Methodenartikel

In Vitro Demontage van influenza A-virus capsiden door gradiëntcentrifugatie

DOI:

10.3791/53909

⸱

27 maart 2016

 ,  , 
1Institute of Biochemistry, ETH Zurich, 2Department of Biochemistry, University of Zurich, 3Institute for Molecular Health Sciences, ETH Zurich

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De demontage van influenza A-viruskernen tijdens het binnendringen van het virus in gastheercellen is een proces in meerdere stappen. We beschrijven een in vitro methode om de vroege stadia van virale uncoating te analyseren. In deze benadering wordt snelheidsgradientcentrifugering gebruikt om de stappen die het begin van uncoating initiëren onder gedefinieerde omstandigheden biochemisch te ontleden.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zuur-getriggerde moleculaire processen controleren nauw de celinvoer van veel virussen die binnenkomen via het endocytische systeem. In het geval van het influenza A-virus (IAV) worden virusfusie met het endosomale membraan en de daaropvolgende ontmanteling van de virale capside, genoemd uncoating, geregeld door de ionische omstandigheden in endocytische vesicles. De vroege stadia in de levenscyclus van het virus zijn moeilijk te bestuderen omdat endosomen niet direct experimenteel toegankelijk zijn, wat de noodzaak creëert voor een in vitro aanpak. Hier beschrijven we een methode gebaseerd op snelheidsgradientcentrifugatie van gezuiverde virionen door een tweelaagse glycerolgradient, die analyse van de IAV-kern en zijn stabiliteit mogelijk maakt. De gradient bevat een niet-ionisch detergent (NP-40) in zijn onderste laag om het virale membraan te verwijderen door solubilisatie terwijl het virus naar de bodem sedimenteert. Bij neutrale pH worden virale kernen gepelleteerd als stabiele structuren. De belangrijkste kerncomponenten, matrixeiwit (M1) en de virale ribonucleoproteïnen (vRNP's), kunnen duidelijk worden geïdentificeerd in de pelletfractie door SDS-PAGE. Het verlagen van de pH tot 6,0 of lager in de onderste laag verwijdert selectief M1 uit de pellet gevolgd door de afgifte van vRNP's onder meer zure omstandigheden. Virale eiwitbanden op Coomassie-gekleurde gels kunnen worden onderworpen aan densitometrische kwantificering om intermediaire stadia van IAV-ontmanteling te monitoren. Naast pH kunnen andere factoren die de stabiliteit van de virale kern beïnvloeden, zoals zoutconcentratie en mogelijke virale uncoating-factoren, eenvoudig worden beoordeeld door de glycerollaag met detergent dienovereenkomstig aan te passen. Samengevat maakt de gepresenteerde techniek zeer reproduceerbare en kwantitatieve analyse van virale uncoating in vitro mogelijk. Het kan worden toegepast op andere omhulde virussen die complexe uncoatingsprocessen ondergaan.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Influenza A virus (IAV) is een omhuld virus en behoort tot de familie van Orthomyxoviridae. De genen worden gecodeerd op een gesegmenteerde negatieve-sense en enkelstrengs RNA genoom. Bij de mens, IAV veroorzaakt infecties van de luchtwegen, die voorkomen in seizoensgebonden epidemieën en draagt ​​het potentieel voor wereldwijde pandemieën 1. Bij binding aan siaalzuur residuen van de gastheercel oppervlak 2 wordt IAV geïnternaliseerd door clathrine-afhankelijke endocytose en clathrine-onafhankelijke routes 3-8. De zure milieu (pH <5,5) in de endocytische vacuolen veroorzaakt een grote conformationele verandering in de iav spike glycoproteïne hemagglutinine (HA), waardoor fusie van de virale en endosomale membraan 9 late. Zodra de IAV capside (hier ook aangeduid als virale "kern") is ontsnapt uit late endosomen (GO) wordt onbekleed in het cytosol gevolgd door transport van de virale ribonucleoproteins (vRNPs) in de kern - de site of virus replicatie en transcriptie 10-13. Vóór zure activatie van het virus HA ervaart een geleidelijke afname in pH in de endocytische systeem, waarbij de kern voor de latere demontage 14-16 priemgetallen. In deze "priming" stap het M2 ionkanalen in het virale membraan bemiddelen de instroom van protonen en K +10,14,16. De verandering in ionische concentratie in het inwendige virus verstoort de interacties opgebouwd uit het virale eiwit matrix M1 en de acht vRNP bundel en vergemakkelijkt IAV ontmanteling in het cytoplasma volgende membraanfusie 10,14-17.

Directe en kwantitatieve analyse van de priming stap belemmerd doordat endosomen moeilijk om experimenteel. De vermelding proces is bovendien zeer non-synchrone. Daarnaast hebben eindpunt assays, zoals qRT-PCR van viraal RNA of vrijgegeven besmettelijkheidsmetingen, geen gedetailleerd beeld over de biochemische status van de virale Capsi biedend op elk stap van binnenkomst. Terwijl de verstoring van endosomen door siRNA of behandeling met geneesmiddelen aanzienlijk heeft bijgedragen aan het begrip van IAV binnenkomst 18-20, fine-tuning is moeilijk en gevoelig voor niet-specifieke bijwerkingen in de streng gecontroleerde endosoom rijping programma.

Om deze problemen te vermijden, hebben we een eerder ontwikkelde in vitro protocol gebaseerd op het gebruik van snelheidsgradiënt centrifugatie 17 aangepast. In tegenstelling tot andere pogingen 21,22, 23,24, die meestal zijn gebaseerd op combinaties van proteolytische splitsing en detergens behandeling, gevolgd door EM-analyse, deze benadering mogelijk een gemakkelijk meetbaar resultaat. Centrifugatie door verschillende helling lagen kan de sedimenteren deeltjes worden blootgesteld aan en reageren met veranderende condities op een gecontroleerde manier. In de gepresenteerde protocol IAV afgeleid van geklaarde allantoïsvocht of gezuiverde virale deeltjes gesedimenteerd in een tweelaags glycerolgradiënt waarbij de onderlaag bevat de niet-ionische detergens NP-40 (figuur 1). Omdat het virus komt in de tweede, detergent bevattende laag, wordt de virale lipide-envelop en envelop glycoproteïnen langzaam oplosbaar en achtergelaten. De kern, bestaande uit de acht vRNP bundel en wordt omgeven door een matrix laag, sedimenten als een stabiele structuur in de fractie pellet. Virale kerneiwitten zoals M1 en vRNP geassocieerde nucleoproteïne (NP), kunnen worden geïdentificeerd in de pellet door SDS-PAGE en Coomassie kleuring. Met name te maken van commercieel beschikbare gradiënt gelen en kleuring met de zeer gevoelige colloïdale Coomassie 25, maakt hoge precisie en detectie van zelfs kleine hoeveelheden virale kern geassocieerde eiwitten.

Dit stelt de basis voor testen of andere omstandigheden zoals pH, zoutconcentratie, en vermeende ontmanteling factoren hebben invloed op het sedimentatiegedrag van kernonderdelen en kern stabil teit. Hiertoe wordt alleen de onderste, detergent-bevattende laag in de glycerol gradiënt gemodificeerd door introductie van de factor of aandoening van belang. De techniek is bijzonder waardevol bij het ​​onderzoek het effect van verschillende pH en zoutconcentraties op de integriteit van de kern 16 IAV geweest. Tussenstappen van IAV uncoating kan worden gevolgd onder dissociatie van de matrixlaag bij mild zure pH (<6,5), gevolgd door dissociatie vRNP bij pH 5,5 en lager 16,17 (Figuur 1). De laatste stap werd verder versterkt door de aanwezigheid van hoge K + -concentratie in de glycerollaag, als gevolg van een late endocytische omgeving 16. Zoals de virus en de kern gesedimenteerd door de gradiënt ervaren ze een veranderende milieu dat bootst omstandigheden in endosomen. Het resultaat was een stapsgewijze demontage van de virale kern in vitro, als aanvulling op de resultaten afgeleid van celbiologie assays.

t "> De hier gepresenteerde methode is snel ingeschakeld en zeer reproduceerbare analyse van IAV (X31 en A / WSN / 33) en IBV (B / Lee / 40) ontmantelingsmechanisme veroorzaakt door zure pH en het verhogen van K +16,17 evenals demontage van paramyxovirus kernen bij alkalische pH blootstelling 17. het is denkbaar dat de benadering kan worden aangepast aan andere omhulde virussen inzichten in de biochemische eigenschappen van het virale capside structuur en capside demontage groeit tijdens celinvoer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van Buffers en Voorraadoplossingen

  1. Bereid MNT buffer (20 mM MES, 30 mM Tris en 100 mM NaCl) door het oplossen van 470 mg Tris HCl, 390 mg MES-hydraat en 580 mg NaCl in 80 ml ​​DDH 2 O. Stel de buffer op pH 7,4 en brengen tot een eindvolume van 100 ml met DDH 2 O.
  2. Bereid drie identieke oplossingen van 500 mM MES buffer door het oplossen van 9,76 g MES hydrateren in 80 ml ​​dH 2 O per stuk. Stel de buffers op pH 5,8, 5,4 en 5,0, respectievelijk door titratie met geconcentreerd NaOH. Breng elke buffer tot een eindvolume van 100 ml met dH 2 O.
  3. Bereid twee identieke oplossingen van 500 mM Tris-buffer door oplossen van 7,88 g Tris HCl in 80 ml ​​dH 2 O en elk op pH 7,4 en 6,4, respectievelijk door titratie met geconcentreerd HCI. Breng de buffer tot een eindvolume van 100 ml met dH 2 O.
  4. Bereid 50% glycerol oplossing in dH 2 O en roer goed tot de glycErol is homogeen gemengd. Filtreer de oplossing door een Steritop filtereenheid (0,22 urn poriegrootte) in een glazen fles.
  5. Bereid 10% NP-40 oplossing en 1 M NaCl in dH 2 O.
  6. Bereid 25x geconcentreerde proteaseremmer door het oplossen van twee tabletten in 4 ml DDH 2 O.

2. Voorbereiding van de Glycerol Verlopen

  1. Bereid 5 ml detergent buffer master mix (300 mM NaCl, 2% NP-40, 2x geconcentreerd proteaseremmer) oplossing voor elke pH conditie te testen (pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4 en 5,0). Daartoe meng 9 ml van 1 M NaCl, 6 ml van 10% NP-40, 2,4 ml van 25x proteaseremmer beelden, en 9 ml DDH 2 0.
  2. Voor elke pH voorwaarde pipet 4,4 ml van de master mix in een 50 ml conische buis.
  3. Voor pH-waarden boven 5,8 voeg 0,6 ml van de respectieve pH 500 mM Tris voorraadoplossing aan de buis. Voor pH 5,8 en lager voeg 0,6 ml van de respectieve pH 500 mM MES voorraadoplossing.
  4. maak 5ml bufferoplossing met 300 mM NaCl, 2x proteaseremmer, 60 mM Tris pH 7,4 en DDH 2 O. Dit zal dienen als de detergens-vrije controle gradiëntbuffer.
  5. Eventueel fijn stel de pH van de oplossing op pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4 en 5,0 door toevoeging van geconcentreerd HCI of NaOH oplossingen, respectievelijk.
  6. Voeg 5 ml van 50% glycerol tot 5 ml van het detergens-bevattende en detergens-vrije buffer mengsels resulterend in zes 25% glycerol oplossingen. Controleer de pH-waarden met behulp van pH-indicator strips.
    LET OP: In het geval dat de gemeten pH-waarde aanzienlijk verschilt van de gewenste waarde, moet de respectievelijke oplossingen opnieuw worden voorbereid.
  7. Bereid 15% glycerol oplossing door 50% glycerol voorraad dH 2 O in een 3: 7 verhouding.

3. Ultracentrifugatie van IAV

  1. Voeg 3 ml 15% glycerol oplossing in ultra-heldere centrifugeren buizen (13,2 ml, 14 mm x 89 mm) met behulp van een 5 ml spuit en een neeDLE (21 G, 9 cm lang). Niet druppels reactie op de binnenwand van de buis als deze de integriteit van de gradiënt kunnen verstoren. Herhaal dit tot een totaal van zes centrifugatie buizen, één voor elk van de vijf pH-omstandigheden te testen en een voor het controlemonster.
  2. Plaats voorzichtig 3,4 ml 25% glycerol oplossing onder de 15% glycerol laag met behulp van een 5 ml spuit en een lange naald. Zorg ervoor dat niet de twee lagen te mengen. Herhaal dit voor alle zes condities test met de respectieve pH glycerol oplossingen.
    LET OP: Het werk in klasse II bioveiligheid kast voor de volgende stappen.
  3. Voorzichtig overlay de glycerol gradiënten met 30 pi geklaarde allantoïsvocht dat IAV (X31, H3N2) verdund in 1 ml MNT buffer (komt overeen met ongeveer 20-30 ug totaal viraal eiwit) voor elk verloop.
  4. Balance tegengestelde buizen en plaats ze in een SW41 ultracentrifugatie rotor. Centrifugeer gedurende 150 min bij 55.000 xg en 12 ° C.
  5. Na het centrifugeren, zorgvuldigde bovenstaande vloeistof, dat wil zeggen, zowel glycerol lagen met behulp van een schone Pasteur pipet en een afzuiger. Resuspendeer de pellet in 40 pl (1x) niet-reducerende LDS monsterbuffer. Het is belangrijk om op en neer pipetteren meerdere malen de korrel volledig op te lossen. Breng het monster in een 1,5 ml microcentrifugebuis.

4. SDS-PAGE van Pellet Fracties en Coomassie kleuring

  1. Verhit alle monsters bij 95 ° C gedurende 10 minuten. Op dit punt kunnen monsters worden bewaard bij -20 ° C tot ze worden geanalyseerd door SDS-PAGE.
  2. Load 20 ul van de opgeloste pellets op een prefab gradiënt (4-12%) Bis-Tris mini gel en laat gedurende 1 uur bij 200 V in 1 x MOPS SDS loopbuffer.
  3. Maak fixatie-oplossing met 40% methanol en 10% ijsazijn in DDH 2 O.
  4. Incubeer de gel in fixatie oplossing 1 uur en vlekken overnacht in een 15 cm celkweekschaal met een voldoende hoeveelheid colloïdale Coomassie-oplossing onder zachtschudden bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Het is belangrijk om de schotel sluiten om verdamping van de kleuroplossing voorkomen.
  5. Destain de gel in DDH 2 O. Vervang de DDH 2 O om de 15-20 min tot het gel achtergrond duidelijk wordt. Bewaar de gel in DDH 2 O bij 4 ° C totdat het wordt gescand op band kwantificering.
  6. Scan de gel met een hoge resolutie en het gebruik van in de handel verkrijgbare of op maat gemaakte software voor het kwantificeren van eiwit band intensiteiten. Trek het achtergrondsignaal uit een gebied dicht bij de respectievelijke banden en normaliseren deze waarden de detergentvrij controlemonsters (bij pH 7,4).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoals reeds besproken, priming in endosomen is nodig om de IAV kern uncoating bevoegd te maken. Protonering van de kern verzwakt interactie tussen M1 en vRNPs (uit het virale RNA, NP en de polymerasecomplex PB1 / PB2 / PA). Dit proces begint wanneer binnenkomende virus wordt blootgesteld aan een pH van 6,5 (of lager) begin endosomen (EE) en gaat door tot fuseert het virus bij ongeveer pH 5,0 les.

Om de daling van de pH naboots...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Virale capsiden zijn metastabiele macromoleculaire complexen. Tijdens de montage van de virionen inkapseling en condensatie van het virusgenoom vereist begin van de volgende ronde van infectie afhankelijk demontage van deze compacte capside structuur. Virussen zijn geëvolueerd om verschillende cellulaire mechanismen exploiteren om de coating-uncoating cyclus, zoals cellulaire receptoren, chaperones, proteolytische enzymen, fysische krachten door motor eiwitten of helicasen en pH en ionische schakelaars 26,27 ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Yohei Yamauchi en Roberta Mancini voor het verstrekken van ons met reagentia. De AH laboratorium werd gesteund door de Marie Curie Initial Training Networks (ITN), de European Research Council (ERC), en door de Zwitserse National Science Foundation (Sinergia).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
cOmplete™, EDTA-vrije proteaseremmertablettenSigma-Aldrich11873580001De stockoplossing kan worden bewaard bij 2 tot 8 °C gedurende 1 tot 2 weken
Glazuur azijnzuurMerck Millipore100063
Glycerol anhydrous BioChemicaAppliChemA1123
ZoutzuurMerck Millipore100317
Lange injectienaald (21 G, 9 cm, geslepen of stomp uiteinde)
MES-hydraatSigma-AldrichM8250
MethanolMerck Millipore106009
NP-40Sigma-AldrichI8896Nu commercieel verkrijgbaar als IGEPAL® CA-630
NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 kolven, 1.0 mmLife TechnologiesNP0321
NuPAGE LDS-monsterbuffer (4x)Life TechnologiesNP0008
NuPAGE MOPS SDS-loopbuffer (20x)Life TechnologiesNP0001
pH-indicatorstroken, pH 4.0-7.0Merck Millipore109542
QC Colloidal Coomassie StainBIO RAD1610803
NatriumchlorideMerck Millipore106406
NatriumhydroxideMerck Millipore106498
Steritop-filtereenheidMerck MilliporeSCGPT05RE
SW41 Ti, ultracentrifuge rotorsetBeckman Coulter331336
Dünnwandige, ultraklare centrifugeerbuizen, 13.2 ml, 14 mm x 89 mmBeckman Coulter344059
Tris-hydrochloride AppliChemA1087
X31 Influenza A-virus (H3N2), uit ei gekweekt, verduidelijkt allantoische vloeistofVirapurVer vers ontdooid op 4 °C

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taubenberger, J. K., Kash, J. C. Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation. Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).
  2. Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).
  3. de Vries, E., et al. Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS pathogens. 7 (3), e1001329(2011).
  4. Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).
  5. Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells. J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).
  6. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
  7. Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Dissecting virus entry via endocytosis. J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).
  8. Yoshimura, A., et al. Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus. Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).
  9. White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A. Membrane-fusion activity of influenza virus. Embo Journal. 1 (2), 217-222 (1982).
  10. Martin, K., Helenius, A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import. Cell. 67 (1), 117-130 (1991).
  11. Palese, P., Shaw, M. L. Chapter 47. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1690 (2006).
  12. Chou, Y. -Y., et al. Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis. PLoS Pathog. 9 (5), e1003358(2013).
  13. Martin, K., Helenius, A. Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus. Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).
  14. Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins. Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).
  15. Li, S., et al. pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus. Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).
  16. Stauffer, S., et al. Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration. Journal of Virology. , (2014).
  17. Zhirnov, O. P. Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses. Virology. 176 (1), 274-279 (1990).
  18. Banerjee, I., et al. Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry. Science. 346 (6208), 473-477 (2014).
  19. Huotari, J., et al. Cullin-3 regulates late endosome maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).
  20. Yamauchi, Y., et al. Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry. PLoS Pathog. 7 (10), e1002316(2011).
  21. Bachmayer, H. Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses. Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).
  22. Reginster, M., Nermut, M. V. Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores. Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).
  23. Nermut, M. V. Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus. Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).
  24. Schulze, I. T. The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles. Virology. 47 (1), 181-196 (1972).
  25. Candiano, G., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
  26. Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A. Mechanisms of virus uncoating. Trends in microbiology. 2 (2), 52-56 (1994).
  27. Yamauchi, Y., Helenius, A. Virus entry at a glance. Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).
  28. Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH. Virology. 200 (1), 284-291 (1994).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Snelheidsgradi ntcentrifugatiedisassembly van virale capsidenglycerolgradi ntsolubilisatie met NP 40pH afhankelijke uncoatingSDS PAGE analysestabiliteit van de virale kernmatrixeiwit M1virale ribonucleoprote nen

Gerelateerde artikelen