Huidige in vitro modellen voor het beoordelen contactlenzen (CL's) en andere eye toepassingen ernstig beperkt. De gepresenteerde oculaire platform simuleert fysiologische traanvocht, scheur volume, belichting lucht en mechanische slijtage. Dit systeem is zeer veelzijdig en kan worden toegepast op diverse in vitro analyses CL's.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Momenteel worden in vitro evaluaties van contactlenzen (CLs) voor geneesmiddelafgifte doorgaans uitgevoerd in flessen met een groot volume,1-6 die fysiologische traanvolumes niet nabootsen.7 Het traditionele model mist ook de natuurlijke traanstromingscomponent en de knipperreflex, beide zijn definiërende factoren van de oculaire omgeving. In deze studie wordt een nieuw model beschreven, dat bestaat uit een uniek 2-delig ontwerp, een oogbol en ooglid, dat in staat is fysiologisch traanvolume na te bootsen. De modellen worden gemaakt van 3D-geprinte mallen (Polytetrafluorethyleen of Teflon mallen), die kunnen worden gebruikt om oogmodellen te genereren uit verschillende polymeren, zoals polydimethylsiloxaan (PDMS) en agar. Verdere aanpassingen aan de oogstukken, zoals de integratie van een explantaat van een menselijke of dierlijke cornea of een menselijk corneaconstruct, zullen complexere in vitrooculaire studies mogelijk maken. Een commerciële microfluïdische spuitpomp is geïntegreerd met het platform om fysiologische traanafscheiding na te bootsen. Blootstelling aan lucht en mechanische slijtage worden bereikt met behulp van twee mechanische actuatoren, waarvan er een het ooglid lateraal beweegt en de andere het oogbolstuk cirkelvormig beweegt. Het model is gebruikt om CL's voor geneesmiddelafgifte en afzetting van traancomponenten op CL's te evalueren.
Inleiding
Twee belangrijke gebieden van belang in de contactlens (CL) arena onder meer ongemak en de ontwikkeling van nieuwe CL-toepassingen. Ophelderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan CL ongemak is een probleem dat het veld is ontgaan voor decennia. 8 De ontwikkeling van nieuwe, functionele CLS zoals drug-delivery-apparaten 1,3,9 en biosensoren, 10-12 is een gebied van groeiende belangstelling, met aanzienlijke potentiële markten. In beide gevallen zou een geavanceerde in vitro model relevante informatie om te helpen met de juiste lens materialen of ontwerpkenmerken selecteren tijdens de ontwikkelingsfase te verschaffen. Helaas, de huidige in vitro modellen voor het evalueren van de fundamentele arbeidsnormen en andere eye-gerelateerde toepassingen zijn relatief grof en ongenuanceerd. Traditioneel, in vitro CL studies ter evaluatie van tear film afzetting of drug delivery worden uitgevoerd in statische, groot volume flacons met een vast vloeistofvolume, die greaTLY overschrijdt fysiologische bedragen. Bovendien is deze eenvoudig model niet de natuurlijke traanvocht component en het knipperen reflex, welke beide factoren bepalen de oculaire omgeving.
De ontwikkeling van een geavanceerde, fysiologisch relevante oog "model" zal een multi-disciplinaire aanpak noodzakelijk en vereisen een aanzienlijke in vivo validatie. Daarom, het basiskader voor onze in vitro oogmodel is zeer veelzijdig, zodanig dat het model continu kan worden verbeterd door toekomstige upgrades en modulaties. Tot op heden is het model kunnen worden gesimuleerd traanvolume, traanvocht, mechanische slijtage en blootstelling lucht. Het doel is een in vitro model dat betekenisvolle resultaten leveren, die voorspellende en complementair aan in vivo en ex vivo waarnemingen maken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten werden in overeenstemming en de naleving van alle relevante richtlijnen geschetst door de Universiteit van Waterloo onderzoek dier ethische commissie afgerond. De runderen ogen zijn gedoneerd van een lokale slachthuis.
1. Eye Model
- Ontwerp en productie van matrijzen 13
- Het ontwerp van de eye-modellen op basis van de gemiddelde fysiologische dimensies van de menselijke volwassen ogen. 13
- Laat een opening van 250 pm tussen de oogbol en het ooglid stukken van het oog model. Het ontwerp van de respectieve mallen met behulp van computer-aided design (CAD) software.
- Maak een nieuwe .cad bestand of .sldprt bestand met AutoCAD of Solidworks. Maak 3D-modellen van de menselijke oogbol / ooglid. Maak mallen van de modellen en sla de mallen als .stl bestanden.
- .stl Importeren bestanden in 3D-printer software (bijv makeware voor replicator2). Geef parameters van de afdruk (locatie, sparseness, schaal, oriëntatie, gladheid, enz. ) 13.
- Sla het bestand op als G-code-bestand voor 3D-printers te lezen. Materiaalkeuze zoals PLA (polymelkzuur), ABS (acrylonitril butadieen styreen), PC (polycarbonaat), of een combinatie daarvan, aan de mallen 13 drukken.
- Installeer gewenste gloeidraad van het materiaal bij uitstek. Importeer de G-code bestand in de 3D-printer te lezen. Print de mal.
LET OP: Als alternatief produceren het oog mallen met behulp van een computer numeriek gestuurde (CNC) machine, als een gladder oppervlak op het oog model gewenst is. Voor CNC molding, zijn materialen voor matrijzen niet langer beperkt tot thermische kunststof, maar vergroten tot metaal, keramiek, en chemisch resistieve polymeren zoals polytetrafluorethyleen. - Open de CNC software-interface die is verbonden met een snij boor. Construct 3D vormen volgens voor-, boven-, zij- en perspectivische aanzichten van de eerder geconstrueerde oogbol / ooglid model matrijzen besturingssoftware interface. Selecteer de juiste parameters voor deverspanen (bit grootte, substraat materiaal, materiaaldikte) en ga naar de mal te snijden.
- Synthese van Oculairs gebruik van PDMS
- Met behulp van een injectiespuit, meet 10 ml volume van PDMS (polydimethylsiloxaan) basis en vul het in een 15-50 ml centrifugebuis. Voeg 10% w / v van de elastomeeroplossing van het totale gewicht van PDMS. Met behulp van een roerstaafje, meng de oplossingen ook.
- Giet het PDMS oplossing in de oogbol ooglid en schimmels. Laat de PDMS bezinken bij kamertemperatuur O / N (of ten minste 12 uur) om de polymerisatie te starten en om luchtbellen oplossen van het polymeer.
LET OP: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen meer in de PDMS die zouden kunnen stijgen of uit te breiden. - Vervolgens zet de mallen in een 75 ° C (167 ° F) oven gedurende 1 uur, of 150 ° C (302 ° F) gedurende 5 min. Voor een zachtere gel, laat het PDMS zitten bij kamertemperatuur gedurende ten minste 48 uur volledig te polymeriseren.
- Plaats de monsters in een vriezer om min; dit zal de PDMS krimpen en te vereenvoudigende verwijdering van de monsters uit de vorm. Pak de oculairs van de mallen met behulp van een dunne spatel.
- Voor de levering van de oplossing in de ruimte tussen de oogbol en het ooglid stukken, sluit u een 1/16 "x 1/8" polytetrafluorethyleen buis met een 1/16 "gelijk been koppeling buis connector en bevestig deze aan het ooglid stuk bij de slang gat .
- Synthese van Eyeball Piece Met behulp van Agarose
OPMERKING: De oogbol stuk kan worden gesynthetiseerd onder toepassing van andere polymeren zoals agarose. De volgende procedure kan ook worden aangepast om oculairs produceren van verschillende soorten agar, zoals PDA (aardappel dextrose agar) of SDA (Sabouraud dextrose agar).- Een 2% (2 g / 100 ml) gel, maatregel 2 g agarose te produceren en te mengen met 100 ml ultrazuiver water. Breng de oplossing aan de kook (100 ºC), zodat de agarose volledig oplost. Laat de oplossing afkoelen gedurende 5 minuten.
- Giet de oplossing in de oogbol vorm en laat de oplossing afkoelen 30 min bij kamertemperatuur. Verwijder de oogbol stukken met een spatel. Bewaar de oogbol agar in een -20 ° C vriezer voor later gebruik. Voor microbiologie studies, steriliseren de oogbol mallen in een autoclaaf en / of UV-straling.
- Opname van Bovine Cornea op PDMS Eyeball
LET OP:. Dit protocol werd aangepast van Parekh et al 14- Voer de dissectie en integratie van de runderen hoornvliezen in steriele omstandigheden onder een laminaire stroming kap. Verwerven van de ogen en ontleden ze op dezelfde dag.
- Draai de stroomkap gedurende 10 minuten voor gebruik en ontsmetten met 70% ethanol alcohol. Zorgen dat alle materialen en instrumenten steriel autoclaaf bij 273 ° F / 133 ° C gedurende 45 min, en gepositioneerd liefst 4 duim van de stroming kap ingang.
- Dompel runderen oog in een bekerglas met een verdunde povidon-joodoplossing gedurende 2 min. Spoel het oog in een bekerglas met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7.4. Met behulp van een tang plaats voorzichtig het oog op een glazen petrischaal, het hoornvlies naar boven.
- Verwijder de overtollige spier- en vetweefsel door te snijden in de sclerale bevestigingspunten met stomp uiteinde dissectie schaar. Gooi het overtollige weefsel in een aangewezen voor dierlijk afval steriele beker.
- Met behulp van micro-schaar, verwijder het bindvlies van het oog. Wikkel het oog met steriel gaas met een afstand van ten minste 1 cm van de limbus.
- Met behulp van een scalpel, incise de sclera ongeveer 2 mm van de limbus regio oppervlakkig teneinde penetratie van het onderliggende choroidea en glasachtig lichaam voorkomen. breiden zorgvuldig de incisie door 360 ° met een scalpel of dissectie schaar zonder vervorming van de cornea uit zijn natuurlijke kromming.
- Met fijne tang, verwijder het hoornvlies van het oog. Met behulp van een tang, verwijder voorzichtig elke hechtende uveal weefsel en spoel het hoornvlies met PBS.
- Bewaar het hoornvlies op 31ºC in een steriele container met cultuurmedium (zoals Medium 199) bevattende 3% foetaal runderserum aan weefselvocht en cellen voeding behouden.
- Voorafgaand aan het experimenteren, rusten de weggesneden hoornvlies op het PDMS oogbol, en klem de twee stukken samen met een gespecialiseerde clip-on.
2. Blink-platform
- Ontwerp en productie van de Blink-platform
NB: De blink-platform bestaat uit drie functionele delen: oog model (beschreven in hoofdstuk 1), versnelling systeem en elektronisch systeem.- Ontwerp en de fabricage van de Blink-platform met behulp van CAD-en 3D-printing, gelijk aan die beschreven voor het oog model (paragraaf 1.1). Het ontwerp van de versnelling systeem zodanig dat het zich vertaalt eenvoudige rotatie van de motoren in de laterale en roterende bewegingen van de oculairs. 15
- Via het rondsel en tandwielmechanisme vertalen rotatiebeweging van een stappenmotor in de laterale beweging van een rondsel, dat is verbonden met het ooglid stukken.
- De ... gebruikenconjugaat gear systeem, versterken een roterende beweging van een stepper motor in drie (of meer) roterende bewegingen voor drie verschillende oogbol stukken.
- Lijn de beide tandwielkasten, een voor het ooglid en een voor oogbol, zodat de afstand tussen de beide constant zijn. Monteer het elektronisch systeem met een microcontroller, motor schild, en twee motoren.
LET OP: Gebruik twee stappenmotoren om rotatie motoren, die door de versnelling wordt vertaald in een knipperende beweging te bieden. - Sluit de twee stappenmotoren met een systeem bestaande uit een motorschild gestapeld op de microcontroller. Aansluiten en configureren van de elektronische componenten om te werken met open source software producten.
- Programmeer het systeem om de motor parameters te besturen zoals omwentelingen per minuut (RPM), aantal ronden vooruit, aantal rondes achteruit, en het draaien van de stijl.
OPMERKING: Raadpleeg de aanvullende "Arduino code bestand" voor meer informatie. - Download de systeemsoftware van de mawebsite nufacturers '.
- Installeer de software en open het. Schrijf de code om stappenmotoren te controleren in de gewenste configuratie. Sluit het systeem met een bron naar het elektronische systeem van stroom zodat de motoren bewegen op de gewenste wijze zoals bepaald door de onderzoeker.
OPMERKING: Raadpleeg de aanvullende "Arduino code file".
- Montage met Microfluidics (Artificial Tear Solution)
- Neem de gesynthetiseerde oogbol en het ooglid stukken en zet ze op hun bijbehorende clip-ons voor het oog-model. Sluit de slang die is verbonden met een spuit en gepositioneerd op de microfluïdische pomp met het ooglid stuk (paragraaf 1.2.5). Proefdraaien het platform en controleren voor een consistente beweging.
- Prime de slangen en controleren of er een gestage stroom van kunstmatige tear-oplossing (ATS). Het recept voor ATS werd eerder gerapporteerd. 16
- Beweeg de oog-model onderdelen bij elkaar op een vlak vlak, zodat de oogbal en het oogdeksel in contact. Stel het debiet van de microfluïdische pomp gewenste waarden. Stel fysiologische debieten tot 1-1,5 pl / min. 17
- Start de pomp en de actuators experiment te beginnen. Voor drug delivery experimenten, plaatst het geneesmiddel bevattende contact lens op de oogbol stuk.
- Laat de doorstroming vloeistof te druppelen in een 12-wells plaat. Op het gewenste ingestelde tijd intervallen, kwantificeren van de te analyseren of geneesmiddelconcentratie het gebruik van gemeenschappelijke detectiemethoden zoals UV-Vis spectroscopie of fluorescentie. 1,4,18
- Voor studies ter evaluatie van de afzetting van de scheur componenten op contactlenzen, plaatst u de contactlens op de "oogbol" stuk. Verzamel het doorstroomkanaal vloeistof, die kan worden weggegooid.
- Nadat de gewenste tijdsintervallen, verwijder de contactlens uit de oogbol stuk en de voorbereiding van de lens voor verdere analyse, zoals confocale microscopie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De gesynthetiseerde oog mallen verkregen uit de werkplaats en van 3-D afdrukken worden weergegeven in figuur 1. Deze vormen kunnen worden gebruikt met een verscheidenheid aan polymeren zoals PDMS en agarose, voor oogglazen met de gewenste eigenschappen te produceren. Wees de assemblage van het oogmodel platform met een microfluïde spuitpomp wordt weergegeven in figuur 2. Het platform simuleert mechanische slijtage via de rotatie van de oogbol stuk en blo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn drie cruciale stappen in het protocol die speciale aandacht nodig hebben: ontwerp en productie van matrijzen (paragraaf 1.1), platform assemblage (paragraaf 2.2.1-2.2.3), en het toezicht op de experimentele run (paragraaf 2.2.4-2.2.7 ). In termen van het ontwerp en de productie van matrijzen (paragraaf 1.1), moet de oogbol stuk worden ontworpen volgens de afmetingen van een menselijk hoornvlies. Het kan echter meerdere prototypes van de matrijs vereisen voordat een eyeball stuk kan worden gecreëerd die perfect p...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag onze financieringsbron NSERC 20/20 Network erkennen voor de ontwikkeling van geavanceerde oogheelkundige Materials.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled) | Adafruit | 50 | Board |
| Stepper motor | Adafruit | 324 | Motor and Motor shield |
| Equal Leg Coupler 1.6mm 1/16" | VWR | CA11009-280 | 50 stuks buisconnector |
| Tubing PT/SIL 1/16"x1/8" | VWR | 16211-316 | Doos van 50 voet |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation | |
| Agarose, Type 1-A, low EEO | Sigma-Aldrich | A0169-25G | |
| PHD UltraTM | Harvard Apparatus | 703006 | MicroFluidic Pump |
| Bovine cornea | Cargill, Guelph/ON | ||
| Solidworks | Dassault Systemes | Software | |
| 3-D printing | University of Waterloo - 3D Print Centre | ||
| Dissection tools | Fine Science Tools | Algemene dissectietools | |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | Cultuurmedium opslag voor cornea | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | Voegen aan cultuurmedium, 3% totaal volume |
Referenties
- Phan, C. M., Subbaraman, L. N., Jones, L. In vitro drug release of natamycin from beta-cyclodextrin and 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin-functionalized contact lens materials. J Biomater Sci Polym Ed. 25, 1907-1919 (2014).
- Peng, C. C., Kim, J., Chauhan, A. Extended delivery of hydrophilic drugs from silicone-hydrogel contact lenses containing vitamin E diffusion barriers. Biomaterials. 31, 4032-4047 (2010).
- Hui, A., Willcox, M., Jones, L. In vitro and in vivo evaluation of novel ciprofloxacin-releasing silicone hydrogel contact lenses. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 4896-4904 (2014).
- Boone, A., Hui, A., Jones, L. Uptake and release of dexamethasone phosphate from silicone hydrogel and group I, II, and IV hydrogel contact lenses. Eye Contact Lens. 35, 260-267 (2009).
- Lorentz, H., Heynen, M., Trieu, D., Hagedorn, S. J., Jones, L. The impact of tear film components on in vitro lipid uptake. Optom Vis Sci. 89, 856-867 (2012).
- Hall, B., Phan, C. M., Subbaraman, L., Jones, L. W., Forrest, J. Extraction versus in situ techniques for measuring surface-adsorbed lysozyme. Optom Vis Sci. 91, 1062-1070 (2014).
- Mishima, S., Gasset, A., Klyce, S. D., Baum, J. L. Determination of tear volume and tear flow. Invest Ophthalmol Vis Sci. 5, 264-276 (1966).
- Nichols, J. J., et al. The TFOS international workshop on contact lens discomfort: executive summary. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54, 7-13 (2013).
- Peng, C. C., Burke, M. T., Carbia, B. E., Plummer, C., Chauhan, A. Extended drug delivery by contact lenses for glaucoma therapy. J Control Release. 162, 152-158 (2012).
- Faschinger, C., Mossbock, G. Continuous 24 h monitoring of changes in intraocular pressure with the wireless contact lens sensor Triggerfish. First results in patients. Der Ophthalmologe : Zeitschrift der Deutschen Ophthalmologischen Gesellschaft. 107, 918-922 (2010).
- Shaw, A. J., Davis, B. A., Collins, M. J., Carney, L. G. A technique to measure eyelid pressure using piezoresistive sensors. IEEE transactions on bio-medical engineering. 56, 2512-2517 (2009).
- Liao, Y. T., Yao, H. F., Lingley, A., Parviz, B., Otis, B. P. A 3-mu W CMOS glucose sensor for wireless contact-lens tear glucose monitoring. Ieee J Solid-St Circ. 47, 335-344 (2012).
- Coster, D. J. Cornea. , John Wiley & Sons. Wiley-Blackwell (Imprint) John Wiley & Sons (2002).
- Parekh, M., et al. A simplified technique for in situ excision of cornea and evisceration of retinal tissue from human ocular globe. Journal of visualized experiments : JoVE. , e3765(2012).
- Gear and pinion. US patent. , US2279216A (1942).
- Lorentz, H., et al. Contact lens physical properties and lipid deposition in a novel characterized artificial tear solution. Molecular vision. 17, 3392-3405 (2011).
- Furukawa, R. E., Polse, K. A. Changes in tear flow accompanying aging. American journal of optometry and physiological optics. 55, 69-74 (1978).
- Bajgrowicz, M., Phan, C. M., Subbaraman, L., Jones, L. Release of ciprofloxacin and moxifloxacin from daily disposable contact lenses from an in vitro eye model. Invest Ophthalmol Vis Sci. , (2015).
- Luensmann, D., Zhang, F., Subbaraman, L., Sheardown, H., Jones, L. Localization of lysozyme sorption to conventional and silicone hydrogel contact lenses using confocal microscopy. Current eye research. 34, 683-697 (2009).
- Tieppo, A., Pate, K. M., Byrne, M. E. In vitro controlled release of an anti-inflammatory from daily disposable therapeutic contact lenses under physiological ocular tear flow. Eur J Pharm Biopharm. 81, 170-177 (2012).
- Ali, M., et al. Zero-order therapeutic release from imprinted hydrogel contact lenses within in vitro physiological ocular tear flow. J Control Release. 124, 154-162 (2007).
- White, C. J., McBride, M. K., Pate, K. M., Tieppo, A., Byrne, M. E. Extended release of high molecular weight hydroxypropyl methylcellulose from molecularly imprinted, extended wear silicone hydrogel contact lenses. Biomaterials. 32, 5698-5705 (2011).
- Kaczmarek, J. C., Tieppo, A., White, C. J., Byrne, M. E. Adjusting biomaterial composition to achieve controlled multiple-day release of dexamethasone from an extended-wear silicone hydrogel contact lens. J Biomater Sci Polym Ed. 25, 88-100 (2014).
- Mohammadi, S., Postnikoff, C., Wright, A. M., Gorbet, M. Design and development of an in vitro tear replenishment system. Ann Biomed Eng. 42, 1923-1931 (2014).
- Lorentz, H., Heynen, M., Khan, W., Trieu, D., Jones, L. The impact of intermittent air exposure on lipid deposition. Optom Vis Sci. 89, 1574-1581 (2012).
- Peng, C. C., Fajardo, N. P., Razunguzwa, T., Radke, C. J. In vitro spoilation of silicone-hydrogel soft contact lenses in a model-blink cell. Optom Vis Sci. 92, 768-780 (2015).
- Liu, P., et al. Dissolution studies of poorly soluble drug nanosuspensions in non-sink conditions. AAPS PharmSciTech. 14, 748-756 (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Meer artikelen verkennen
