Methodenartikel

Een gecombineerde 3D Weefselmanipulatieproducten

9.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53885

⸱

6 april 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Tissue Engineering and Regenerative Medicine (TERM), University Hospital Wuerzburg, 2Department of Cardiothoracic Surgery, University Hospital Wuerzburg, 3Department of Bioinformatics, University Wuerzburg, 4Translational Center Wuerzburg, Fraunhofer Institute Interfacial Engineering and Biotechnology IGB

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een driedimensionaal (3D) longkankermodel gebaseerd op een biologisch collageenscaffold om gevoeligheid voor op non-kleincellige-longkanker-(NSCLC)-gerichte therapieën te bestuderen. We demonstreren verschillende meettechnieken om de proliferatie-index, apoptose en epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) status te bepalen. Verzamelde gegevens worden geïntegreerd in een in silico model voor voorspelling van drugsgevoeligheid.

Samenvatting

In de onderhavige studie en we een in vitro 3D longtumor model met een in silico model voorspellingen van geneesmiddelrespons optimaliseren op basis van een specifieke mutatie achtergrond. Het model wordt gegenereerd op een cellen ontdane varkens scaffold dat weefsel-specifieke kenmerken met betrekking tot de extracellulaire matrix samenstelling en architectuur met inbegrip van het basaal membraan reproduceert. We gestandaardiseerd een protocol dat kunstmatige tumorweefsel generatie maakt het mogelijk binnen 14 dagen, waaronder drie dagen van de behandeling met geneesmiddelen. Ons artikel biedt een aantal gedetailleerde beschrijvingen van 3D uitlezen screening technieken zoals het bepalen van de proliferatie-index Ki67 kleuring's, apoptose van supernatanten door M30-ELISA en beoordeling van epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT), die handige tools zijn voor de evaluatie van de effectiviteit van therapeutische verbindingen. We konden aantonen in vergelijking met 2D-cultuur een vermindering van de proliferatie in onze 3D-tumor model dat related aan de klinische situatie. Ondanks deze lagere proliferatie, het model voorspelde EGFR -targeted drug reacties correct volgens de biomarker toestand zoals getoond door vergelijking van de long carcinoma cellijnen HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) en A549 (EGFR wildtype KRAS - gemuteerd) behandeld met de tyrosine-kinaseremmer (TKI) gefitinib. Drug reacties van geavanceerdere tumorcellen te onderzoeken, geïnduceerd we EMT door langdurige behandeling met TGF-beta-1 zoals vastgesteld met vimentine / pan-cytokeratine immunofluorescentie kleuring. Een stroom-bioreactor werd gebruikt om cultuur aan te passen aan fysiologische omstandigheden, waardoor weefsel generatie verbeterd. Verder laten we zien de integratie van de drug reacties op gefitinib behandeling of TGF-beta-1 stimulatie - apoptose, proliferatie-index en EMT - in een Booleaanse in silico model. Daarnaast leggen we uit hoe drug reacties van tumorcellen met een specifieke mutatie achtergrond en tellenerstrategies tegen weerstand kan worden voorspeld. We zijn ervan overtuigd dat onze 3D in vitro aanpak vooral met haar in silico uitbreiding biedt een toegevoegde waarde voor preklinische testen van geneesmiddelen in meer realistische omstandigheden dan in 2D celkweek.

Inleiding

De farmaceutische industrie wordt geconfronteerd met hoge verloop van maximaal 95% op het gebied van de behandeling van kanker in de klinische fase veroorzaakt enorme kosten 1-5. Een reden hiervoor tekort dat momenteel werkzaamheid van potentiële nieuwe verbindingen worden geëvalueerd in grootschalige screenings 2D celculturen van kanker cellijnen of diermodellen. Dierlijke modellen hebben een hogere complexiteit, maar er zijn cruciale verschillen tussen muizen en mannen 6,7. In de afgelopen tien jaar hebben 3D-modellen van kanker met behulp van verschillende benaderingen gegenereerd om de kloof tussen 2D cultuur van kanker cellijnen en een complex in vivo tumor 6,8,9 overbruggen. Het effect van 3D omgeving op celdifferentiatie en ook signalering is aangetoond in verschillende studies jaren geleden (bv. Door Mina Bissell) 10,11. Tegenwoordig hebben veel 3D celcultuur modellen zijn beschikbaar, zoals spheroïde culturen, hydrogels of microfluïdische chips 12-16. Hoewel these modellen verbeteren complexiteit in vergelijking met conventionele 2D kweeksystemen, ze meestal niet over een tissue micro waarvan bekend is dat tumor-ondersteunende effecten en ook effecten werkzaamheid van het geneesmiddel te hebben.

Om dit probleem genereerden wij een 3D tumormodel gebaseerd op biologische scaffold genaamd SISmuc (small-darm-mucosa submucosa +) die is afgeleid van een van cellen ontdane varkens jejunum. Bijgevolg de weefselarchitectuur en belangrijke bestanddelen van de ECM zoals verschillende collagenen en de basale membraan structuur behouden 17. Deze unieke eigenschap is essentieel voor tumormodel generatie carcinomen die ontstaan ​​uit epithelia en omvatten ongeveer 80% vaste tumoren. Verder wordt de proliferatiesnelheid in onze weefselengineering tumormodel verlaagd in vergelijking met de kunstmatig hoge bereikt 2D cultuur. De proliferatie is een belangrijke parameter bij het beoordelen van werkzaamheid van het geneesmiddel wordt testende ingeschakeld in ons model meer vergelijkbaarvoorwaarden in vivo tumoren 17.

Om het potentieel van ons model biomarker-afhankelijke drugdoeltreffendheid correct, wij hier presenteren gegevens voor twee verschillende longkanker cellijnen die verschillen in hun EGFR -biomarker toestand voorspellen evalueren. Deze mutatiestatus is begonnen met het routinematig worden bepaald NSCLC patiënten. Gerichte behandelingen met TKI's, zoals de EGFR -inhibitor gefitinib tegen tumoren dragende een activerende EGFR-mutatie vertonen superieure resultaten in vergelijking met mensen met een platina gebaseerde chemotherapie 18-21.

Wij vestigden enkele uitlezing technieken die relevant zijn voor de beoordeling van samengestelde werkzaamheid. Verder na TGF-beta-1 stimulatie kunnen we verbinding acties op tumorcellen die het EMT proces, waarvan men denkt dat een belangrijke stap bij maligne transformatie 22,23 en die verbonden is met geneesmiddel begonnen onderzoeken resistance 24.

De 3D-tumor model mogelijk toezicht op cel-specifieke reacties op gerichte behandelingen, chemotherapie, of combinaties van geneesmiddelen met een goede contrasten. Om verder te verbeteren en te versnellen drug-screening en de weerstand stuiten, wordt dit aangevuld met een in silico simulatie. Op basis van een aantal experimenten, kan de tumor respons worden voorspeld in silico met betrekking tot de uitkomst van een volledig assortiment van drugs en ​​combinaties daarvan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Tweedimensionale (2D) Celcultuur

  1. In de handel te verkrijgen tumorcellijn HCC827 (DSMZ). Cultuur de long adenocarcinoom cellijn HCC827 (EGFR gemuteerd KRAS wild-type) in RPMI-1640 aangevuld met 20% FCS. Veranderen medium elke 2 - 3 dagen. Splits de cellen twee keer per week. De cellen worden gebruikt tot passage 20 is bereikt.
  2. In de handel te verkrijgen tumorcellijn A549 (DSMZ). De cultuur longcarcinoom cellijn A549 (EGFR wildtype KRAS gemuteerde) in RPMI-1640 aangevuld met 10% FCS. Voer de kweek zoals hierboven vermeld. De cellen worden gebruikt tot passage 20 is bereikt.
  3. Test de cellen regelmatig (elke 4-6 weken) voor verontreinigingen zoals mycoplasma verontreinigingen.
  4. Het kweken van A549 of HCC827 cellen op dekglaasjes
    1. Plaats 1 steriele glazen dekglaasje in elk putje van een 24-wells plaat met behulp van een pincet.
    2. Zaad 50.000 tumorcellen van beide cellijnen in een volume van 500 ul in de putjesde dekglaasjes, respectievelijk.
    3. De cellen te kweken totdat ze een confluentie van 70% onder standaard kweekcondities (37 ° C, 5% CO2). Gedurende deze tijd, zuig het oude medium met behulp van een Pasteur pipet en voeg 500 ul vers medium elke 2-3 dagen kweken.

2. Genereren van Tumor Test Systems op een biologische Collagen Scaffold

  1. Statische kweekomstandigheden
    1. Het genereren van cellen ontdane kleine darm-submucosa + mucosa (SISmuc) en plaats deze tussen twee metalen ringen, de zogenaamde cel kronen, zoals beschreven in een eerdere publicatie 25.
    2. Zaad 100.000 cellen van ofwel HCC827 of A549 cellen in een totaal volume van 500 pl op de zijkant van de voormalige lumen van de cel in kronen vaste darm.
    3. Sta tumorcellen te hechten gedurende 2 uur bij 37 ° C, 5% CO2. Voeg 1 ml medium in de cel kroon en 1 ml buiten.
    4. Cultuur van de tumormodel onder statische condities bij 37 ° C, 5% CO2 in de incubator gedurende 14 dagen. Verander kweekmedium elke 2-3 dagen. Daarom zuig het medium met behulp van een Pasteur pipet en pipet 1 ml vers RPMI met de juiste hoeveelheid FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) binnen de cel kroon en 1,5 ml van hetzelfde medium buiten.
  2. Dynamic kweekomstandigheden
    1. Het opzetten van de tumor testsysteem met de cellen ontdane matrix in de cel kronen en cel zaaien, zoals beschreven in onderafdeling 2.1.1 tot 2.1.3.
    2. De cultuur tumormodel in statische toestand 37 ° C, 5% CO2 in de incubator gedurende 3 dagen.
    3. Monteer de geautoclaveerde bioreactor en steek de zaadjes SISmuc zoals eerder 25 gepubliceerd.
    4. Pipetteer 45 ml RPMI met de juiste hoeveelheid FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) in de kolf en sluit de naaldvrije bemonsteringsinrichting het buissysteem tussen de bioreactor en demedium kolf.
    5. Plaats de bioreactor in de incubator, aansluiten op de pomp en de cultuur tumormodel bijkomende 14 dagen met een constante mediumstroom (3 ml / min) bij 37 ° C, 5% CO2.
    6. Verander het gehele kweekmedium na 7 dagen. Daarvoor zet de bioreactor uit de incubator onder een laminaire stroming kap. Zuig het medium in de media kolf met een Pasteur pipet. Til de bioreactor tijdens het opzuigen om zich te ontdoen van het medium in de slang-systeem. Pipette 45 ml vers medium in de kolf. Plaats de bioreactor terug in de incubator en sluit deze aan de pomp.

3. Behandeling van de statische Tumor Model met Gefitinib

  1. De cultuur van de tumor model zoals beschreven in paragraaf 2.1.
  2. Op dag 11 van de cultuur, voor te bereiden RPMI / FCS met 1 uM gefitinib (2,5 ml voor elke cel kroon). Zuig het oude medium uit de putjes met behulp van een Pasteur pipet en voeg 1 ml van de bereide RPMI / FCS / gefitinib in tHij cel kroon en 1,5 ml van hetzelfde medium buiten.
    Opmerking: Het ontdooide gefitinib voorraadoplossing kan gedurende één week bewaard bij 4 ° C.
  3. Verander het medium op dag 13 zoals beschreven in paragraaf 3.2.

4. Stimulatie van de statische tumormodel met TGF-beta-1 voor EMT inductie

  1. De cultuur van de tumor model zoals beschreven in paragraaf 2.1.
  2. Op dag 3 van de cultuur, voor te bereiden RPMI / FCS met 2 ng / ml TGF-beta-1 met carrier (2,5 ml voor elke cel kroon). Zuig het oude medium uit de putjes met behulp van een Pasteur pipet en voeg 1 ml van de bereide RPMI / FCS / TGF-beta-1 in de cel kroon en 1,5 ml van hetzelfde medium buiten. Wijziging medium aangevuld met TGF-beta-1 elke 2-3 dagen tot 14 dagen, zoals beschreven onder 4.2.

5. Lees-outs

  1. Het nemen van monsters voor ELISA Metingen
    1. Neem monsters van de supernatanten van statische (paragraaf 2.1) en dynamische (paragraaf 2.2) cultuur tijdensbehandeling met gefitinib (deel 3) op dag 11-14 van de cultuur, zoals aangegeven in figuur 2. Bovendien, neem een monster voorafgaand aan de behandeling (T0).
    2. Onder statische kweekomstandigheden, neem 100 pi monster van de binnenkant van de cel kroon. Onder dynamische kweekomstandigheden, schroef de injectiespuit op het bemonsteringsapparaat en neem 1 ml medium uit de bioreactor systeem. Bewaar alle verzamelde supernatanten bij -80 ° C totdat de ELISA wordt uitgevoerd.
  2. M30-ELISA voor apoptose kwantificering
    1. De apoptose kwantificeren de supernatanten voeren celdood bepaling volgens instructies van de fabrikant. Laat alle reagentia om RT te bereiken voordat het uitvoeren van de test.
    2. Vortex alle reagentia. Los de wassen tablet in 500 ml vers gedemineraliseerd water. Verdun HRP Conjugate met 9,2 ml conjugaat Dilution Buffer en meng. Pipet 25 ul van standaard of monster per putje.
    3. Voeg 75 ul van de verdunde HRP Conjugate oplossing per well. Bedek de plaat en incubeer het op een schudder gedurende 4 uur bij KT. Was de plaat met de hand, 5 keer met 250 ul van bereide wasoplossing.
    4. Voeg 200 ul van 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substraat aan elk putje. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 20 min. Voeg 50 gl stopoplossing aan elk putje. Schud de microplaat gedurende 10 seconden en laat de microplaat gedurende 5 min voor het lezen van de absorptie. Bepaal de absorptie bij 450 nm in een microplaat reader. Bereken de standaardcurve en de concentraties in de monsters met een geschikt programma voor het verwerken ELISA gegevenstype zoals oorsprong.
  3. sample kleuring
    1. Fixing, Paraffine-inbedding en afdeling Voorbereiding van het 3D-model
      1. Bevestig de gezaaide SISmuc met behulp van 2,5 ml 4% paraformaldehyde (PFA) per cel kroon voor 2 uur en insluiten in paraffine
      2. Bereid 3 urn weefselcoupes voor kleuring als eerder gepubliceerd25.
    2. Tot vaststelling van de cellen gekweekt in 2D kweekomstandigheden
      1. Bij 70% confluentie is bereikt, wassen cellen gekweekt op dekglaasjes in 24-well plaat eenmaal met PBS en monteren met 500 pi 4% PFA / putje gedurende 10 min.
      2. Verwijderen PFA en bewaar de dekglaasjes in de put plaat bekleed met PBS bij 4 ° C tot kleuring uitgevoerd.
    3. H & E kleuring
      1. Vlekken de gerehydrateerde secties met hematoxyline / eosine kleuring als overzicht volgens standaardprotocollen.
    4. Immunofluorescentiekleuring van het 3D model
      1. Voor immunofluorescentiekleuring, het uitvoeren van een antigen herstel door het plaatsen van de gedeparaffineerde en gerehydrateerd dia's in een stoomkoker met voorverwarmde citraatbuffer (pH 6,0) gedurende 20 min.
        OPMERKING: Zie tabel van materiaal en apparatuur voor het bereiden van citraatbuffer.
      2. Breng de slidesde wasbuffer (0,5 M PBS buffer + 0,5% Tween), cirkel secties met een PAP pen om het vereiste volume voor kleuringsoplossingen minimaliseren en doe de objectglaasjes in een vochtkamer.
      3. Blok weefselsecties met 5% serum van de gastheer species van de secundaire antilichamen die in paragraaf 5.3.4.6 gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
      4. Verwijderen blokkerende serum door voorzichtig tikken op de dia een tissue en breng het primaire antilichaam aan het omcirkelde gedeelten in een verdunning volgens instructies van de fabrikant (konijn anti Ki67 1: 100, konijnen anti vimentine 1: 100, muis anti pan-cytokeratine 1 : 100). Incubeer O / N bij 4 ° C. Voor double-kleuring, moet primaire antilichamen van verschillende gastheersoorten worden gebruikt.
      5. Was voorzichtig van gebonden antilichaam met wasbuffer driemaal gedurende 5 minuten.
      6. Voor detectie van antigeen-antilichaam bindingen toepassen secundaire antilichamen in de verdunning 1: 400 op afdelingen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
      7. Afwassen UNBound antilichaam met wasbuffer driemaal gedurende 5 minuten.
      8. Monteer de dia's met een waterig medium met DAPI om kernen tegenkleuring en laat ze drogen O / N.
    5. Immunofluorescentiekleuring van 2D-gekweekte cellen
      1. Verwijder PBS en hebben betrekking op de gezaaid glazen dekglaasjes met 0,2% Triton-X100 in PBS gedurende 5 minuten voor permeabilisatie. Het glazen dekglaasjes met wasbuffer (0,5 M PBS buffer + 0,5% Tween) gedurende 5 min.
      2. Voer stap 5.3.4.3 naar 5.3.4.7. Voeren alle stappen in de goed-plaat op een schommelende platform en verwijder de reagentia door het omkeren van de plaat.
      3. Voor montage, ter plaatse een druppel waterig medium met DAPI om kernen tegenkleuring op een ongecoat glasplaatje en de overdracht van de dekglas om het met de cellen naar de montage medium met behulp van een tang. Laat ze drogen voordat beeldvorming.
  4. Bepaling van de proliferatie-index
    1. Voer immunofluorescentiekleuring tegen Ki67 volgens paragraaf 5.3.4. of 5.3 5.
    2. Neem fluorescerende beelden van de weefselcoupes of 2D-gekweekte cellen met een omgekeerde microscoop. Gebruik verschillende filters voor het nemen van beelden van DAPI kleuringen en Ki67 kleuringen. Voor de kwantificering, gebruiken 10 afbeeldingen van 3D-secties of 5 beelden van de 2D-culturen (vergroting 20X) van elke conditie van niet-overlappende delen van het monster.
    3. Bepaal aantal kernen en het aantal kernen positief voor Ki67 in 2D
      1. Count Ki67 positieve kernen handmatig met de plugin cel teller van de software Fiji 26. Daarom opent u de afbeelding en klik op "Plugins" → "Analyseer" → "Cell Counter". Druk op "initialiseren" en selecteer een teller type. Klik op elk Ki67 positieve kern. Het aantal klikken wordt weergegeven naast de geselecteerde teller type.
      2. Voor automatische celtellingen van het totale aantal kernen maken een macro behulp Fiji 27,28. adjust de macro voor elke kleuring en cellijn. Naar aanleiding van, zie je een voorbeeld hoe je een macro te maken.
        1. Start macro-recorder. Open een DAPI-imago en te converteren naar 8 bit formaat door te klikken op "Beeld" → "Type" → "8-bit". Klik op "Verhoogde contrast", stelt 'verzadigd' als "1" en "normaliseren".
        2. Stel "Onscherp masker" om het beeld scherper te maken. Met een "straal" van "1" en een "masker" of "0,60". Klik op "Auto drempel", kies methode "RenyiEntropy" met "witte objecten op een zwarte achtergrond 'om het beeld binarise.
        3. Klik op "Plugins" → "BioVoxxel" → "waterscheiding onregelmatige features" met een erosie straal van "5" naar de cellen te scheiden. Klik op "Analyze" → "Analyseer Deeltjes" en stel de 'size' naar "0,02-Infinity".
          NB: Het aantal deeltjes / cellenweergegeven in de overzichtstabel als tellingen.
        4. Klik op "Create" om macro sparen voor de analyse van verdere beelden.
    4. Bepaal aantal kernen en het aantal kernen positief voor Ki67 in 3D handmatig zoals beschreven in paragraaf 5.4.3.1.
    5. Bereken de gemiddelde proliferatie-index (PI) volgens de volgende formule:
      figure-protocol-1
      n = aantal beelden (3D: 10, 2D: 5)

6. In Silico Tumor Model Generation en Simulatie van Anti-EGFR therapie in HCC827 Cells

  1. Network Generation met behulp van een Network Analysis Software
    1. Gebruik verschillende bekende databases om de tumor netwerk te genereren op basis van de belangrijke experimentele uitlezing parameters en de mutatie achtergrond van de HCC827 cellijn.
    2. Open het netwerk analyse software 21 naar de te visualiserennetwerk.
      1. Klik op "Bestand" → "Nieuw" → soort 'JoVE_tumor modellen' → klik op "OK" om een ​​nieuw netwerk te genereren. Klik op "Vierkante Close-up Noorden" → "OK" om de receptor te visualiseren in een dubbel membraan. Klik op 'Generic Protein "om nodes (= eiwitten) als rechthoeken → type" EGFR "→ klik op" OK "te visualiseren; Herhaal deze procedure voor elk knooppunt in het netwerk.
      2. Label de knooppunten in het netwerk: Klik met de rechtermuisknop → "Change Color & Shape ..." → selecteren voor nodes EGFR en (EGF-EGFR) kleurcode "255,0,0" (kleur rood); voor nodes c-MET en (c-MET) kleurcode "0,255,0" (kleur groen); voor gefitinib kleurcode "255,255,0" (kleur geel); voor PI3K-Inh kleurcode "204.204.204" (lichtgrijs); voor MEK-Inh kleurcode "102.102.102" (kleur donkergrijs); voor alle andere knooppunten in het netwerk select kleurcode4, 255.255.255 "(kleur wit).
      3. Klik op "fenotype" te lezen-out parameters als zeshoeken → soort 'wildgroei' visualiseren → klik op "OK" → Klik met de rechtermuisknop → "Change Color & Shape ..." → selecteer kleurcode "255.204.204" (kleur zalm); Herhaal dit voor parameter apoptose → selecteer kleurcode "255,51,204" (kleur violet).
      4. Visualiseer Edges (= interacties): Klik op "State Transition" voor activeringen (pijlen), Klik op "Remming" voor remmingen (afgestompte pijlen); Herhaal dit voor elke interactie in het netwerk.
    3. Klik op "Bestand" → "opslaan als ..." → soort 'JoVE_tumor models.xml' → klik op "Save" om de gegenereerde signalering netwerk op te slaan als XML-formaat.
  2. In Silico simulatie met behulp van PLOEG
    LET OP: DE PLOEG vertegenwoordigt the netwerktopologie als een discrete logische Boolean-systeem (AND, OR, NOT) en voert een steady state analyse. De steady state analyse geeft het systeem evenwicht en de verantwoordelijkheid op signalering stimuli (bijv., Drug Application of mutatie).
    1. Open PLOEG 17 software, klik op "Load Netwerk" → upload 'JoVE_tumor models.xml' file. Klik op "Run-analyse":
      LET OP: Next, PLOEG geldt exponentiële functie in de Booleaanse netwerkconnectiviteit, die dynamische simulatie van het netwerk gedrag na verloop van tijd (gekleurde sigmoid activiteit curves) maakt interpoleren.
    2. Klik op "Geavanceerd" → "verstoorder" een simulatie protocol te schrijven. Simuleren anti- EGFR weerstand: Klik op "Protocol Edit"
      1. Klik op "verstoring" → gebruiken standaard "initialstate = SS-4" (steady state 4) → Klik op "Add" om "nieuwe Constant Pulse 'toe te voegen → Select parameter "state" → Select target "FLIP" → Selecteer tijd "0" → Selecteer de waarde "0.4" → Klik op "OK".
      2. Herhaal dit: Klik op "Add" → Select parameter "state" → Select target "c-MET" → Selecteer tijd "0" → Selecteer de waarde "0.4" → Klik op "OK"; Klik op → Select parameter "state" → Select target "gefitinib" "Add" → Selecteer tijd "0" → Selecteer de waarde "1" → Klik op "OK".
      3. Stel een state waarde actief knooppunt (EGF-EGFR): Klik op "activenode" → Klik op "Edit" → Select state "0.8" → Klik op "OK"; voor alle andere knooppunten: Klik op "Edit" → Selecteer staat "0" → Klik op "OK". Klik op "OK" om het protocol op te slaan.
      4. Specifieke curves: Ga naar het paneel "Options" → Selecteer "(EGF-EGFR)", "* (EGF-EGFR)", "* MEK", "caspasen", "(c-MET)", "PI3K", "gefitinib", "apoptose", "proliferatie", "MEK-Inh" en "PI3K-Inh" voor grafische weergave. Klik op "initialiseren" → "Run" om een ​​volledige simulatie van de reactie van het systeem op te starten. Klik op "Reset" om een ​​nieuwe simulatie te starten.
    3. Simuleren gecombineerd PI3K en MEK-inhibitor behandeling: Klik op "Protocol Edit"
      1. Gebruik hetzelfde knooppunt parameter zoals beschreven onder 6.2.2.1 - 6.2.2.3. Klik op "verstoring" → Klik op "Add" om "nieuwe Constant Pulse '→ Select parameter" state "→ Select target" PI3K-Inh "→ Selecteer tijd" 0 "→ Selecteer de waarde" 1 "→ Klik op" OK "toe te voegen; Klik op "Add"naar 'nieuwe Constant Pulse' → Select parameter "state" → Select target "MEK-Inh" add → Selecteer tijd "0" → Selecteer de waarde "1" → Klik op "OK".
      2. Klik op "OK" om het protocol op te slaan. Ga naar het paneel 'Opties': Gebruik dezelfde knooppunten voor grafische weergave zoals beschreven onder 6.2.2.4. Klik op "initialiseren" → "Run" om een ​​volledige simulatie van de reactie van het systeem op te starten. Klik op "Reset" om de simulatie te beëindigen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Op basis van de SISmuc steiger (Figuur 2A-C), hebben we een gestandaardiseerd werkprotocol voor het genereren, stimuleren en behandeling van een tumor 3D testsysteem (figuur 2D). Dit model maakt het bepalen van de proliferatie-index en de kwantificering van apoptose via M30-ELISA zoals in Figuur 1 en Figuur 3, respectievelijk. Figuur 3 toont representatieve H & E kleuring van A549 en HCC827 modellen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We hebben vastgesteld een gecombineerde in vitro / in silico tumor testsysteem voor biomarker geleide behandeling voorspellingen. De in vitro model evalueert verschillende belangrijke aspecten van verbinding maatregelen zoals veranderingen van proliferatie en apoptose van tumorcellen op een specifieke mutatie achtergrond die ook kan worden gesimuleerd in silico 17. Hier presenteren we het gestandaardiseerd protocol voor 3D-tumor model generatie en verbinding testen met kwantificerin...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gesponsord door het Centrum voor Interdisciplinair Clinical Research (IZKF, subsidie ​​BD247) van het Universitair Ziekenhuis van Würzburg en de Bayern Fit-programma (toegekend aan Heike Walles).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BioreactorsChair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER)Bioreactor setup
BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji)Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox
Cell crownsChair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER)voor statische 3D-cultuur
CellDesignerhttp://www.celldesigner.org/-Deze software werd gebruikt voor het tekenen van het netwerk.
Citrate buffer stock solution (10x)in house productie42 g/L Citroenzuurmonohydraat, 17,6 g/L Natriumhydroxide pellets in gedeïoniseerd water, pH 6,0, bewaard bij RT. 
Citrate buffer werkoplossingin house productie10% Citraat buffer stock oplossing in gedemineraliseerd water, bewaard bij RT.
CitroenzuurmonohydraatVWR, Darmstadt (GER)1002441000gebruikt voor de citraat buffer
DekglasjesVWR, Darmstadt (GER)631-1339
DAPI Fluoromount-GTMSouthernBiotech, Birmingham (USA)SBA-0100-20
Databases zoals KEGG, HPRD en QIAGEN (Genes & Pathways)http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/-Verschillende bekende literatuurdatabases werden gebruikt voor het genereren van de netwerktopologie.
Female Luer Lug Style TeeMednet, Münster (GER)FTLT-1Bioreactor setup
Female Luer Thread Style met 5/16" Hex naar 1/4-28 UNF ThreadMednet, Münster (GER)SFTLL-J1A Bioreactor setup
Fetaal Calf SerumBio&SELL, Feucht (GER)FCS.ADD.0500niet hitte-geïnactiveerd
GefitinibAbsource Diagnostics GmbH, München (GER)S1025-100 mg100 mM stock oplossing met DMSO
Glaskolf (Schott, GER) voorzien van glas slangverbindingWeckert, Kitzingen (GER)op maat gemaakt
Histofix 4% (Paraformaldehyd)Carl Roth, Karlsruhe (GER)P087.1
SlangkoppelingMednet, Münster (GER)CC-9Bioreactor setup
Incubator voor bioreactorenChair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER)Bioreactor setup
M30 CytoDeathTM ELISAPeviva, Bromma (SWE)10900
Male Luer Integral Lock RingMednet, Münster (GER)MTLL230-J1ABioreactor setup
Vochthoogte kamerop maat gemaakt
Muis anti Pan-CytokeratineSigma-Aldrich, Munich (GER)  C2562-2MLClone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3 +M20+A53-B/A2, gebruikt 1/100 voor immunofluorescentie
Naaldvrij Veegbaar Ventiel Female LuerMednet, Münster (GER)NVFMLLPCBioreactor setup, voor bemonstering, gamma-gesteriliseerd
O-Ring MVQ 10 rood 37 x 3 mmArcus Dichtelemente, Seevetal (GER)21444O-ring groot, Bioreactor setup
O-Ring MVQ 70 rood 27 x 2,5 mmArcus Dichtelemente, Seevetal (GER)19170O-ring klein, Bioreactor setup
PAP penDako, Hamburg (GER)S002
ParaffineCarl Roth, Karlsruhe (GER)6642.6
Peristaltische pompIsmatec, Wertheim-Mondfeld (GER)Bioreactor setup
Fosfaat Buffered SalineSigma-Aldrich, Munich (GER)  D8537-6x500ml
Pomp slang cassetteIsmatec, Wertheim (GER)IS 3710Bioreactor setup
Konijn anti Ki67Abcam, Cambridge (UK)ab16667Clone SP6, gebruikt voor 1/100 voor IF
Konijn anti VimentinAbcam, Cambridge (UK)ab92547gebruikt 1/100 voor IF
RPMI-1640 mediumLife technologies, Darmstadt (GER)61870-044warm in 37 °C waterbad voor gebruik
Siliconen slangCarl Roth GmbH, Karlsruhe (GER)HC66.1Bioreactor setup
NatriumhydroxideSigma-Aldrich, München (GER)30620-1KG-Rgebruikt voor de citraat buffer
SQUADhttp://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm-Deze software werd gebruikt voor het uitvoeren van de semikwantitatieve simulaties.
Steriele luchtfilter, poriegrootte 0,2 µmSartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER)16596-HYKBioreactor setup
Sering Luer Lok 5 mlBD Biosciences, Heidelberg (GER)309649voor bioreactor bemonstering
Weefselcultuur testplaten: 6-,     12-, 24-, 96- welTPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER)92006, 92012, 92024, 92048 
Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) met dragerCell Signaling, Frankfurt (GER)8915LCstock oplossing in steriele citraat buffer pH 3,0
Triton X-100Sigma-Aldrich, München (GER)X100-1L
Tween-20Sigma-Aldrich, München (GER)P7949-500mlvoor wasbuffer van immunofluorescente kleuring

Referenties

  1. Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29(2012).
  2. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
  3. Arrowsmith, J. Trial watch: Phase II failures: 2008-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 328-329 (2011).
  4. Arrowsmith, J. Trial watch: phase III and submission failures: 2007-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 87(2011).
  5. Arrowsmith, J., Miller, P. Trial watch: phase II and phase III attrition rates 2011-2012. Nat Rev Drug Discov. 12, 569(2013).
  6. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  7. Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
  8. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 485-489 (2013).
  9. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 675-680 (2013).
  10. Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30, 247-255 (2003).
  11. Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
  12. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16, 5517-5527 (2015).
  13. Kim, J., Tanner, K. Recapitulating the Tumor Ecosystem Along the Metastatic Cascade Using 3D Culture Models. Front Oncol. 5, 170(2015).
  14. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92(2015).
  15. Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Sci Transl Med. 7, 283ps9(2015).
  16. Stadler, M., et al. Increased complexity in carcinomas: Analyzing and modeling the interaction of human cancer cells with their microenvironment. Semin Cancer Biol. , (2015).
  17. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 8, 351-365 (2014).
  18. Mok, T. S., et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 361, 947-957 (2009).
  19. Maemondo, M., et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 362, 2380-2388 (2010).
  20. Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 13, 239-246 (2012).
  21. Sequist, L. V., et al. Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations. J Clin Oncol. 31, 3327-3334 (2013).
  22. Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
  23. Wells, A., Yates, C., Shepard, C. R. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 25, 621-628 (2008).
  24. Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372, 1689-1699 (2015).
  25. Moll, C., et al. Tissue engineering of a human 3D in vitro tumor test system. J Vis Exp. , (2013).
  26. Funahashi, A., et al. CellDesigner 3.5: A Versatile Modeling Tool for Biochemical Networks. Proceedings of the IEEE. 96, 1254-1265 (2008).
  27. Auto Threshold(ImageJ)v.v1.15. , Source: http://fiji.sc/Auto_Threshold (2013).
  28. BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji). , Source: http://fiji.sc/BioVoxxel_Toolbox (2015).
  29. Buettner, R., Wolf, J., Thomas, R. K. Lessons learned from lung cancer genomics: the emerging concept of individualized diagnostics and treatment. J Clin Oncol. 31, 1858-1865 (2013).
  30. Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316, 1039-1043 (2007).
  31. Mukohara, T., et al. Differential effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal growth factor receptor mutations. J Natl Cancer Inst. 97, 1185-1194 (2005).
  32. Noro, R., et al. Gefitinib (IRESSA) sensitive lung cancer cell lines show phosphorylation of Akt without ligand stimulation. BMC Cancer. 6, 277(2006).
  33. Gill, B. J., et al. A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model. Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

3D longtumormodelvoorspelling van geneesmiddelresponsEGFR gemuteerde cellengefitinib behandelingKi67 proliferatie indexM30 ELISA apoptoseepitheliale mesenchymale transitieflow bioreactorcultuurbooleaans in silico model

Gerelateerde artikelen