Immunomagnetische Scheiding van Fat Depot-specifieke SCA1<sup&gt; hoog</sup&gt;-Vetcellen afgeleide stamcellen (ASC)

Samenvatting

We presenteren de technieken die nodig zijn om de stromale vasculaire fractie (SVF) te isoleren uit de inguinale (subcutane) en perigonale (viscerale) vetweefsel depots van muizen om hun genexpressie en collagenolytische activiteit te beoordelen. Deze methode omvat de verrijking van Sca1^high vet-afgeleide stamcellen (ASCs) met behulp van immunomagnetische celscheiding.

Samenvatting

De isolatie van vetweefsel-afgeleide stamcellen (ASC's) is een belangrijke methode op het gebied van de biologie van vetweefsel, adipogenese en remodellering van de extracellulaire matrix (ECM). In vivo, biedt een ECM-rijke omgeving, bestaande uit fibrillaire collagenen, een structurele ondersteuning voor vetweefsel tijdens de progressie en regressie van obesitas. Fysiologische ECM-remodellering, gemedieerd door matrix metalloproteïnasen (MMP's), speelt een belangrijke rol bij het reguleren van de grootte en functie van vetweefsel^1,2. Het verlies van fysiologische collagenolytische ECM-remodellering kan leiden tot overmatige collageenaccumulatie (weefselfibrose), macrofaag-infiltratie en uiteindelijk een verlies van metabolische homeostase, inclusief insulineresistentie^3,4. Wanneer een fenotypische verandering van het vetweefsel wordt waargenomen in gen-gerichte muismodellen, is het isoleren van primaire ASC's uit vetdepots voor in vitro studies een effectieve aanpak om de rol van het specifieke gen in het reguleren van de functie van ASC's te definiëren. Hieronder definiëren we een immunomagnetische scheiding van Sca1^high ASC's.

Inleiding

Stamcel antigeen 1 (SCA1 of Ly6A / E) werd voor het eerst geïdentificeerd als een celoppervlak marker door hematopoietische en mesenchymale stamcellen ^5,6 uitgedrukt. De stromale vasculaire fractie (SVF) van vetweefsel verkregen uit muizen vetdepots een heterogene populatie van cellen omvattende fibroblasten, macrofagen, vasculaire endotheelcellen, neuronale cellen, adipocyten en progenitorcellen ^7. Adipocyten voorlopercellen of adipeus afgeleide stamcellen (ASC) zijn niet lipide beladen cellen die in het collageen-rijke perivasculaire extracellulaire matrix (ECM) ⁸ bevinden. Ongeveer 50% van de SVF uit ASC, die worden gekenmerkt als lineage-negatieve (Lin ^-) en CD29 ^+: CD34 ^+: SCA1 ^{+ 9.} De meeste van deze cellen SCA1 ^+: CD24 ^- adipocyten stamcellen die in staat adipocytdifferentiatie in vitro; echter slechts een fractie van cellen (0,08% van SVF) vormt SCA1 ^{+: CD24 + cellen die volledig in staat prolifereren en differentiëren tot adipocyten bij de in vivo omstandigheden 9 zijn. Ondanks het potentieel nadeel van het gebruik SCA1 + SVF zonder discriminatie CD24 + cellen van CD24 - cellen isoleren SCA1 + ASC's uit vetdepots gebruik immunomagnetische celscheiding is een efficiënte en praktische benadering van de cel-autonome fenotype van primaire adipocyten progenitorcellen te bepalen.}

Op het gebied van obesitas en diabetes, weefsel fibrose en ontsteking spelen een cruciale rol in de ontwikkeling en instandhouding van type 2 diabetes ^3. Recentelijk Tokunaga et al. toonde aan dat SCA1 ^hoge cellen geïsoleerd uit de lies (of subcutane, SQ) en perigonadal (of viscerale, VIS) C57BL6 / J vet depots vertonen ander gen handtekeningen en ECM remodeling in vitro ^10. MMP14 (MT1-MMP), een prototypisch lid van de membraan-tYpe matrix metalloproteinase (MMP) familie bemiddelt de ontwikkeling van wit vetweefsel (WAT) via haar collagenolytische activiteit ^1.

Voorbeelden van experimenten die kan worden uitgevoerd met de cellen geïsoleerd en verrijkt door de volgende protocol omvatten drie-dimensionale cultuur, differentiatie studies, collageen degradatie assays, en RNA-sequencing ^10,11. Degradatie assays worden uitgevoerd met zuur geëxtraheerd collageen dienen om de telopeptide ^11,12 waarborgen. Het volgende protocol zal de methoden aantonen primaire vasculaire stromale cellen te isoleren uit verschillende vetdepots en verrijken adipocyten progenitorcellen via immunomagnetische celscheiding. De geldigheid van de cel sortering zal worden beoordeeld met flowcytometrie en door het gebruik van SCA1-GFP muizen die GFP in SCA1 ⁺ cellen uit te drukken, aangedreven door een SCA1 promotor ^13.

Protocol

Ethiek Verklaring: De Universiteit van Michigan Comité voor gebruik en onderhoud van Dieren (UCUCA) heeft alle methoden en protocollen in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren (Institute for Laboratory Animal Research, National Research Council) goedgekeurd. Muizen worden gehandhaafd in een universiteit van Michigan terrarium en krijgen gratis toegang tot voedsel en water en gehouden op een 12 uur donker / licht cyclus.

1. Voorbereidingen

1. Bereid primaire kweek medium met DMEM, 10% FBS, 1 x P / S / G en 1x antibiotica / antimycotica. Dit wordt gebruikt om weefsels vóór vertering houden. Plaats voorraad en hoeveelheid in 37 ° C waterbad.
2. Bereid vijf milliliter Type III collagenase oplossing bij 5 mg / ml opgelost in HBSS (+ Ca, Mg +) voor elk van vetkussentje afgezonderd, tot vijf muizen. Wanneer bijvoorbeeld het isoleren en SQ VIS uit één genotype, maakt 10 ml, wanneer wild-type en mutant SQ en VIS, maken 20 ml. De pH instellen op 7,4 en steRILE filter. Aliquot in 50 ml buizen. Zet opzij de buurt van licht.
3. Gebruik 70% ethanol om chirurgische veld te desinfecteren. Veeg naar beneden en dek af met een blauwe pad. Spuit wat ethanol op de blauwe pad.
4. Gebruik de 22 G naalden vast te pinnen een absorberende pad om de piepschuim bord en trim met een schaar. Spuit de pad met ethanol en stel het bord op de blauwe pad en dek af met een ander blauwe pad tot aan het begin van dissectie.
5. Vul twee 50 ml buisjes met ethanol en in een stand nabij het operatiegebied. Leg de schaar en pincet in de ethanol.
6. Vul een 50 ml buis met PBS plus 1 x anti-anti te spoelen ethanol uit chirurgische instrumenten.
7. In de kap, etiket 60 mm schalen voor elk weefseltype en vul met cultuurmedia verwarmd tot 37 ° C. Plaats de platen naast het operatiegebied.

2. Isolatie van subcutane (SQ) vetkussentjes

1. Euthanaseren muis met een overdosis van isofluraan en pneumothorax.
2. Voorzichtigspuiten muis met 70% ethanol en leg liggende. Speld de poten om het schuim bord met 22 G naalden.
3. Maak een kleine snede in de huid van de onderbuik. Die de top van de snede met de tang, neem de schaar en scheiden de huid van peritoneum.
4. Nadat de huid is gescheiden van het peritoneum van de buik om de thorax, weerspiegelen de huid van het peritoneum naar het hoofd door zijdelingse sneden in de huid aan de zijkant van het lichaam.
5. Afspiegeling van de resterende huid die de lies vet weg van het lichaam en het vastpinnen op het bord met 22 G naalden.
6. Overschakelen naar fijne schaar en pincet. Pak de lies vet pad met de tang aan de oorsprong in de buurt van het buikvlies en knip weg tussen de huid en lies vet op weg zijn naar de lies te vermijden besmetting van de SQ met de huid.
7. Plaats de insolated lies vet pad in de gelabelde 60 mm gerecht.

3. Isolatie van Visceral (VIS) vetkussentjes

1. Op soortgelijke wijze als stap 2,5, snijd het peritoneum open naar de viscerale vetkussentjes en darm bloot.
2. Beweeg de darm weg in de richting van de thorax.
3. Pak de VIS vet pad aan het uiteinde en voorzichtig omhoog te trekken. Ontleden de VIS vet pad terwijl ze voorzichtig om epididymis uit te sluiten (of de baarmoeder, bij gebruik van vrouwelijke muizen) weefsel.
4. Plaats in geëtiketteerde schaal en herhaal stap 3.3 voor de resterende VIS pad.

4. Collagenase vetvertering Pads

1. Verplaats 60 mm schalen in de weefselkweek kap en zuig af media.
2. Hak de vetkussentjes met gebogen schaar vervolgens toe te voegen aan collagenase oplossing. Zorg ervoor dat de schaar en pincet in spoel tussen weefseltypes met ethanol en PBS.
3. Schudden bij 300 rpm en 37 ° C gedurende 10-20 min tot weefsel verteerd. Het is aanvaardbaar als sommige stukken van SQ zijn nog steeds zichtbaar. Dit zal in een latere stap worden aangepakt.
4. Voeg 25 ml kweekmedia de collagenase oplossing voor het stoppen collagENase behandeling en pipet op en neer 10 keer met een 10 ml serologische pipet om de verteerde weefsels verspreiden.
5. Stam cellen onder toepassing van een 100 um zeef cel. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g.
6. decanteer voorzichtig van media niet de pellet te verstoren en voeg 5 ml steriel water om de pellet voorzichtig pipet cellen opschorten. Wacht 2 min aan erytrocyten te lyseren.
7. Voeg 25 ml medium met 10% FBS en stam cellen door een nieuw 100 um zeef cel.
8. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g. Giet media en resuspendeer pellet in 1 ml van de cultuur media.
9. Aantal cellen met een hemocytometer gebruikt 1: 1 trypan blue.
10. Plaat 1 x 10 ⁶ cellen in één putje op 6-wells plaat.

5. magnetische celscheiding

1. Na ongeveer 4-6 uur van celadhesie Spoel de cellen tweemaal met HBSS (-Ca, Mg). Distantiëren hechtende cellen met behulp 0,05% trypsine. Verdun trypsine cel suspensie in 1 ml scheiding buffer en draaien voor5 min bij 300 x g.
2. Zuig supernatant. Resuspendeer cellen in 500 pi buffer. Verwijderen van een 10 pi aliquot en cellen te tellen met een hemocytometer.
3. Spin cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g.
4. Zuig supernatant volledig. Resuspendeer cellen in 90 ul buffer. Voeg 10 ul anti-SCA1-FITC primair antilichaam. Meng goed en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 ° C in het donker.
5. Was de cellen met 1 ml buffer en centrifugeer cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g. Verwijder supernatant volledig.
6. Resuspendeer cellen in 80 ul buffer. Voeg 20 ul anti-FITC microbolletjes. Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C in het donker.
7. Was de cellen met 1 ml buffer en centrifugeer cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g.
8. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 500 ui buffer.
9. Plaats de kolom in de magnetische houder en spoel de kolom met 500 pi buffer.
10. Voeg celsuspensie naar kolom. Vermijd het bellen tijdens het pipetteren.
11. Verzamel de ongelabelde SCA1 ^{- <}/ Sup> cellen en waskolom 3 maal met 500 pi buffer. Alleen het toevoegen van nieuwe buffer als het reservoir leeg is. Vermijd het bellen tijdens het pipetteren.
12. Kolom verwijderen uit de magneethouder en plaats in een 15 ml conische buis.
13. Voeg 1 ml buffer kolom en elueer SCA1 ⁺ door op geleverde plunjer de kolom reservoir.
14. Spin down cel fracties gedurende 5 min bij 300 x g. Resuspendeer cellen in 1 ml kweekmedium.
15. Verwijderen 10 pi aliquot van het gemerkte en ongemerkte fracties en cellen te tellen met een hemocytometer.
16. Plate elke fractie cel in 1 put van een 6-wells plaat.

6. Keuring van Immunomagnetische Scheiding van SCA1 ^hoge ACSS met flowcytometrie

1. Spoel de cellen tweemaal met HBSS (-Ca, Mg) en dissociëren cellen onder toepassing 0,05% trypsine.
2. Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 min. Resuspendeer cellen in 1 ml kweekmedium en te tellen met een hemocytometer.
3. Verkrijgen van> 10 ⁶ cellen in 1 ml kweekmedium en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten.
4. Verwijder supernatant en herhaal stap 6.3 twee keer.
5. Resuspendeer cellen met 1 ml 2% geitenserum + 2% BSA en blokkeren gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
6. Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 min.
7. Verwijderen blokkeeroplossing.
8. of anti-SCA1 Alexa Fluor 647 (0,25 g, 1: 400): rat IgG2a Alexa Fluor 647 (400 0,25 g, 1) voeg, in 100 gl PBS met 2% geitenserum en 2% BSA + PBS bij 4 ° C gedurende 30 minuten in het donker.
9. Voeg 1 ml koude PBS aan cellen. Centrifuge 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
10. Verwijder supernatant en herhaal stap 6.9 twee keer.
11. Resuspendeer cellen in 1 ml PBS. Celsuspensies passeren door een 100 um zeef cel ter voorbereiding van flowcytometrische analyse.

Resultaten

Verrijking van SCA1 ^hoge ASC uit verschillende vetkussentjes.

De vasculaire stromale cellen geïsoleerd van SQ vet weergave fibroblast-achtige, uitgerekte cel vorm ongeacht SCA1 expressie (Figuur 1A). Aan de andere kant, VIS (eWAT-afgeleide) SCA1 ^hoog en SCA1 ^laag cellen aan te tonen duidelijk verschil in hun cel vorm. Net als SQ (iWAT-afgeleide) SCA1 ^hoge cellen, VIS...

Discussie

Hierin tonen we de isolatie en immunomagnetische celscheiding van murine ASC's uit verschillende vetkussentjes en hun gebruik voor in vitro experimenten. De onderhavige methode is effectief voor de snelle isolatie van talrijke SCA1-positieve ASC, hetgeen voordelig via technisch complexe en dure FACS gemedieerde isolatie van ASC ^9,14. Unlike FACS gaat immunomagnetische celscheiding niet het gebruik van meerdere antigeen voor de identificatie van een doelwit celpopulatie toelaten. Niettemin, als he...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Type 3 Collagenase	Worthington Biochemical	LS004182	Weefseldigestie
DMEM	Gibco	11965-092	Hoge-glucose kweekmedium
Pen/Strep/Glutamine (100x)	Gibco	10378-016	Media antibioticum
Anti-anti (100x)	Gibco	15240-062	Media antischimmelmiddel
FBS	Gibco	16000-044
PBS (1x, pH 7.4)	Gibco	10010-023
Trypsine (0,05%)	Gibco	25300-054
Cell strainer	BD Bioscience	352360	100-µm cell strainer
60 mm platen	BD Falcon	353004
Scharen	FST	14001-12	Groot
Scharen	FST	14091-11	Fijn, gebogen punt
Grote pincetten	FST	11000-12
Fijne pincetten	Elke verkoper
25G 5/8” naalden	BD	305122
22G 1,5” naalden	BD	305159
15 ml conische buizen	BD Falcon	352097
50 ml conische buizen	BD Falcon	352098
MACS-scheidingskolommen	Miltenyi Biotec	130-042-201
Anti-Sca1 microbead-kit (FITC)	Miltenyi Biotec	130-092-529	FITC-anti-Sca1 1ºAb en anti-FITC microbeads 2ºAb
AutoMACS-loopbuffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
MiniMACS-scheider	Miltenyi Biotec	130-042-102
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Blue chux-pads	Fisher	276-12424
Absorbtiepads	Fisher	19-165-621
Styrofoam-bord			Gebruik voor 50 ml buizen
70% ethanol
Isofluraan	Elke verkoper
Rat IgG2a Alexa Fluor 647	Invitrogen	R2a21
Rat IgG2a anti-muis Sca1 Alexa Fluor 647	Invitrogen	MSCA21
Rat IgG2a R-PE	Invitrogen	R2a04
Rat IgG2a anti-muis F4/80 R-PE	Invitrogen	MF48004
Rondbodembuis	BD Falcon	352058
HBSS (–Ca, –Mg)	Gibco	14175-095
HBSS (+Ca, +Mg)	Gibco	14025-092	Voor collagenase-oplossing
Type I collageen (2,7 mg/ml in 37mm azijnzuur	Bereid in huis12
10x MEM	Gibco	11430-030
1 M HEPES	Gibco	15630-080
0,34 N NaOH	Bereid in huis
Dekglasjes	Corning	2870-22
Alexa Fluor 594 carbonzuur, succinimidylester, gemengde isomeren	Invitrogen	A-20004
0,89 M NaHCO3	Gibco	25080-094