemen bij het toepassen van gevestigde benaderingen. Optimalisaties omvatten: (1) incubatie van proteïnase K (1 ug / ml, 10 min) en bleek essentieel fof antilichaam penetratie in de midden- en late fase bladluis embryo's; (2) vervanging van normale geit serum / runderserumalbumine met een digoxigenine (DIG) toegevoerd blokkerend reagens gebaseerde buffer set en (3) de toepassing van methanol eerder waterstofperoxide (H ₂ O ₂₎ voor het bleken endogeen peroxidase; die aanzienlijk verminderde de achtergrondkleuring in de bladluis weefsels. Deze kritische omstandigheden geoptimaliseerd voor immunokleuring zal doeltreffende detectie van genproducten mogelijk maken in de embryo's van A. Pisum en andere bladluizen.

Inleiding

Bladluizen zijn Hemipteran insecten met kleine (1-10 mm) zachte lichamen. Ze voeden zich met planten door zuigen phloem sap met piercing monddelen. Bovendien, ze vertrouwen op een obligaat endosymbiotic bacterie, Buchnera aphidicola, essentiële aminozuren die een tekort aan het floëem sap dieet te synthetiseren. Bladluizen hebben een complexe leven geschiedenis die parthenogenetische levendbarende voortplanting in het voorjaar en de zomer lange dag fotoperiodiciteit en seksuele ovipaar voortplanting veroorzaakt door korte-dag fotoperiodiciteit waarin zij lag een beperkt aantal overwinterende eieren ^1,2 omvat. In het voorjaar van deze eieren uitkomen van de eerste generatie van de all-female bladluizen (fundatrices) te produceren, na vele rondes van parthenogenetische voortplanting tot de herfst. De cyclische parthenogenese in bladluizen, waar de aseksuele en seksuele fasen wisselen elkaar af in de jaarlijkse levenscyclus, is beschouwd als een evolutionaire nieuwigheid ^1,2. In de parthenogenetische levendbarende bladluizen, Embryogenese plaatsvindt binnen ei kamers van de ovariële buisjes (ovarioles). Daarentegen seksuele oviparous embryo's ontwikkelen in de bevruchte eieren. Afgezien van reproductieve plasticiteit, kunnen bladluizen transgenerationele vleugel polyfenisme weer te geven: in reactie op overbevolking signalen en roofdier bedreigingen, kan het ongevleugelde aseksuele vrouwtjes levendbarende produceren gevleugelde nakomelingen voor migratie over lange afstand. Publicatie van de genoomsequentie van de erwt Acyrthosiphon pisum -het eerste genoom sequentie voor een basale hemimetabolous insect-maakt verdere verkenning van reproductieve plasticiteit, vleugel polyfenisme, en andere functies, waaronder insect-plant interacties, virale vectoring en symbiose in bladluizen op een moleculaire basis ^3.

Naast het genoom gesequenced, zijn hulpmiddelen voor het karakteriseren genexpressie en functie vereist voor het bevorderen van de erwtenbladluis als volwassen modelorganisme ^4. We hebben robuuste protocollen van de hele-mount beschreven in situ hybridisatie voor het detecteren van expressie van mRNA in embryo bladluis ^5-7. RNA interferentie (RNAi) via dubbelstrengs RNA injectie en voeding is gebruikt voor silencing in bladluis nimfen en volwassenen, maar stabiele omstandigheden voor gentherapie knockdown in de embryo's nog niet gerapporteerd ^8-10. Immunokleuring, een antilichaam-gebaseerde aanpak die eiwitexpressie kan detecteren in monsters voor en na RNAi knock-down, is uitgevoerd op erwtenbladluis embryo ^11-13. Echter, verhoging van weefsel permeabiliteit en de eliminatie van de achtergrond vlekken zijn nog onvoldoende gebruik van standaard protocollen voor immunokleuring in de aseksuele levendbarende embryo's van erwtenbladluis. Zo vonden we dat penetratie van antilichaam aan het weefsel afgenomen gastrulating embryo (stadia 8-10) en embryo morfologisch identificeerbare ledematen (fasen 13-14) was nauwelijks permeabel voor antilichaam. Bovendien werd achtergrondkleuring gevisualiseerd in de aseksuele viviparoons erwtenbladluis embryo's gekleurd met behulp van antilichaam tegen het marker kiemlijn Vasa evenals die tegen Engrailed / Invected eiwit tot expressie gebracht in embryonale segmenten ^12,13. Eigenlijk achtergrondkleuring nog duidelijk zichtbaar in embryo's gekleurd met het secundaire antilichaam alleen.

Om de permeabiliteit verhogen zonder beschadiging van de integriteit van bladluis weefsels we zorgvuldig getitreerde de concentratie van proteinase K en bepaalde optimale omstandigheden voor weefsel digestie op bladluis embryo. Om niet-specifieke kleuring in de erwtenbladluis te vermijden, hebben we gezocht naar verbindingen die effectief embryo's kunnen blokkeren en onderdrukken de activiteit van endogene peroxidase (POD), een enzym gebruikt voor het versterken van signalen tijdens immunokleuring. Een blokkerende reagens geleverd door een digoxigenine (DIG) -gebaseerde bufferset plaats de traditioneel gebruikte normaal geitenserum (NGS) / bovine serum albumine (BSA), aanzienlijk verminderd achtergrondkleuring. Bovendien werd gevonden dat methanol inhibeet de endogene activiteit POD effectiever dan waterstofperoxide (H ₂ O _2). Details betreffende deze bladluis-specifieke voorwaarden voor immunokleuring op embryo's worden beschreven in de volgende paragrafen.

Protocol

1. Cultuur van bladluizen

NB. Het laboratorium stam van de parthenogenetische levendbarende erwtenbladluis Een pisum werd oorspronkelijk verzameld in het centrum van Taiwan en is grootgebracht op waardplanten (de tuin erwt Pisum sativum of tuinboon Vicia faba) op basis van lange-dag fotoperiode voor meer dan 300 generaties (één generatie: ~ 10 dagen).

1. Kieming van zaden
   1. Week de zaden van de waardplanten in leidingwater gedurende 3-5 dagen bij RT. Vullen met vers water een keer per dag.
      OPMERKING: U zet zaden van waardplanten recht in vochtige grond kan ontkiemen en veroorzaken.
   2. Kweek 10 kiemende zaden in een kleine pot (9 cm diameter x 7 cm lang) met de bodem in de groeikamer onder lichtperiode 16 uur licht / 8 uur donker bij 20 ° C.
   3. Ongeveer 10 dagen na de groei begint, overdragen bladluizen op planten waarvan de hoogte is meer dan 8 cm.
2. Overdracht van bladluizen
   1. Houd elke pot planten binnen een 1 liter glazen beker, overdragen 8 volwassen bladluizen op planten met behulp van een penseel, en dan sluit de beker met een luchtdoorlatende hoes zoals gaas gaas om bladluizen voorkomen ontsnappen.
   2. Incubeer bladluizen in een groeikamer onder lichtperiode 16 uur licht / 8 uur donker bij 20 ° C. Water per pot planten eenmaal per dag.
   3. Voor het verkrijgen van de volgende generatie van bladluizen, herhaal stappen 1.1.3-1.2.2 tien dagen na de primaire bladluis overdracht.

2. Dissection en Fixatie van Eierstokken

1. Vers bereiden 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) als fixatie buffer.
2. Vul een putje van een plek plaat met PFA (ongeveer 500 pl), plaatst u de plaat onder een stereomicroscoop bij een lage vergroting, en dompel een volwassen bladluis binnen de PFA voor dissectie.
3. Ontleden eierstokken door het houden van het hoofd en buik met een set van een tang, opensnijden van de dorsalecuticula van de buik en het slepen van de eierstokken verwijderd uit de buikholte.
4. Bevestig drie paar eierstokken in een 1,5 ml buis die 1 ml PFA bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
5. Decant fixatie buffer met een transfer pipet (ofwel glas of wegwerp) en was daarna de eierstokken met 0,2% Triton-100 in 1x PBS (PBST) 3 keer voor 10 minuten elk. Milde schudden op een mixer / rotator (draaihoek: 60 ° (F60) / rotatiesnelheid: 8 RPM) wordt aanbevolen voor zowel fixatie en wassen.

3. De behandeling met Proteinase K (PK) om de permeabiliteit van embryonale weefsels verhogen

OPMERKING: PK behandeling wordt toegepast om embryo's uit kiem band uitbreiding verder (fase 11 van de ontwikkeling). Voor jongere embryo's, deze stap is optioneel.

1. In serie verdunde voorraadoplossing van het PK (10 mg / ml) met 1 x PBS om de werking concentratie 1 gg / ml.
2. Incubeer eierstokken met 1 ug / ml PK (ongeveer 500 ui) gedurende 10 min met lichte schudden.
3. Decant PK Solutiop en spoel daarna de eierstokken met 700 gl Glycine (2 mg / ml) 3 maal gedurende 5 min elk.
4. Was eierstokken met 0,2% PBST tweemaal gedurende 10 min elk.
5. Bevestig eierstokken opnieuw met fixatie buffer gedurende 15 min bij kamertemperatuur met milde schudden.
6. Gooi supernatant en was eierstokken met 0,2% PBST tweemaal gedurende 10 min elk.

4. Methanol Incubatie onderdrukken de endogene peroxidase-activiteit (POD)

OPMERKING: Methanol incubatie wordt niet toegepast op embryo's onderworpen aan Phalloidin vlekken of antilichaam epitopen die methanol gevoelig zijn.

1. In serie dehydrateren eierstokken met verschillende percentage methanol in PBST 0,2% (v / v: 1: 3, 1: 1, 3: 1) door incubatie eierstokken bij elke concentratie van methanol gedurende 10 minuten onder zacht roeren.
2. Dehydrateren eierstokken met 100% methanol gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met milde schudden.
   OPMERKING: Bevredigende resultaten van de kleuring kan nog worden verkregen van bladluis weefsels die werden opgeslagen in 100% methanol bij -20 &# 176; C gedurende één maand.
3. In serie hydrateren eierstokken met verschillende percentage methanol in PBST 0,2% (v / v: 3: 1, 1: 1, 1: 3) door incubatie eierstokken bij elke concentratie van methanol gedurende 10 minuten onder zacht roeren.

5. antilichaamkleuring

1. Verdun de 10x blokkerende oplossing van de DIG-based buffer set (DIG-B) naar 1x.
   Opmerking: De 1x DIG-B blokkerende oplossing effectiever voor het reduceren van de kleuring achtergrond dan de standaard blokkerende reagens bestaande uit 5% (v / v) normaal geitenserum (NGS) en 0,5% (v / v) runderserumalbumine (BSA ) in 0,2% PBST.
2. Incubeer de eierstokken met 1 x DIG-B blokkerende oplossing gedurende 2,5-4 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C onder mild schudden.
   LET OP: Voor de drie paren van de eierstokken in een 1,5 ml tube, 200 pi is het minimale volume voor het monster blokkeren en antilichaam kleuring.
3. Giet supernatant en te vervangen door verse 1x DIG-B blokkerende oplossing die primaire antilichaam op geschikte dilution ratio. Vlekken de eierstokken voor 4 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C onder mild schudden.
   OPMERKING: Voor de hier beschreven experiment, gebruikt u de volgende optimale verdunningen van primaire antilichamen: (1) ApVas1 antilichaam: 1: 500 voor chromogene kleuring, 01:50 voor immunofluorescentiekleuring; (2) anti-α tubuline antilichaam: 1: 500; (3) 4D9 monoklonaal antilichaam: 01:25.
4. Was eierstokken met 0,2% PBST 4 keer gedurende 15 minuten elk.
5. Incubeer eierstokken met 1x DIG-B blokkerende oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met milde schudden.
6. Giet supernatant en te vervangen door verse 1x DIG-B blokkerende oplossing die secundair antilichaam op geschikte verdunningsverhouding. Vlekken de eierstokken voor 4 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C onder mild schudden.
   1. Gebruik de volgende verdunningsverhoudingen van secundaire antilichamen: (1) Voor immunofluorescentiekleuring: 1: 500 van Alexa Fluor 633 geit anti-konijn IgG of Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG; (2) Voor chromogene kleuring: 1: 200 van gebiotinyleerd geit anti-konijn IgG.
      Opmerking: Het gebiotinyleerde secundaire antilichaam wordt toegepast voor interactie met het avidine-biotine-complex (ABC) in het substraat-gebaseerde (chromogene) detectie, waardoor de kleuring signalen aanzienlijk versterkt.
   2. Voor immunofluorescentiekleuring, voeren vlekken in het donker, omdat het secundaire antilichaam is lichtgevoelig.
7. Afwassen secundair antilichaam met 0,2% PBST 4 keer voor 10 minuten elk.

6. Nucleaire en F-actine kleuring

NB: Dit wordt alleen toegepast voor immunofluorescentiekleuring.

1. Vlek eierstokken met 0,2% PBST dat DAPI (2 ng / ul) en Phalloidin-TRITC (100 nM) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in het donker.
2. Was eierstokken met 0,2% PBST 4 keer gedurende 10 minuten elk.
3. Incubeer eierstokken de montage medium O / N bij 4 ° C onder mild schudden.

7. Signaal Ontwikkeling

NB: Dit wordt alleen toegepast voor chromogene kleuring.

1. Bereid 100 pireagens avidine-biotine-complex (ABC) teneinde de signalen door toevoeging van 1 pi van Reagens A (avidine) in 98 pl 0,2% PBST, grondig mengen via zacht pipetteren, en het toevoegen van 1 pi van Reagens B (biotine geconjugeerd met mierikswortelperoxidase ), gevolgd door onmiddellijk mengen. Incubeer het mengsel gedurende 30 min bij kamertemperatuur met milde schudden.
2. Incubeer eierstokken (inclusief gedissocieerd ei kamers) in het mengsel van reagentia A en B gedurende 30 min bij kamertemperatuur met milde schudden.
3. Wassen het mengsel van reagentia A en B met 0,2% PBST 4 keer gedurende 10 minuten elk.
4. Transfer eierstokken ondergedompeld in PBST tot een goed op de plek plaat met een plastic druppelaar.
5. Bereid substraat oplossing van 3,3'-diaminobenzidine (DAB): los een tablet DAB plus een andere die ureum waterstofperoxide in 1 ml van DDH ₂ O via krachtig vortexen gedurende 1 min.
   OPMERKING: DAB, een substraat neerslaan van peroxidase, is een populaire chromogen voor immunokleuring. Het produceert een breigen en onoplosbare neerslag na geoxideerd door het peroxidase. Zwakke signalen kunnen worden verbeterd door toevoeging van nikkelchloride de substraatoplossing (eindconcentratie 0,05-0,08%).
6. Verwijder de PBST oplossing achterblijft in de put en vul met 100 ul van de DAB substraatoplossing voor signaalverwerking ontwikkeling.
7. Monitor intensiteit van signalen onder een stereomicroscoop bij een lage vergroting.
8. Stop reacties door het verwijderen van de DAB-oplossing, gevolgd door het bijvullen met 1x PBS onmiddellijk. Herhaal het wassen twee keer.
9. Transfer eierstokken terug naar de 1,5 ml buis en daarna wassen met 1x PBS of PBST tweemaal voor 15 minuten elk.
10. Incubeer eierstokken in een glycerol-based montage medium (70% glycerol) O / N bij 4 ° C onder mild schudden.

8. Montage van de Bladluis Embryo

OPMERKING: De dikte van bladluis embryo varieert ontwikkelingsstadia. Montage strategieën worden dus gewijzigd om vroeg te passen (germaria en stadia 0-10), mid (stadia11-18), en late embryo (stadia 19-20), die zijn getoond in Figuur 2B - D. Embryonale enscenering gevolgd Miura et al ^12.

1. Transfer eierstokken samen met montage medium aan de cel dienblad met een plastic druppelaar en acht monsters onder een stereomicroscoop bij een lage vergroting.
2. Snijd de kelken in verband met de laterale eileider met insect pinnen en vervolgens over een geïsoleerde ovariole naar een leeg glas goed met een druppelaar. Deel uitmaken van de uiteindelijke volume op 50-100 pi met montage medium.
3. Transfer een ovariole op de dia met een dropper en vervolgens ontleden ei kamers met insect pinnen.
   LET OP: Voor embryo's ouder dan 6 fase van de ontwikkeling, de scheiding van ei kamers wordt gesuggereerd; voor germaria en de eerste twee ei kamers jonger dan 6 fase scheiding is optioneel.
4. Verplaats een ontleed ei kamer een schone dia met behulp van een glazen pipet.
5. Zet een dekglaasje (afmetingen: 22 x 22mm) over de ontleed germaria of ei kamers (met embryo's in stadia van ontwikkeling 1-10) langzaam om luchtbellen te vermijden.
   1. Mount ei kamers (met embryo's in stadium 18/11 ontwikkeling) op een dia met eenzijdige dekglaasje bridge en plaats een dekglaasje (grootte: 18 x 18 mm) boven het monster.
   2. Mount ei kamers (met embryo's ouder dan 19 stadium van ontwikkeling) op een dia met dubbelzijdig dekglaasje brug en plaats een ander dekglaasje (afmetingen: 18 x 18 mm) op de bovenkant van het monster.
6. Vullen de ruimte onder de top dekglaasje met montage media om te voorkomen dat het drogen van het monster.
7. Mild roll het embryo door de dekglaasje te schuiven om de juiste oriëntatie voor observatie te verkrijgen.
8. Afdichting rond de rand van de dekglaasjes (met inbegrip van de brug dekglaasjes) met nagellak.

9. Imaging Analyse

1. Foto differentieel interferentie contrast (DIC) beelden van de hele-mount embryo's met een compound microscoop uitgerust met DIC optiek en een droge objectieflens (10X, 20X, 40X) verbonden met een camera. Installeer de software voor beeldoverdracht tussen de camera en de computer met behulp van instructies van de fabrikant.
2. Verwerven projecties van de fluorescent gelabelde embryo's met een laser-scanning confocale microscoop ^14. De instructies van de fabrikant voor het fotograferen, z-stapelen en 3D uitsteken beeldverwerkingssoftware.
   1. Draai de dia ondersteboven, vinden de gemonteerde monster met 10X objectieve en omcirkelen het monster met een fijn geoliede-gebaseerde pen.
      NB: Dit maakt het identificeren van het monster gemakkelijker bij het zoeken naar deze doelstellingen door middel van een confocale microscoop.
   2. Een druppeltje olie op de bovenkant van het dekglaasje gebied waarvan tegenoverliggende zijde gelabeld zoals beschreven in 9.2.1.
3. Vind de focal plane op 40X olie-immersie objectief dan overstappen op een 63x olie-immersie objectief. Handmatig verplaatsen van de fijne scherpstelling controle op en doenwn om de beste focal plane vangen.
   LET OP: Voor het observeren van structurele details van germaria en vroege embryo's, raden wij u 40X doelstellingen of mensen met een hogere vergroting.
4. Scan de embryo in verschillende excitatie kanalen en het imago van een z-stack te verkrijgen.
   OPMERKING: Bij erwtenbladluis weefsels verminderen dikte van elke optische gedeelte neer op 1,5 urn of minder.

Resultaten

In deze studie hebben we uitgevoerd whole-mount immunokleuring op embryo's van aseksueel erwt bladluizen (Figuur 1A). Deze vrouwen produceren nakomelingen parthenogenetisch en levendbarende. Deze vrouwelijke embryo's ontwikkelen binnen ei kamers van de ovariële buisjes (ovarioles) (Figuur 1B en figuur 2A). Voordat microscopie, de ontleed ovarioles zijn de vlekken doelstellingen; echter gescheiden ei kamers vereis...

Discussie

We identificeerden optimale omstandigheden van cruciaal belang voor een succesvolle immunokleuring in de erwtenbladluis A. Pisum, een opkomende modelorganisme voor genomische en ontwikkelingsstudies ^3,15. Geoptimaliseerde omstandigheden voor toenemende weefsel permeabiliteit en verminderen achtergrondkleuring verhoogde intensiteit en specificiteit van signalen. Zij verschillen van standaardprotocollen voor immunokleuring in andere dierlijke modellen in de stappen voor het creëren van poriën ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
30% hydrogen perxidase (H2O2)	Sigma-Aldrich	18304	Voor het bleken van endogene peroxidase van embryo's.
4’6-diamidino-2-fenyl-indooldihydrochloride (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	Voor het labelen van het dubbelstrengs DNA. TOXIC. Draag handschoenen, doseer in kleine porties en bevries om blootstelling te minimaliseren
4D9 anti-engrailed/invected muis monoklonaal antilichaam	Developmental studies hybridoma bank	AB_528224	Voor het labelen van de zich ontwikkelende segmenten van het embryo.
ApVas1 konijn polyklonaal antilichaam	Ons laboratorium	N/A	Voor het labelen van de afide geslachtsspecifieke Vas1-eiwit in embryo's. Dit antilichaam is gemaakt door ons laboratorium.
Austerlitz Insect pins	ENTOMORAVIA	N/A	Voor het scheiden van elke eikamers van een ovariolie. Grootte 000, ZWART GEËMAILLEERD.
Rund serum albumine (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	Voor het blokkeren van de niet-specifieke binding van antilichamen.
Camera aangesloten op compound microscoop	Canon	EOS 5D	Voor het fotograferen van afide embryo's.
Colorimetrische 8-cel tray	Kartell Labware	357	Voor het ontwikkelen van het kleuringssignaal van afide embryo's. Diameter 95 x 57 mm, celdiepte 2 mm.
Compound microscoop met DIC-optiek	Leica Microsystems	DMR	Voor het fotograferen van afide embryo gemonteerd op de dia's.
DIG Wash and Block Buffer Set	Sigma-Aldrich (Roche)	11585762001	Voor het blokkeren van de niet-specifieke binding van antilichamen. We verdundde de 10x blokkeringsoplossing in 1x als blokkeringsreagens.
Pincet	Ideal-tek	N/A	Voor de dissectie van eierstokken van afidae. Fabrikant onderdeelnummer 5: 5 SA.
Glazen dropper	N/A	N/A	Voor het overbrengen van eierstokken van afidae van de splotplaat naar buisjes. 150 mm totale lengte en 5 3/4" van tiplengte.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Voor het verduidelijken van afide embryo's en montage.
Glycine	Bioshop	N/A	Voor het blokkeren van de enzymactiviteit van proteinase K (PK).
Geit anti-muis IgG geconjugeerd met Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	Voor de detectie van primaire antilichamen uit muis.
Geit anti-konijn IgG geconjugeerd met Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	Voor de detectie van primaire antilichamen uit konijn.
Intelli mixer	ELMI laboratory equipment	RM-2M	Voor het verbeteren van de volledige reactie van reagentia met eierstokken.
Laser-scanning confocale microscopie	Leica Microsystems	SP5	Voor het fotograferen van afide embryo gemonteerd op de dia's met fluorescente tag.
Methanol	Burdick and Jackson	AH2304	Voor het bleken van endogene peroxidase van embryo's.
Microscoop slides	Thermo scientific	10143560	Voor het monteren van embryo's. SUPERFROST gemalen randen, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscoop dekglazen	Marienfeld	0101030	Voor het monteren van embryo's op de dia's. Grootte 18 x 18 mm. Dikte No. 1 (0.13 tot 0.16 mm)
Microscoop dekglazen	Marienfeld	0101050	Voor het monteren van embryo's op de dia's. Grootte 22 x 22 mm. Dikte No. 1 (0.13 tot 0.16 mm)
Muis monoklonaal anti-alphaTubulin antilichaam (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	Voor het labelen van de distributie van alpha-tubuline van cellen.
Nagellak	N/A	N/A	Voor het verzegelen van de dekglazen op de dia's.
Normaal geitenserum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	Voor het blokkeren van de niet-specifieke binding van antilichamen.
Paraformaldehyde (PFA)	VWR	MK262159	Voor de fixatie van afide eierstokken.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	Voor het labelen van de distributie van F-actine op embryo's.
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)	N/A	N/A	Als isotone oplossing voor afide eierstokken.
Kunststof dropper	N/A	N/A	Voor het overbrengen van eierstokken van afidae van buisjes naar cel tray. Grootte 3 ml.
Proteinase K	Merck	124678	Voor het creëren van poriën (punching) op het celmembraan en het vergemakkelijken van de toegang van antilichamen.
Pyrex spotplaat	N/A	N/A	Voor de dissectie en kleurreacties van afide eierstokken onder microscopie. Elke holte met een diameter van 22 mm en  diepte 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tabletten	Sigma-Aldrich	D4168	Voor het ontwikkelen van substraatsignalen. Ook wel DAB peroxidase substraat tablet set genoemd.
Stereomicroscoop	Leica Microsystems	EZ4	Voor de dissectie en observatie van afide eierstokken.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	Voor het creëren van poriën (punching) op het celmembraan.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector laboratories	PK-6101	Voor het verbeteren van het signaal. Inclusief biotinyleren geit anti-konijn IgG secundair antilichaam, A en B reagentia.
VECTASHIELD montagemedium	Vector laboratories	H1000	Voor het verd