Methodenartikel

Een methode te richten en te isoleren Airway-innerveren sensorische neuronen in Muizen

13K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53917

⸱

19 april 2016

 , 
1Department of Cellular & Molecular Physiology, Yale University, 2Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Organspecifieke sensorische neuronen zijn moeilijk te identificeren. Fast Blue tracing wordt gebruikt om nodose neuronen die de luchtwegen innerveren te identificeren voor celsortering. Gesorteerde nodose neuronen worden gebruikt om hoogwaardig ribonucleïnezuur (RNA) te extraheren voor sequencing. Met behulp van dit protocol wordt de genexpressie van specifieke luchtwegneuronen bepaald.

Samenvatting

Somatosensorische zenuwen transduceren thermische, mechanische, chemische en schadelijke stimuli door zowel endogene als milieufactoren. De cel lichamen van deze afferente neuronen bevinden zich in de sensorische ganglia. Sensorische ganglia innerveren een specifiek orgaan of deel van het lichaam. Bijvoorbeeld, de dorsale wortel ganglia (DRG) bevinden zich in de wervelkolom en uitbreiden processen in het lichaam en ledematen. De nervus ganglia bevinden zich in de schedel en innerveren het gezicht, en de bovenste luchtwegen. Vagale afferente vezels van de nodose ganglia zich over de gehele darmen, hart en longen. De nodose neuronen onder controle van een divers scala aan functies, zoals: ademhaling, irritatie van luchtwegen en hoest reflexen. Zo begrijpen en hun functie te manipuleren, is het essentieel om de luchtwegen specifieke neuronale subpopulaties identificeren en te isoleren. Bij de muis, worden de luchtwegen blootgesteld aan een fluorescerende tracer kleurstof, Fast Blue voor retrograde traceren van luchtweg-specifieke nodosus neurons. De nodose ganglia worden gescheiden en fluorescentie geactiveerde cel (FAC) sortering wordt gebruikt om kleurstof positieve cellen te verzamelen. Vervolgens wordt hoogwaardige ribonucleïnezuur (RNA) geëxtraheerd uit kleurstof positieve cellen voor de volgende generatie sequencing. Deze methode luchtwegen specifieke neuronale genexpressie bepaald.

Inleiding

Somatosensorische zenuwen transduceren thermische, mechanische, chemische en schadelijke stimuli door zowel endogene als milieufactoren. De cellichamen van deze afferente neuronen zijn in sensorische ganglia, zoals de dorsale wortel, trigeminale of knobbelige ganglia. Elke sensorische ganglion innerveert specifieke gebieden van het lichaam en bevat cellen die afzonderlijke organen en weefsels innerveren binnen dat gebied. Bijvoorbeeld, de dorsale wortel ganglia (DRG) bevinden zich in de wervelkolom en uitbreiden processen in het lichaam en ledematen, terwijl de trigeminale ganglia liggen in de schedel, bevattende neuronen dat het gezicht, ogen, meninges of bovenste luchtwegen 1 innerveren, 2. De nodose ganglia van de vagus zenuw in de hals onder de schedel en bevat cellichamen die zenuwvezels uitstrekken door het gehele maagdarmkanaal, hart en onderste luchtwegen en longen 3. Bij mensen staat de knobbelige ganglion alleen is echter in de muis is gefuseerdde jugularis ganglion, die ook innerveert de longen 4. Deze gefuseerde ganglion wordt vaak de jugulaire / nodose complex vagale ganglion of gewoon knobbelige ganglion 5. Hier wordt aangeduid als de knobbelige ganglion.

Afferente vezels van de nodose gegevens doorgeven van de ingewanden naar de kern van de solitaire zenuwvezelstreng (NTS) in de hersenstam. Zintuiglijke dit unieke ganglion stuurt een verscheidenheid aan functies, zoals darmmotiliteit 6, 7 hartslag, ademhaling 8,9 en irriterend geactiveerde respiratoire respons 10,11. Met deze verscheidenheid aan functies en geïnnerveerde organen, is het essentieel te richten en te isoleren orgaan-specifieke subpopulaties van de knobbelige ganglion om afzonderlijke zenuwbanen bestuderen. Echter, gezien de geringe omvang van de nodose en het beperkte aantal neuronen die het bevat dit is geen sinecure. Elke muis knobbelige ganglion bevat ongeveer 5.000 neuronen 12naast een uitgebreide populatie ondersteunen satellietcellen. Van de 5000 nodose neuronen, slechts 3-5% innervate de luchtwegen. Daarom is elke functionele, morfologische of moleculaire veranderingen binnen de luchtweg-zenuwcellen, als gevolg van respiratoire stimulatie of pathologieën, gaan verloren in de dicht op elkaar gepakte knobbelige ganglion.

Om dit probleem op te lossen, werd een werkwijze ontwikkeld voor het identificeren en isoleren van neuronen die de luchtwegen innerveren. De luchtwegen werden blootgesteld aan een fluorescerende tracer kleurstof de volgende innerverende nodose neuronen te identificeren. Fast Blue werd opgepikt door neuronen en reist snel hun cellichamen waar het wordt bewaard tot acht weken 13-15. Eenmaal geïdentificeerd, een zachte, maar efficiënte, dissociatie protocol werd gebruikt om kleurstof etikettering en de levensvatbaarheid van de cellen te behouden voor fluorescentie geactiveerde cel (FAC) sorteren. Gesorteerde cellen worden gebruikt om hoge kwaliteit ribonucleïnezuur (RNA) extract genexpressie of f bepalenof andere stroomafwaartse moleculaire analyse. Dit protocol biedt een nuttige en robuuste techniek voor het isoleren van sensorische neuronen die een weefsel van belang innerveren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van Duke University.

1. intranasale toediening van Fast Blue

Voor Fast Blue, het beheer van de kleurstof ten minste 2 dagen voor euthanasie de muis. De kleurstof zal aanhouden tot acht weken.

  1. Verdoven van de muis met licht inhalatie-anesthesie (2,5% sevofluraan) tot ademhaling begint te vertragen.
  2. Gebruik een 200 ul pipet met gefilterd tips langzaam druppelen 40 pl kleurstofoplossing (0,4 mM Fast Blue, 1% dimethylsulfoxide, DMSO, in fosfaatgebufferde zoutoplossing, PBS) in het neusgat, pauzeren soms de muis waarborgen wordt aanzuigen de oplossing (Figuur 1A).
  3. Houd de muis verticaal, hoofd omhoog, en zachtjes masseren van de borst te zorgen voor de kleurstof verspreidt door de longen.

2. Voorbereidingen op Dissection and Analysis Day

  1. Bereid 10 ml0; Ganglia Dissociatie Solution (GADS) door het combineren van de bestanddelen zoals gespecificeerd in Tabel 1.
  2. RNA-extractie uit te voeren in een speciale lab omgeving. Voor het begin van het experiment te reinigen oppervlakken met 70% ethanol, 10% bleekmiddel en RNase decontaminatie reagens. Dit omvat de RNA-centrifuge, elke tube racks, en pipetten. Zorg ervoor dat er speciale filter tip dozen voor slechts RNA gebruik. Gebruik deze apparatuur en het gebied niet voor DNA voorbereiding, omdat dit de monsters verontreinigen.
  3. Meng verse 70%, en 80% ethanol met RNase-vrij water. Bereid 1 ml per monster voor gebruik in RNA-extractie.
Ingrediënt Bedrag
Geavanceerde DMEM / f12 9,5 ml
glutamine 100 gl
HEPES (10 mM) 100 gl
N2 supplement 100 gl
B27 (geen vitamine A) 200 gl
NGF (50 ug / ml) 10 gl

Tabel 1. mengsel van reagentia voor ganglia Dissociatie Solution (GADS).

3. Dissection Procedure

  1. Vul 1,5 ml buizen met 500 ul GADS, een voor elke experimentele monster, een voor een positieve sorterend controlesignaal en een voor een negatieve sorterend controlesignaal. Store buizen op ijs gedurende dissectie.
  2. Ontleden de knobbelige ganglion en maak twee gedeeltelijke bezuinigingen op dissociatie te vergemakkelijken, zet het dan in de experimentele monsterbuis. Raadpleeg de volgende Jove protocol voor dissectie van de nodose ganglia 16 en DRG 17.
  3. Ontleden en gedeeltelijk ongelabelde ganglia, zoals de dorsale wortel ganglia (DRG) gesneden, het sorteren controles. Gebruik twee ganglia voor de positieve controle en twee Ganglieen voor de negatieve controle.
  4. Om voldoende nodose neuronen voor een succesvolle sortering te verkrijgen, te combineren ganglia van 5 muizen in een experimentele monster buis met gads.

4. Sensorische ganglia Dissociatie

  1. Pipet uit 500 ul Gads, waardoor ganglia in de buis. Was ganglia eens door toevoeging van 1 ml PBS, wacht ganglia om zich te vestigen op de bodem van de buis, dan pipet uit PBS.
  2. Voeg 1 ml GADS en 22 ul enzym digestie (collagenase I / II en protease mix, 2,5 mg / ml in H2O) aan elke buis.
  3. Voeg 20 ul Fast Blue (5,26 mM) aan de positieve controle buis.
  4. Zet de buizen in een waterbad of verwarmingsblok reeds bij 37 ° C.
    Opmerking: De tijd van ganglia digestie afhankelijk van de leeftijd van de spijsvertering enzym. Binnen 1 maand na oplossen van het enzym digestie, verteren 30 min, binnen 2-6 maanden verteren 45 min. Als het enzym dan 6 maanden oud, verteren ganglia fof 60 min.
  5. Elke 15 min schudden buizen kort en flick ze ganglia zorgen, worden gedekt door de oplossing.
  6. Terwijl ganglia worden verteerd, bereid dichtheidsgradiënten met een deeltjes- oplossing (colloïdale silicadeeltjes bekleed met polyvinylpyrrolidon).
    1. Meng 12% deeltje oplossing Gads, 500 ul per monster.
    2. Meng 28% deeltje oplossing Gads, 500 ul per monster.
    3. Langzaam en voorzichtig voeg 400 ul 12% geconcentreerde oplossing boven 400 ul 28% 's oplossing dichtheid in een nieuwe 1,5 ml buis voor elk monster. Sta niet toe dat de twee lagen te mengen. Twee verschillende lagen moet zichtbaar zijn in de buis; een donkerder dan de andere.
  7. Terwijl ganglia worden verteerd, labelen nieuwe 1,5 ml collectie buizen voor het sorteren van (een Fast Blue positieve en één Fast Blue negatief buis per sorteren monster). Afhankelijk van de sorteerinrichting eisen moeten deze buizen afneembare deksels zodat niet interferE met de cel sorter.
  8. Na de juiste spijsvertering tijd, verwijder gads bij de spijsvertering enzym en wassen ganglia tweemaal met 1 ml PBS. Voeg 200 ul vers GADS aan elke buis.
  9. Gebruik een pipet 200 ul, ingesteld op 100 gl volume en ganglia pipet op en neer meerdere malen cellen splitsen. Herhaal dit totdat er geen intact stukje weefsel wordt gezien. Vermijd het creëren van bubbels in de oplossing.
  10. Pass gescheiden cellen door een 70 um cel zeef.
  11. Voeg nog een 100 ul gads naar de originele dissociatie buis te halen eventuele resterende verdwaalde cellen links en laat de extra oplossing door de cel zeef. Met behulp van een nieuwe pipet tip, het verzamelen van alle resterende-cel met vloeistof die door de zeef is gepasseerd en klampte zich vast aan het gaas. Het eindvolume van de cellen gesuspendeerd in 300 pl GADS.
  12. laag voorzichtig 300 ul van cellen bovenop de eerder dichtheidsgradiënt. Vermijd bubbels en mengen van cells met de dichtheid lagen.
  13. Centrifugeer 10 minuten bij 2900 xg bij kamertemperatuur.
  14. Terwijl cellen in de centrifuge, meng lysis buffer (1 ml per experimentele monster) als volgt: 10 pl 2-mercaptoethanol in 1 ml buffer RLT (van RNA extractie kit).
    1. Voeg 300 ul lysisbuffer naar Fast Blue positieve verzameling buis en 600 pi naar Fast Blue negatieve collectie buis (buizen label uit stap 4.7). Dit volume hangt af van het aantal cellen verwachting te ontvangen. Voor <2.000 cellen, voeg 300 ul, voor> 7000 cellen toe te voegen 600 ul. Dit zal de sortering sheath vloeistof niet significant Verdun de lysisbuffer.
  15. Zodra centrifugeren is voltooid, verwijder voorzichtig en gooi de top 700 ul laag. Deze laag bevat de meeste celresten die anderszins verstoren celsortering.
  16. Voeg 700 ul vers gads om de resterende cel bevattende oplossing en pipette boven en beneden een paar keer om te mengen.
  17. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 2900 xg om de cellen te pelleteren.
  18. Terwijl cellen in de centrifuge, meng sorteren GADS (500 ul per monster) door het toevoegen van 5 gl DNase (10 mg / ml) tot 1 ml GADS.
  19. Zodra centrifugeren wordt gedaan, verwijder voorzichtig en gooi supernatant, waardoor de cel pellet.
  20. Resuspendeer celpellet in 200-300 gl sorteren gads door op en neer pipetteren met een pipet 1000 ul ingesteld op 200 gl meerdere malen. Leg monsters op het ijs. De cellen zijn nu klaar om te worden gesorteerd.

5. Fluorescentie Activated Cell (FAC) sorteren

Opmerking: Dit gedeelte vereist operationele kennis van een FACS sorter of de hulp van geschoold personeel.

  1. Voeg 1 ul propidiumjodide (PI) voorraadoplossing (50 ug / ml) aan elk monster te testen voor cellevensvatbaarheid. Split negatieve controle in 2 tubes, één met PI en één zonder. PI bindt DNA alleen in dode cellen. Alsna de eerste soort is er geen dode cellen label, het gebruik van PI is niet noodzakelijk.
  2. Transport cellen om flowcytometrie instrument, bijv., BD FACS AriaII loopt Diva 8-software, op ijs.
  3. Omdat de cel grootte is variabel in deze populatie, gebruik maken van een groot mondstuk (100 pm) voor het sorteren. Om de hoeveelheid stress de cellen ervaring verlagen en de levensvatbaarheid van de cellen te gebruiken lage druk (20 psi).
  4. Gebruik de FACS sorter software om de analyse percelen, voorwaartse verstrooiing, zijwaartse verstrooiing (SSC), Fast Blue en PI, indien nodig.
  5. Om opnieuw te schorten cellen, zachtjes vortex het monster kort voordat deze in de sorter.
  6. Begin met de negatieve controle, geen Fast Blauw of PI, de gate drempel (Figuur 2A) ingesteld. Dit zal de hoeveelheid autofluorescentie in de celpopulatie te bepalen. Optioneel: Voer het negatieve monster met PI vast te stellen of er sprake is van een populatie van dode cellen.
  7. Sorteer de positieve controle monster (incubated met Fast Blue), een vergoeding parameters in te stellen.
  8. Zodra de poorten en parameters zijn ingesteld, begint het sorteren van de proefmonsters. Monsters worden gesorteerd in de voorbereide verzamelbuizen bevattende RNA lysisbuffer.
  9. Blijf gesorteerde monsters op ijs tot de celsortering voltooid.
  10. Begin RNA-extractie stap onmiddellijk na de cellen worden gesorteerd.

6. RNA-extractie

  1. Vortex gesorteerd cellen in lysisbuffer gedurende 1 min gehomogeniseerd.
  2. Voeg 1 volume van 70% ethanol en mix door en neer te pipetteren meerdere malen.
  3. Transfer tot 700 ul van het monster op een spinkolom. Centrifugeer gedurende 15 seconden bij 8000 x g. Gooi het doorstroomkanaal.
    1. Herhaal dit tot het totale volume van het monster gecentrifugeerd kolom gevoerd.
  4. Voeg 350 ul Buffer RW1 verderspelen RNA zuiveringsproces, waaronder DNase behandelingsstap volgens protoco de fabrikantl voor cellen.
  5. Zodra RNA werd geëxtraheerd, test de RNA kwaliteit met een microfluïdische elektroforese volgens specificaties van de fabrikant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met deze methode wordt luchtweg-zenuwcellen gemerkt door intranasaal indruppelen Fast Blue (Figuur 1A). Na twee dagen, Fast Blue gemerkte cellen blijken in het nodose ganglia (Figuur 1C). Deze cellen maken op een 3 - 5% van de totale bevolking van de neuronale nodose ganglia. Andere retrograde kleurstoffen die zijn gebruikt voor dit doel omvatten Dil (1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat) en Fluorogold. Lung bl...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor luchtweg-zenuwcellen gericht in de nodose ganglia van de nervus vagus. Eenmaal gelabeld, worden de ganglia voorzichtig los om optimaal te behouden cel aantallen en de levensvatbaarheid. Deze neuronen zijn dan FAC gesorteerd direct in lysis buffer en RNA geëxtraheerd. De betekenis van dit protocol is de mogelijkheid te richten, isoleren en bewaren van de kwaliteit van een organoleptische celpopulatie. Genexpressie wordt in dit kleine populatie van neuronen en orgaan-specifieke f...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Ondersteund door NIH-subsidie ​​R01HL105635 te SEJ. De auteurs willen graag bedanken Diego V. Bohórquez voor technisch advies. We danken ook R. Ian Cumming voor technische bijstand en het uitvoeren van de flowcytometrie in het Duke Human Vaccin Instituut Onderzoek flowcytometrie Shared Resource Facility (Durham, NC). Flowcytometrie werd uitgevoerd in het Regionaal Biocontainment Laboratory van Duke, die gedeeltelijke ondersteuning voor de bouw van de National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (UC6-AI058607) ontvangen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Fast BluePolysciences, Inc.17740-2voorraad 2 mg/ml in water
NeuroTrace 530/615 red Nissle stainLife TechnologiesN21482
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificD128-500
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca en Mg vrijGibco14190-144
Advanced DMEM/F12Gibco12634-010
glutamine (Glutamax)Gibco35050-061
HEPESGibco15630-080
N2Gibco17502-048
B27 (geen vitamine A)Gibco12587-010
Nerve Growth Factor (NGF)SigmaN6009voorraad 50 µg/ml in PBS/10% FBS
digestie-enzym, Liberase DH Research GradeRoche5401054001voorraad 2,5 mg/ml in water
deeltjesoplossing (Percoll)SigmaP1644-25ML
VerwarmingsblokLabNet
70 µm celzeefFalcon352350
Absolute Ethanol (200 proof)Fisher ScientificBP2818-500
RNase-vrij waterFisher ScientificBP2484-100
RNase decontaminatiereagens, RNase AWAYinvitrogen10328-011
2-mercaptoethanolVWREM-6010
RNA-extractiekit, RNeasy Plus Micro KitQiagen74034
DNase-kit, RNase-Free DNase SetQiagen79254
DNaseSigmaD5025-15KUvoorraad 10 mg/ml in 0,15 M NaCl
Propidium JodideSigmaP4170-10MGvoorraad 10 µg/ml in PBS
Microfluidic elektroforesesysteem (TapeStation 2200)Agilent

Referenties

  1. Manteniotis, S., et al. Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia. PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).
  2. Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse. BMC Neurosci. 14 (1), 21(2013).
  3. Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
  4. Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia. J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).
  5. Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways. J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).
  6. Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).
  7. Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. Neurochemistry of the nodose ganglion. Prog Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).
  8. Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing. Cell. 161, 1-12 (2015).
  9. Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. Nodose ganglia-modulatory effects on respiration. Physiol Res. 62, 227-235 (2013).
  10. Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents. Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).
  11. Bautista, D. M., et al. TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).
  12. Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin. Neuroscience. 137 (2), 531-536 (2006).
  13. Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Res. 1319, 60-69 (2010).
  14. Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
  15. Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).
  16. Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat. J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).
  17. Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels. J Vis Exp. (82), e50782(2013).
  18. Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus. Am J Physiol - Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).
  19. Kwong, K., Lee, L. -Y. PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli. J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).
  20. Joachim, R. A., et al. Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways. Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).
  21. Kaan, T. K. Y., et al. Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats. Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).
  22. Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon. Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).
  23. Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).
  24. Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Luchtweginnerverende neuronenisolatie van nodose gangliaFast Blue tracingfluorescentie geactiveerde cel sorteringoplossen van gangliadichtheidsgradi ntcentrifugatieRNA extractieprotocolmicroflu dische elektroforesevagale afferente neuronenperifere neurobiologie

Gerelateerde artikelen