Toepassingen van de single-probe: massaspectrometrie Imaging en Single Cell Analysis onder omgevingsomstandigheden

Samenvatting

Hier presenteren we protocollen om zowel ambient massaspectrometrie beeldvorming (MSI) van weefsels en in-situ live enkele cel MS (SCMS) analyse uit te voeren met behulp van de enkele sonde, een geminiaturiseerd multifunctioneel apparaat voor MS analyse.

Samenvatting

Massaspectrometrische beeldvorming (MSI) en in-situ massaspectrometrie van enkele cellen (SCMS) onder omgevingsomstandigheden zijn twee opkomende gebieden met groot potentieel voor de gedetailleerde massaspectrometrische (MS) analyse van biomoleculen uit biologische monsters. De single-probe, een geminiaturiseerd apparaat met geïntegreerde bemonsterings- en ionisatiemogelijkheden, is in staat om zowel omgevings-MSI als in-situ SCMS-analyse uit te voeren. Voor omgevings-MSI gebruikt de single-probe oppervlakte micro-extractie om continu MS-analyse van het monster uit te voeren, en deze techniek maakt het mogelijk om MS-beelden met hoge ruimtelijke resolutie (8,5 µm) te creëren uit biologische monsters zoals muis hersenen en nier secties. Omgevings-MSI heeft het voordeel dat er weinig tot geen monstervoorbereiding nodig is vóór de analyse, wat de hoeveelheid potentiële artefacten in de gegevensverwerving vermindert en een meer representatieve analyse van het monster mogelijk maakt. Voor in-situ SCMS kan de single-probe tip direct in levende eukaryotische cellen zoals HeLa-cellen worden ingebracht, vanwege de kleine bemonsteringstipgrootte (< 10 µm), en deze techniek is in staat om een breed scala aan metabolieten binnen individuele cellen te detecteren bijna real-time. SCMS maakt een grotere gevoeligheid en nauwkeurigheid van chemische informatie mogelijk op het niveau van een enkele cel, wat ons begrip van biologische processen op een fundamenteler niveau zou kunnen verbeteren dan eerder mogelijk was. Het single-probe apparaat kan mogelijk gekoppeld worden aan een verscheidenheid aan massaspectrometers voor brede reeksen MSI en SCMS studies.

Inleiding

Massaspectrometrie-beeldvorming (MSI) is een relatief nieuwe moleculaire beeldvormingstechniek om de ruimtelijke verdeling van de interessante verbindingen op oppervlakken te bepalen. Tijdens de MSI-analyse worden massaspectrometrie (MS) metingen vastgelegd over het oppervlak op individuele pixelbasis om een 2D-beeld van de interessante soorten te creëren ¹. MSI-technieken hebben de mogelijkheid om een ruimtelijk opgeloste kenmerkverdeling te leveren voor een groot aantal metabolieten, waardoor veel meer informatie uit een monster kan worden verkregen dan met traditionele moleculaire beeldvormingstechnieken, en ze hebben het potentieel om de analyse van biologische monsters voor biologische en farmacologische studies aanzienlijk te verbeteren ². MSI kan grofweg worden onderverdeeld in niet-ambiante en ambiante benaderingen. De niet-ambiante MSI-analysetechnieken, zoals matrix-ondersteunde laserdesorbentie-ionisatie (MALDI) MS ³ en time-of-flight secundaire ionen-MS (ToF SIMS) ⁴, zijn in staat tot hoge ruimtelijke resolutie (ongeveer 5 μm en 100 nm, respectievelijk) en hoge gevoeligheid. Deze methoden vereisen echter uitgebreide monstervoorbereiding, zoals het aanbrengen van matrixmoleculen op het monsteroppervlak, en een vacuümmonsteromgeving, wat artefacten in de verkregen gegevens zou kunnen introduceren. Ambiante technieken zoals desorbentie-elektrospray-ionisatie (DESI) MS ⁵, laserablatie-elektrospray-ionisatie (LAESI) MS ⁶ en nano-DESI MS ⁷ zijn in staat tot MSI van monsters met weinig tot geen voorafgaande voorbereiding onder de ambiante omgeving, wat MS-beelden kan produceren die mogelijk het monster in zijn meest natuurlijke toestand weerspiegelen. De meeste van deze technieken missen echter over het algemeen de hoge ruimtelijke resolutie en detectiegevoeligheid in vergelijking met de niet-ambiante technieken, waarbij experimenten doorgaans worden uitgevoerd op ongeveer 150 μm per pixel ⁸.

Eencellig analyse (SCA) is een groeiend veld dat de mogelijkheid heeft om de chemische samenstelling van biologische monsters op cellulair niveau te karakteriseren. SCA maakt de analyse van biologische systemen mogelijk op een fundamenteler niveau dan traditionele celanalysetechnieken, die een gemiddeld resultaat van een populatie cellen produceren, wat mogelijk inzichten oplevert die voorheen niet mogelijk waren ⁹. MS-technieken zijn onlangs toegepast op SCA (aangeduid als eencellig massaspectrometrie of SCMS) met behulp van niet-ambiante technieken zoals MALDI MS ¹⁰ en ToF SIMS ¹¹, waarbij cellen worden voorbehandeld voor analyse, en met ambiante technieken zoals LAESI MS ¹² en directe extractiemethoden, zoals live single-cell video-MS ^{13, 14}, om een breed scala aan celtypen zoals ei, plant en kanker te analyseren. Ambiante technieken hebben het voordeel dat ze kunnen worden toegepast op levende cellen, wat opnieuw de artefacten minimaliseert, wat leidt tot een betere weergave van de metabolieten in de levende cellen. De hierboven beschreven directe extractiegebaseerde methoden voeren echter het monsterextractie- en analyseproces uit in twee verschillende stappen, wat resulteert in een tijdsgat tijdens de analyse dat mogelijk de metabolieten binnen het monster zou kunnen veranderen.

De single-probe, een geminiaturiseerde multifunctionele inrichting die in staat is om hoge ruimtelijke resolutie ambiante MSI op biologische weefselsecties ¹⁵ en bijna real-time in-situ SCMS op levende enkele cellen ¹⁶ uit te voeren. De single-probe heeft een geïntegreerde constructie die bestaat uit een getrokken dubbel-borings kwarts capillair gekoppeld met een oplosmiddelvoorziening inlaat en een nano-ESI emitter gemaakt van fused silica capillairen, waardoor oplosmiddelaflevering en analytextractie kunnen worden uitgevoerd vanaf een enkele inrichting. In de ambiante MSI-modus wordt de single-probe over het monsterweefsel geplaatst en treedt oppervlakte micro-extractie op, waardoor een gerasterde MS-afbeelding kan worden gemaakt met hoge ruimtelijke resolutie. Met name de taps toelopende punt van de single-probe is klein genoeg om te worden ingebracht in levende eukaryote cellen voor in-situ SCMS-analyse, waarbij de metabolietdetectie minder dan twee seconden duurt tussen sonde-inbrenging en MS-detectie, waardoor chemische informatie kan worden verkregen in bijna real-time. Hier zijn de protocollen om het single-probe-apparaat te fabriceren en om zowel de ambiante MSI als SCMS modi uit te voeren met behulp van de single-probe MS-technieken.

Protocol

Diergeneeskundig gebruik en welzijn moeten zich houden aan de NIH Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren volgende protocollen beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). Mouse weefselmonsters werden verstrekt door medewerker Dr. Chuanbin Mao.

1. Mouse Tissue afdeling Voorbereiding

1. Plaats geheel muis betreffende orgaan (hersenen, nier, lever, etc.) in het midden van een kleine plastic's (bijvoorbeeld 12-well celcultuur plaat) en onder in weefselverwerkingsproces verbinding tot ongeveer 10 mm bedraagt. Zorg ervoor dat er geen bel gevormd in het weefsel verankeren verbinding en dat het orgaan wordt geplaatst in de gewenste oriëntatie (bijv sagittale, coronale, etc.).
2. Onmiddellijk plaats weefsels in vloeibare stikstof voor Snelkoeling. Voor de lange termijn opslag, slaan de bevroren monsters in een -80 ° C vriezer.
3. Neem de bevroren muis orgel en ontdooien tot -15 ° C in een temperaopnieuw gecontroleerd cryomicrotoom.
4. Secure weefsel op een stalen basis met ongeveer 500 ui weefselverwerkingsproces verbinding en plaats op een cryomicrotoom snijden monteren zodat de gewenste oriëntatie snijden wordt aan het mes.
5. Gedeelte van het weefsel een 12 urn dik. Plaats coupes weefsel plakjes op polycarbonaat microscoop dia's en laten drogen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voor de lange termijn opslag, slaan de bevroren dia in een -80 ° C vriezer.

2. Cell Culture

Opmerking: Celkweek werd uitgevoerd in bioveiligheidskast (Biosafety Level II) onder steriele omstandigheden. HeLa-cellijn werd gebruikt als een modelsysteem, en cellen werden gekweekt in compleet kweekmedium met de volgende gebruikelijke protocollen:

1. Warm reagentia (bijvoorbeeld trypsine, fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en celkweekmedium) aan 37 ° C.
   Opmerking: De cel kweekmedium bevat anorganische salts, aminozuren, vitaminen en anderen. Voor een volledige lijst van bestanddelen, wordt verwezen naar de formulering van de fabrikant.
2. Verkrijgen celmonster (bijvoorbeeld 1 ml celsuspensie HeLa) toevoegen aan 9 ml volledig celkweekmedium in een standaard 10-cm celkweekplaat. Het aanvankelijke aantal cellen ongeveer 0,5 x 10 ⁶ cellen / ml. Houd in kweek bij 37 ° C met _5% CO2 voor 2-3 dagen tot de groeiende oppervlak bedekt bij 70-80% van de celcultuurplaat. Record cel passage nummer voor elke opeenvolgende toer.
3. Voer cel passage (dwz cel splitsen) in de celkweek plaat.
   1. Aspireren groeimedium en gebruik 5 ml 1x PBS aan de cellen te spoelen. Verwijderen PBS met een steriele opzuigpunt en incubeer de cellen met 2,5 ml trypsine (0,25%) gedurende ~ 5 min bij 37 ° C om de cellen los te maken van de kweekplaat.
      Opmerking: De werkelijke trypsine behandelingstijd moeten worden geoptimaliseerd op basis van de specifieke trypsine product gekocht van de fabrikant. Inadequate behandelingstijd laat de cellen gehecht aan de plaat, terwijl overmatige behandeling leidt tot celdood.
   2. Stop trypsine activiteit door toevoeging 7,5 ml compleet celkweekmedium, en vervolgens gelijkmatig resuspendeer de cellen (totaal volume 10 ml). Gebruik de cel suspensie voor cultuur (stap 2.2) of bereiding van SCMS monsters (stap 2.4).
4. Bereid de cel monsters voor SCMS experimenten.
   1. Plaats individuele micro dekking dia's in een 12-well plaat en voeg 1,8 ml celkweekmedium en 0,2 ml celsuspensie in de put.
   2. Meng cellen onder zacht roeren van de plaat en incubeer in een _5% CO2 omgeving bij 37 ° C gedurende ~ 24 uur. Om behandeling met geneesmiddelen uit te voeren om de gekweekte cellen, voeg een geneesmiddelverbinding-oplossing (bijvoorbeeld in DMSO (dimethylsulfoxide)) in 12-well celkweek plaat.
      Opmerking: De uiteindelijke geneesmiddelconcentratie (bijvoorbeeld, 10 nM, 100 nM, 1 uM en 10 uM) en tB EHANDELING af (bijvoorbeeld 4 uur) worden naar gelang van het specifieke doel van de studies. Cellen worden aan de micro dekglaasjes en klaar voor de CSMS experimenten (stap 6).

3. Single-probe Fabrication

1. Plaats de dual-boring kwarts buis (binnendiameter (ID) 127 micrometer, buitendiameter (OD) 500 pm) in een laser micropipet trekker en trek een dual-bore kwarts naald. Gebruik de volgende parameters als uitgangspunt: Warmte = 400, Fil = 3, Vel = 80, Del = 150, en Pul = 250 (alle eenheden zijn eenheden van de fabrikant). Zorg ervoor dat de trok dual-bore kwarts naald heeft een taps toelopende tip voor een optimale probe eigenschappen. Snijd de trok tip zodat er ~ 5 mm lang van unpulled dual-bore kwarts capillaire linksaf aan de andere kant.
   Opmerking: De feitelijke parameters van de laser trekker moet worden geoptimaliseerd afhankelijk van de specifieke omstandigheden van het instrument.
2. Snijd een ~ 80 mm doorsnede van fused silica capillair (ID 40 pm, OD. 105 pm) als het oplosmiddel verstrekken van capillaire, en plaats deze in een boring op het platte uiteinde van de dual-boring kwarts naald.
3. Snijd een mm sectie ~ 40 van fused silica capillair (ID 40 pm, OD 105 pm) en het gebruik van een scheermes te scheren ~ 5 mm van de polyimide coating van het middelpunt. Gebruik een propaan vlam om snel te verwarmen en trek het gefuseerde capillaire in een nano-elektrospray ionisatie (ESI) zender met een fijne taper. Snijd een nano-ESI emitter (~ 7-10 mm lang), en plaats deze in de andere boring op het platte uiteinde van de dual-boring kwarts naald. U kunt ook gebruik maken van de laser trekker tot een boete taper te produceren.
4. Breng een minimale hoeveelheid (~ 1-2 pi) UV uithardende hars op de vlakke voorzijde van de dual-boring kwarts naald en stollen de hars met een LED UV lamp voor ~ 20 seconden om het oplosmiddel te verzekeren verschaffen capillair en nano- ESI emitter. De procedures voor de afzonderlijke delen in één-probe assembleren getoond in figuur 1a.
5. Snijd een standaard microscoop glass slide (1 "x 3") in de lengte doormidden. Plaats de single-probe op een einde van het glaasje zodat de nano-ESI emitter naar buiten gericht. Breng de reguliere epoxy om het lichaam van de enkel-sonde, zodat het wordt bevestigd aan het glaasje (Figuur 1b). Laat 's nachts voor verharding. Stel de gefabriceerde één probe met geïntegreerde interne probe opstelling (figuur 1c), waarbij een massaspectrometer is verbonden zoals geïllustreerd in figuur 1D.

4. Bouw de geïntegreerde Single-probe MS Setup

1. Wijzig de ionenbron-interface flens van de massaspectrometer en fabriceren de standaard (met instelbare positie en hoogte) van de digitale stereoscoop (figuur 1e en 1f).
   1. Boor een ionenbron-interface flens met twee gaten waardoor de bevestiging van een aluminium optische board. Maak een dia rail apparaat en een hoogteverstelling stang (verbonden aaneen XY podium voor fine tuning stand), zodat de digitale stereoscoop systeem kan worden bevestigd aan de aluminium optische plaat (figuur 1e).
2. Bevestig de gewijzigde digitale stereo microscoop, een digitale USB microscoop, een miniatuur handmatig XYZ vertaling podium met een flexibele klem houder, de gemotoriseerde XYZ vertaling stadium systeem om de aluminium optische bestuur, dat op de aangepaste ionenbron-interface flens van de massaspectrometer is gemonteerd (figuren 1c en 1f). Met de flexibele klem houder naar glasplaatje bevestigd met een enkele probe bevestigen.
3. Bevestig de single-probe setup om de massaspectrometer (figuur 1f). Pas de flexibele klemhouder en de miniatuur XYZ fase met de emitter van de single-probe plaatsen voor de ingang van de massaspectrometer. Gebruik de USB digitale microscoop (met verstelbare kijkhoek) aan de kant van de single-sonde naar een ingezoomd beeld van de single-p biedenrobe tip of nano-ESI emitter en de digitale stereoscoop (met instelbare hoogte) boven de enkelvoudige sonde naar de cellen en de sondepunt bekijken.
   Let op: Het gebruik van de overeenkomstige ionenbron flens, kan deze geïntegreerde single-probe-systeem worden gekoppeld aan andere vormen van massaspectrometers uitgerust met ambient ionisatie bronnen.

5. Ambient MSI

1. Ontdooi de sectie monster bij kamertemperatuur en plaats het op de gemotoriseerde XYZ translatietrap systeem onder de één-probe. Pas de monsterpositie door verandering van de coördinaten in de besturingssoftware.
2. Met de spuit om de bemonstering oplosmiddel pomp met een geschikte snelheid (bijvoorbeeld 0,2 ul / min) is en daarbij het ​​ionisatiespanning (bijvoorbeeld 5 kV). De selectie van de bemonstering oplosmiddel is flexibel, en de voorkomende omvatten MeOH: water (9: 1) en acetonitril. Het dode volume van de nano-ESI emitter werd geschat op ~ 3 nl en de tijd tussen de probe-surfa zijnce contact en ion signaal observatie is meestal minder dan 1 seconde ^15.
   Opmerking: De aangepaste ionenbron-interface flens kan de ionisatie spanning verlost te worden van de massaspectrometer een geleidende Unie door middel van een krokodil clip. De ionisatie spanning wordt dan overgedragen via een geleidende vakbond om het oplosmiddel in de capillaire en de single-probe kanalen, en toegepast op de nano-ESI emitter in de steekproef opgenomen analyten ioniseren. Zorg ervoor dat de ionisatie spanning wordt uitgeschakeld bij het aansluiten van de krokodil clip met de geleidende vakbond.
3. Stel de hoogte van de één-sonde zodat het rust net boven het oppervlak van het monster en kunnen oppervlakte-extractie van metabolieten voeren. Til de Z-stage, en gebruik vervolgens de USB digitale microscoop (aan de kant van de single-sonde) om de wijziging afstand tussen de single-sonde en het oppervlak weefsel te controleren. Monitor veranderingen in de massa spectrum tijdens deze hoogteverstelling, en stoppen met lifting de Z-fase waarin een verandering van de ionen signaal van oplosmiddel achtergrond weefsel metabolieten waargenomen.
4. Herhaal stap 5.3 drie keer op drie verschillende punten in het stadium besturingsprogramma voor de geautomatiseerde oppervlak afvlakking aanpassing. Plaats het uiteinde van de één-probe op drie punten op het monsteroppervlak op een afstand van ongeveer 10 mm van elkaar. Voer hoogteverstelling door op de omhoog en omlaag iconen, en sluit de drie punten in de juiste positie in het kader van het "Plan-methode".
5. Stel andere parameters voor rastering over de sectie van belang in het monster met behulp van dit programma. Voor de muis nieren secties hier wordt gepresenteerd, gebruik maken van een 10,0 um / sec rastering snelheid en 20 urn afstand tussen de lijnen. De gemotoriseerde fase systeem heeft een 0,1 urn minimum increment beweging. De afstand tussen de enkelvoudige sonde en weefsel wordt verkregen uit stap 5.3.
6. Stel een werkwijze voor de automatische verwerving van MS spectra van de massaspectrometer. for massa resolutie hoog MSI op de muis nier monster, gebruikt u de volgende parameters: massa resolutie 60.000 (m / Δm), ~ 5 kV positieve modus, 1 microscan, 150 msec max injectie tijd en AGC op. Alle verkregen MS spectra die individuele lijnen van het beeld MS hadden hetzelfde aantal scans uniforme tijdsafstand tussen elke scan, wat aangeeft dat de pixel grootte voor de gevormde beelden gelijkmatig verspreid.
7. Start de MSI data-acquisitie. Start de MS overname volgorde voor de massaspectrometer, en dan starten de rastering volgorde voor de XYZ-besturingsprogramma.
   1. Bijvoorbeeld, in de MS data-acquisitie programma hier gebruikt, gaat u naar "Sequence setup", selecteer "New sequentie", het genereren van een set van bestanden voor een nieuwe volgorde genummerd van 01 tot en met X, waarbij X het aantal lijnen wordt gebruikt voor de image gewenste MS moeten worden genomen, en druk vervolgens op "Run sequentie".
   2. Gebruik een zelfgemaakte elektronisch apparaat, zodat de software om een ​​conta producerenct sluiting signaal voor de massaspectrometer om de gegevens te verzamelen. Het schema wordt getoond in de figuur aanvullende (figuur S1) als referentie.
8. Construct MS beelden van ruwe MS-bestanden met behulp van geschikte MSI visualisatiesoftware. Bijvoorbeeld, bij gebruik van de software per groep Laskin's ontwikkeld op PNNL ^17, voert u de volgende stappen.
   1. Klik op 'Brows File. " Selecteer het eerste bestand verkregen uit de MSI experiment. Geef aan waar het bestand begint en eindigt bij 'Aantal lijnen. " Selecteer een bereik van m / z waarden voor de MS beeld bereik van minder dan "Enter MZ Range".
   2. Druk op de knop "Start" om het beeld creatie proces te starten. Zodra imago van de MS is gemaakt, klikt u op "Afbeelding opslaan" onder "Toolbar" om beelden in de computer op te slaan.

6. In situ live SCMS

1. Setup de single-probe systeem per instruerenionen voor MSI. Stel het oplosmiddel (bijvoorbeeld MeOH / _H2O of acetonitril) stroomsnelheid (bijvoorbeeld ~ 25 nl / min).
2. Was de gekweekte cellen, die zijn bevestigd op de micro dekglas dia's, met PBS om de culturele media en extracellulaire drug componenten te verwijderen. Plaats cel met glasplaatje op de gemotoriseerde XYZ vertaling podium voor experiment.
   Let op: U kunt ook de verse celkweekmedium (zonder dat foetaal bovine serum) aan de gekweekte cellen te spoelen. Minder ion onderdrukking is waargenomen. Bovendien kunnen cellen overleven langere tijd tijdens het experiment waar de omgevingstemperatuur (~ 20 ° C) is significant lager dan de kweektemperatuur (37 ° C). Het type geneesmiddel, oplossingsconcentratie en behandelingstijd varieert in verschillende studies.
3. Stel het digitale stereomicroscoop (boven het monster) op de punt van de enkele-sonde celpenetratie controleren tijdens de analyse. Gebruik de USB digitale microscoop (op de side van de single-sonde) aan de werkomstandigheden van de nano-ESI emitter op de single-sonde te controleren.
4. Gebruik de gemotoriseerde XYZ podium controleprogramma en digitale stereo microscoop (boven cellen) om een ​​cel van belang te lokaliseren, en nauwkeurig de positie van de single-sonde boven het monster. Start MS data acquisitie voor de tip één sonde in de cel wordt ingebracht.
   1. Gebruik de volgende parameters als referentie voor MS analyse met behulp van een hoge resolutie massaspectrometer: massa resolutie 100.000 (m / Δm), ~ 3 kV positieve en negatieve mode, 1 microscan, 150 msec max injectie tijd, AGC-modus op. Geautomatiseerde overname van MS spectra wordt gedaan door te klikken op "Start" in de MS data-acquisitie programma.
   2. Til de gemotoriseerde Z-fase door te klikken op het pictogram om het celmembraan binnendringen en houdt het opnemen van het MS signaal gegenereerd uit de cel. Een tijdsvertraging van 1-2 seconden wordt meestal waargenomen tussen de probe en het inbrengen MS signaaldetectie. De andere bevestigdcelpenetratie, een dramatische verandering van het MS signalen kunnen worden waargenomen bij de penetratie van het celmembraan. De MS signalen van intracellulaire verbindingen die gewoonlijk kan duren voor ~ 15-20 seconden voordat een significante daling.
   3. Lager in de cel met plaat om de tip één probe trekken uit de cel. Het duurt meestal <15 seconden voor het ion signalen van de cellulaire verbindingen aan het geluidsniveau benaderen. Het oplosmiddel flow voor ~ 3 min volledig de single-probe spoelen. Ondertussen, de positie van de gemotoriseerde XYZ podium systeem naar de volgende cel te lokaliseren te worden geanalyseerd. Elke cel experiment vereist ~ 3 min worden bereikt.

Resultaten

De single-probe werd met succes gebruikt voor de analyse van MSI omgevingstemperatuur doorsnede muis nierweefsel ^15. Het apparaat maakt gebruik van het mechanisme van oppervlaktevloeistof micro-extractie (figuur 1a), die zeer efficiënt analyt extractie uit een klein gebied verschaft, waardoor voorkomende ion signalen intensiteiten in de MSI resultaten. Zo hebben de signaalintensiteiten van meer dan 10 ⁷ bereikt voor bepaalde overvloedige metabolieten (Figuur 2a). Een groot aantal metabolieten werden gedetecteerd op deze wijze, waaronder een aantal sfingomyeline (SM) en fosfatidylcholine (PC) soorten als [SM (34: 1) + Na] ⁺ (725,5575 m / z) [PC (32: 0) + H] ⁺ (734,5700 m / z) [PC (34: 1) + Na] ⁺ (782,5696 m / z), en [PC (38: 5 + Na)] ⁺ (814,5726 m / z). Deze verbindingen werden geïdentificeerd met een hoge massa resolutie en nauwkeurigheid van massa's wanneer gekoppeld to een hoge resolutie massaspectrometer. Zo werd de identificatie bereikt met minder dan 4 ppm m / z massanauwkeurigheid (dat wil zeggen het verschil tussen de waargenomen en theoretische waarden) voor elke metaboliet (figuur 2b) in hier gepresenteerde resultaten. Bovendien, tandem MS-analyses (dwz, MS / MS) werden ook uitgevoerd voor meer vertrouwen identificeren van de soorten van belang. ¹⁵

Door de mogelijkheid van het uitvoeren van efficiënte vloeibare micro-extractie op een klein gebied, kan de interne-probe apparaat worden gebruikt om een hoge ruimtelijke resolutie MSI experimenten onder omgevingsomstandigheden ^15. Zo zijn gedetailleerde MS afbeeldingen muizennier secties verkregen illustreert de ruimtelijke verdeling van geselecteerde metabolieten (figuur 2c). De ruimtelijke resolutie van het beeld MS werd bepaald op 8,5 urn na het veelgebruikte gegeven van het hebben van de transiti. op punt van een scherp functie bepaald binnen een 20-80% intensiteit verandering van het signaal MS ¹⁸ Bij fosfolipide [PC (38: 5 + Na)] ⁺ op de muizennier _gedeelte, de functie overgang tussen de binnenste medulla en de buitenste merg plaatsvindt over een scan cyclus in de chronogram, waarin een intensiteit verandering groter dan 20-80% bereik. Gebaseerd op het monster bewegingssnelheid (10,0 um / sec) en MS-gegevens opnamesnelheid (0,85 sec / spectrum), het monster bewegingsafstand in een MS scancyclus (8,5 urn), dat wil zeggen, de MSI ruimtelijke resolutie, kan worden berekend (Figuur 2d). Deze ruimtelijke resolutie is een van de hoogste nog bereikt voor ambient MSI technieken uitgevoerd op biologische monsters.

Voor SCMS was één probe kan de analyse van afzonderlijke levende HeLa cellen ¹⁶ bereikt. De tip grootte van de interne probe is gewoonlijk minder dan 10 um (Figure 3a), die klein genoeg is direct in te voegen in vele typen eukaryote cellen, waarvan de diameter ~ 10 um, voor de extractie en MS analyse. Het inbrengproces van de single-sondepunt in een cel kan visueel gevolgd worden met een digitale stereomicroscoop (figuur 3b) en het celmembraan penetratie kan worden bevestigd door middel van de snelle en significante verandering van massaspectra van PBS (of vers celkweek gemiddeld) intracellulaire verbindingen (figuren 3c en 3d). De experimenten in zowel positieve als negatieve ion modus worden uitgevoerd om bredere types moleculaire species te detecteren. Zo werden 18 verschillende soorten lipiden die in de positieve modus, zoals sfingomyelinen (SM) en fosfatidylcholinen (PC), terwijl adenosine fosfaten (AMP, ADP en ATP) werden in de negatieve ion modus (figuren 3c en d) gedetecteerd. De vertraging tussen de single-sonde inbrengen into een cel en het signaal detectie was typisch minder dan twee seconden, waardoor een bijna real-time detectie van cellulaire metabolieten. SCMS werd ook toegepast op experimenten waarbij de cellen werden behandeld met geneesmiddelen tegen kanker (bijvoorbeeld OSW-1, paclitaxel en doxorubicine) ^19]. De overeenkomstige geneesmiddelen kan worden gedetecteerd in HeLa-cellen na 4 uur behandeling in een reeks concentraties (dat wil zeggen, 10 nM, 100 nM, 1 uM en 10 uM) in DMSO (dimethylsulfoxide) met de onbehandelde cellen (alleen toevoegen DMSO ) als controles. De MS signalen van drugs waren niet aanwezig in de extracellulaire of PBS controle (figuur 3e), maar waren gedetecteerd in de afzonderlijke cellen met behulp van de single-probe MS techniek (alleen 100 nM behandeling resultaten worden getoond in figuur 3f). Omdat cellen werden gespoeld met PBS (of verse celkweekmedium) aan extracellulaire verbindingen en verontreinigingen te verwijderen, de detectie van endogene metabolieten (bijvoorbeeld een cel lipidend adenosine fosfaten) en exogene verbindingen (bijvoorbeeld geneesmiddelen tegen kanker) geeft aan dat de interne-probe MS techniek kan worden gebruikt om intracelluaire analyseren.

Figuur 1. Fabricage en configuratie van de single-probe voor ambient MSI en SCMS analyse. A) procedures Fabrication van de single-sonde. B) Foto van een gefabriceerde single-probe bevestigd aan een glasplaatje. C) Foto van de single- probe opstelling bevestigd aan een massaspectrometer. d) Diagram van de interne probe-opstelling gekoppeld aan een massaspectrometer. Tijdens een experiment, wordt de bemonstering oplosmiddel continu ontvangen van de spuit, wordt de ionisatie spanning op de geleidende eenheid van de massaspectrometer worden twee digitale microscopen monster plaatsing controleren, de gemotoriseerde XYZ stadiumsysteem wordt gebruikt om het monster Motion Control, en een massaspectrometer wordt gebruikt voor de analyse. e) Foto van de aangepaste digitale stereoscoop systeem. f) Foto die de digitale stereoscoop door een optische board aan de ionenbron-interface flens. Klik hier om bekijk een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2. Resultaten van een omgevingstemperatuur MSI studie van een muis nier sectie met een hoge ruimtelijke en massa-resolutie. A) Een vertegenwoordiger massa spectrum van de single-probe MSI. De maximale intensiteit van gedetecteerde metabolieten 3,39 x 10 ⁷ (willekeurige eenheden) te bereiken. B) Een selectie van de gedetecteerde metabolieten gepresenteerd met hun massa nauwkeurigheid. C)MS afbeeldingen [PC (32: 0) + H] ⁺ en [PC (34: 1) + Na] ⁺ uit een sectie muizennier bij 8,5 micrometer ruimtelijke resolutie. PC: fosfatidylcholine. Schaal bar: 2 mm; 0.20 mm (inzet) d) Vaststelling van de ruimtelijke resolutie van het beeld van de MS. [PC (38: 5) + Na] ⁺ (aangepast met toestemming van referentie 15). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Resultaten van een omgevingstemperatuur SCMS analyse van geneesmiddel behandelde HeLa cellen met hoge massa resolutie. A) ingezoomde foto van de single-sondepunt die een typische grootte van <10 urn in diameter. B) Foto gemaakt op de plaats van één probe inbrengen in een HeLa cel. Schaal bar: 50 pm.c) Een typische positieve ion modus massaspectrum met de identificatie van een aantal PC (fosfatidylcholine) soorten. d) Een representatieve lijst van metabolieten gedetecteerd SCMS analyse van HeLa-cellen zowel in positieve en negatieve ion modus. ef) Massa spectra de controle en de behandelde (100 nM OSW-1) cellen (aangepast met toestemming van referentie 16). klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur S1. Schakelschema van het elektronische apparaat dat wordt gebruikt om contact te sluiten signaal te produceren voor massaspectrometer om gegevens te verzamelen. Klik hier om te bekijken of te downloaden dit cijfer.

Discussie

De single-probe is een multifunctioneel apparaat dat kan worden gebruikt voor zowel MSI en SCMS experimenten. De single-probe opstart (inclusief translatietrap systemen, microscopen, ionenbron flens-interface, etc.) als een add-on component die flexibel kan worden aangepast aan de bestaande massaspectrometer. Een snelle uitwisseling tussen de single-probe setup en de conventionele ESI ionenbron kan worden bereikt binnen één minuut. In principe, met de geschikte ionenbron-interface flens, de één-probe installatie kan worden aangepast aan de andere massaspectrometers. Bovendien kan de bemonstering oplosmiddel dat verschillende reagentia worden gebruikt met de single-probe opstart reactief MSI en SCMS experimenten, die de detectie van vollere biomoleculen sterk verbetert. Behalve dierlijke weefsels en cellijnen, de één-probe is eveneens geschikt voor het analyseren andere biologische systemen zoals planten. Daarom, met dezelfde experimentele opstelling ensoortgelijke opleiding van de gebruikers, kan een verscheidenheid aan studies worden uitgevoerd met behulp van een enkel instrument en door dezelfde gebruikers, waardoor een efficiënte en veelzijdige experimenten worden uitgevoerd met de minimale trainingstijd en instrumentatie kosten.

Het belangrijkste onderdeel van de single-probe MS techniek is de sonde zelf. De kwaliteit van de single-sonde heeft een significante invloed op zijn prestaties, die de kwaliteit van zowel de MSI en SCMS experimenten grotendeels bepaalt. Bij het fabriceren van single-probes, zorg ervoor dat de haarvaten binnenkant van de dual-boring buizen stevig vastgelijmd aan de kans op oplosmiddel lek tijdens de experimenten te elimineren. Het is cruciaal om een ​​minimale hoeveelheid UV uithardbare epoxy, zodat de openingen en capillairen niet tijdens de fabricage probe verstopt gebruiken.

De single-probe werd gebruikt om een hoge ruimtelijke en massa resolutie ambient MSI voeren van biologische monsters ^15. Het grote voordeel van ambient MSI bovennon-ambient werkwijzen is dat monstervoorbereiding minimaal wordt gehouden zonder de noodzaak van een vacuüm omgeving bemonstering, waardoor het te analyseren monster in een bijna natieve toestand ^8. Een van de belangrijkste hindernissen voor de meeste andere ambient MSI techniek onvoldoende ruimtelijke resolutie ¹ geweest. Vergeleken met de desorptie gebaseerde MSI technieken (zoals DESI en LAESI), de kleine tip grootte van de interne-sonde maakt een meer robuuste en efficiënte oppervlaktevloeistof micro-extractie wordt uitgevoerd met een klein oppervlak, wat leidt tot een hoge ruimtelijke resolutie van 8,5 micrometer, die tot de hoogste zijn weliswaar via omgevingstemperatuur MSI ¹⁵ technieken. Bovendien, aanpassing van de bestanddelen van de bemonstering oplosmiddel geeft extra flexibiliteit om de experimenten. Bijvoorbeeld bemonstering oplosmiddelen bevattende reagentia (bijvoorbeeld dicationic verbindingen) gebruikt reactieve MSI experimenten, waardoor een aanzienlijke toename van het aantal geïdentificeerde metabolieten per experiment ^20. Het andere voordeel van de single-sonde is de geïntegreerde ontwerp, dat het bedieningsgemak biedt gedurende de hele data-acquisitie proces. Omdat de afstand tussen de naaldpunt en het oppervlak weefsel is zeer gevoelig voor ion signaalintensiteit en stabiliteit, het verkrijgen van een vlakke weefselsectie en geleidende oppervlaktelaag afvlakking aanpassing van de afstand variantie te minimaliseren is een sleutel voor hoogwaardige MSI experimenten. Hieruit volgt dat de single-probe MSI technieken zijn niet geschikt om een ​​hoge ruimtelijke MS beelden van oneffen oppervlakken te verkrijgen.

Naast het vervaardigen van een hoge kwaliteit probe zorgvuldig afstemmen van het instrument is essentieel voor een succesvolle MSI experiment. Van alle afstemstappen, om de hoogte van de punt enkele sonde boven de weefselsectie oppervlak de meest kritische is. Het instellen van de hoogte probe, pomp de bemonstering oplosmiddel en zet de ionisatiespanning, zodat alleen het oplosmiddel achtergrond ionen signalen OBSERV kaned. controleren wordt deze verandering van het massaspectrum terwijl de probe-afstandsvlak zorgvuldig verminderen door het opheffen van de gemotoriseerde Z-fase tot sterke en stabiele ionen signalen van weefselsectie kan worden waargenomen; deze hoogte probe wordt gebruikt voor MSI gegevensverzameling tijdens het experiment. Bovendien, een geoptimaliseerde oplosmiddel stroomsnelheid is essentieel voor MSI experimenten. Stel het debiet met de geoptimaliseerde probe hoogte. Zorg ervoor dat er geen oplosmiddel verspreid over het weefsel oppervlak (dat wil zeggen, debiet te hoog is) of de vorming bubbel in de nano-ESI emitter (dat wil zeggen, het debiet te laag is).

De single-sonde is een multifunctioneel apparaat voor bioanalyse. Naast de MSI experimenten, is het in staat zijn die vrijwel in real time in-situ SCMS gedetailleerde chemische informatie van levende eukaryote cellen ^16, hetgeen een groot voordeel ten opzichte van andere vacuüm opheldering gebaseerd SCMS technieken (zoals MALDI ¹⁰ en SIMS ²¹ ). De geringe omvang van de punt van de sonde geeft de mogelijkheid tot een levende eukaryotische cel worden ingebracht en te extraheren en ioniseren de intracelluaire onmiddellijk MS analyse. Evenzo kan de bemonstering oplosmiddelen bevattende reagentia (bijvoorbeeld dicationic verbindingen) worden gebruikt in de experimenten SCMS en een breder scala van celbestanddelen kan in een levende cel dan ooit worden gedetecteerd (lopend onderzoek, gegevens niet getoond). Hoewel de real-time analyse van de chemische profielen van levende enkele cellen, als gevolg van de cel binnendringen van membraan en extractie van cellulaire inhoud ervan, zullen de cellen onderzocht worden gedood na het experiment, hetgeen impliceert dat de één-probe SCMS techniek nog een destructieve methode. Bovendien kan de sondepunt en nano-ESI emitter in de single-probe gemakkelijk verstopt voor onervaren gebruikers. Om de kans op verstopping apparaat te verminderen, zorgen voor om te voorkomen dat het aanraken van de kern bij het plaatsen van de punt single-sonde in een cell. Bij verstopping kan de inrichting worden geregenereerd door het opwarmen van de verstopte sondetip of nano-ESI emitter met een zelfgebouwde verwarmingselement ^16. Een andere beperking van de interne probe SCMS techniek is dat slechts het kleefmiddel cellen (dat wil zeggen, zijn cellen gehecht aan oppervlakken) kunnen worden geanalyseerd met behulp huidige opstelling. Echter, door het opnemen van de cel manipulatiesysteem in de enkele-probe MS inrichting bredere celtypen kunnen worden bestudeerd in de toekomst.

Vergelijkbaar met de MSI experiment, het verkrijgen van een hoge kwaliteit probe en een geoptimaliseerde oplosmiddel stroomsnelheid is essentieel voor SCMS studies. Bij het ​​stemmen van het oplosmiddel stroomsnelheid, wordt de punt single-sonde geplaatst boven het monster (dat wil zeggen, geen contact met de cel of het kweekmedium), en ervoor te zorgen dat er geen oplosmiddel druipen van de sonde of de vorming bubbel in de nano-ESI emitter.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Single-probe fabricage
Dual bore kwarts buis, 1.120’’ × 0.005” × 12”	Friedrich & Dimmock, Inc, Millville, NJ	MBT-005-020-2Q
Micropipette laser puller	Sutter Instrument Co., Novato, CA	Model P-2000
Gevuse silicak haarbuis, ID: 40 µm, OD: 110 µm	Molex, Lisle, IL	TSP040105
UV uithardingshars	Prime Dental, Prime-Dent, Chicago, IL, USA	Artikelnummer 006.030
LED UV-lamp	Foshan Liang Ya Dental Equipment, Guangdong, China	LY-C240
Epoxyhars	Devcon, Danvers, MA	Onderdeelnummer 20945
Inline MicroFilter	IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL	M-520
Microunion	IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL	M-539
Microscoopglasplaat (glas)	C & A Scientific - Premiere, Manassas, VA	9105
Spuit	Hamilton, Reno, NV	1725LTN 250UL
Massenspectrometer
LTQ Orbitrap Massaspectrometer	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	LTQ Orbitrap XL
Xcalibur 2.1 Software	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	XCALIBUR21
Fance Stage Control	Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA
MSI QuickView	Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA
Contactsluitingsapparaat
USB-6009 Multifunction DAQ	National Instruments, Austin, TX	779026-01
DR-5V SDS Relais	Panasonic, Kadoma, Japan	DR-SDS-5
Logic Gates 50 Ohm Line Driver	Texas Instruments, Dallas, TX	SN74128N
Single-probe setup
Gemotoriseerde lineaire fase en controller (3 sets)	Newport, Irvine, CA	Conex-MFACC
Miniatuur XYZ-fase	Newport, Irvine, CA	MT-XYZ
Vertaal XY-fase	ThorLab, Newton, NJ	PT1 en PT102
Thermo LTQ XL ionbron interfaceflens	New Objective, Woburn, MA	PV5500
Digitaal stereomicroscoop, 250X - 2.000X	Shenzhen D&F Co., Shenzhen, China	Supereyes T004
USB Digitale Fotografie Microscoop	DX.com, HongKong, China	S02 25~500X
Spuitpomp	Chemyx Inc., Stafford, TX	Nexus 3000
Solid Aluminium Optisch Broodbord, 8" x 8" x 1/2"	Thorlabs, Newton, NJ	MB810
Flexibele klemhouder	Siskiyou, Grants Pass, OR	MXB-3h
Solventen
Methol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	34860 Chromasolv
Water	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	W4502
Acetonitrile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	34967 Chromasolv
Celcultuur
Dulbecco’s Gemodificeerde Adelaars Medium (DMEM)	Cellgro, Manasas, VA	10-013-CV
10% hitte-inactiveerd foetaal bovien serum (FBS)	Gibco/Life Technologies, Long Island, NY	10100-139
Penicilline/Streptomycine	Cellgro, Manasas, VA	30-002-CI
10 mM HEPES (pH 7.4)	Cellgro, Manasas, VA	25-060-CI
Fosfaat Buffered Saline (PBS)	Cellgro, Manasas, VA	46-013-CM
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	12604-013
12-wels platen	Corning Inc., Corning, NY	Falcon 351143
T25 flacon	Corning Inc., Corning, NY	Falcon 3055
Micro Cover Glasses, Round, No. 1	VWR International, Radnor, PA	48380-046
DMSO (Dimethyl Sulfoxide)	VWR International, Radnor, PA	BDH1115-1LP
Weefsel beeldvorming
Cyro-Cut Microtome	American Optical Coporation
Tissue-Tek, Optimum snijtemperatuur (OCT)	Sakura Finetek Inc., Torrance, CA	4583
Microscoopglasplaat (polycarbonaat)	Science Supply Solutions, Elk Grove Village, IL	P11011P