Marginerende leverleukocyten vertonen unieke kenmerken en verschillende immunologische functies in vergelijking met andere leukocytenpopulaties. Hier beschrijven we een methode voor selectieve oogst van deze specifieke levercelpopulatie, door geforceerde perfusie van de lever van ratten of muizen. Marginerende leverleukocyten lijken cruciaal te zijn bij het bepalen van de vatbaarheid voor levergerelateerde ziekten en metastasen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Selectief oogsten van Marginating-lever leukocyten
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Marginerende-hepatische (MH) leukocyten (leukocyten die zich hechten aan de sinusoïden van de lever) bleken een unieke samenstelling en kenmerken te vertonen in vergelijking met leukocyten van andere immuuncompartimenten. Concreet wijzen bewijzen op een duidelijk pro- en anti-inflammatoir profiel van de MH-leukecytenpopulatie en een hogere cytotoxiciteit van leverspecifieke NK-cellen (namelijk pitcellen) in vergelijking met circulerende of splenische immuuncellen bij zowel muizen als ratten. De hier gepresenteerde methode maakt selectieve oogst van MH-leukocyten mogelijk door geforceerde perfusie van de lever bij muizen en ratten. In tegenstelling tot andere methoden die worden gebruikt om lever-leukocyten te extraheren, waaronder weefselvermaling en biologische afbraak, levert deze methode uitsluitend leukocyten op uit de lever-sinusoïden, onverhoeld door cellen uit andere levercompartimenten. Bovendien behoudt de perfusietechniek de integriteit en het fysiologische milieu van MH-leukocyten beter, waardoor bekende fysiologische reacties op weefselverwerking worden gespaard. Aangezien veel circulerende kwaadaardige cellen en geïnfecteerde cellen worden vastgehouden tijdens het passeren door de lever-sinusoïden, fysiek interactie hebbend met endotheelcellen en residente leukocyten, is de unieke MH-leukecytenpopulatie strategisch gelegen om te interageren, identificeren en reageren op afwijkende circulerende cellen. Daarom kan selectieve oogst van MH-leukocyten en hun studie onder verschillende omstandigheden onze begrip van de biologische en klinische betekenis van MH-leukocyten bevorderen, specifiek met betrekking tot circulerende afwijkende cellen en levergerelateerde ziekten en kankermetastasen.
Inleiding
De lever sinusoïden bevatten talrijke leukocyt subtypen van verschillende immuun activiteiten kritisch voor het organisme. Zo worden marginating lever (MH) natural killer (NK) cellen, ook bekend als pitcelen kenmerk morfologisch als grote granulaire lymfocyten (LGLs) en functioneel als leukocyten spontane cytotoxische capaciteit dat hepatische weerstand tegen de vestiging van bloed- gedragen tumor uitzaaiingen. Het doel van de werkwijze die hierin wordt selectief oogsten van MH leukocyten, om deze belangrijke en unieke celpopulatie (en immuuncompartiment) bestuderen inschakelen en het effect van verschillende manipulaties (bijv immuunactivatie) de volgende specifieke cellen te helderen.
Ondanks het feit dat immuniteit voor een zich ontwikkelende primaire tumor te elimineren, bewijsmateriaal kankerpatiënten en diermodellen geven aan dat het immuunsysteem regelen circulerende tumorcellen, micrometastasen en residual disease gedugh-cel gemedieerde immuniteit (CMI). Er bestaat echter een duidelijke inconsistentie tussen de in vivo capaciteit en in vitro studies bij mensen en bij dieren die aantonen dat de meeste autologe tumorcellen resistent tegen cytotoxiciteit van circulerende leukocyten of milt 1,2. Deze inconsistentie kan worden toegeschreven, ten minste gedeeltelijk, om de in vivo er een afzonderlijke leukocyten subpopulatie, namelijk de marginating-lever (sinusoïden) leukocyten en de subpopulatie van geactiveerde NK-cellen, namelijk pitcelen 3. Inderdaad, ongepubliceerde gegevens uit ons laboratorium aangetoond dat in F344 ratten syngene tumorcellen (MADB106), die bestand zijn tegen circulerende leukocyten en milt werden gevonden, werden gelyseerd door MH-NK-cellen 4. Aldus kunnen tumorcellen die zogenaamd "NK-resistent" circulerende leukocyten worden gecontroleerd door MH-NK-cellen. Opmerkelijk, in muizen de verhoogde activiteit van de MH-NK is duidelijk alleen na in vivo immuunstimulatie (bijvoorbeeld door gebruikmaking van Poly I: C of CpG-C) 5.
Lever-specifieke NK-cellen (MH-NK) bevinden zich binnen de sinusvormige lumen, die vastzit aan de endotheelcellen en Kupffer cellen. MH-NK-cellen uitsluitend gekenmerkt door dichte bolvormige korrels en-rod uitgeboord vesicles 6, waarbij zuurfosfatase als lysosomale enzymen en perforine en granzymen bevatten bioactieve stoffen 7,8. Vergeleken met circulerende NK-cellen, NK-MH-cellen vertonen een grotere en kleinere granules en blaasjes 9-11. Onder ontstekingsaandoeningen werden MH-NK-cellen aangetoond hogere expressie vertonen van LFA-1 12 ten opzichte van circulerende NK cellen. Deze verhoogde expressie kan een mechanisme waardoor MH-NK-cellen zijn cytotoxischer tegen sommige tumorcellen dan circulerende NK cellen 13,14 vormen. nterestingly, na in vitro incubatie met interleukine (IL) -2, MH-NK-cellen worden vergroot, enhet aantal en de grootte van de korrels te vergroten, die stroken met een fi le of lymfokine geactiveerde killercellen (LAK) cellen 15.
Actieve MH leukocyten kan niet alleen worden verkregen door standaard lever leukocyten oogstmethodes, die gebaseerd zijn op het slijpen en biologische afbraak van het weefsel. Onze aanpak perfusie hierin beschreven heeft twee belangrijke voordelen ten opzichte van de standaard methoden. Ten eerste, de perfusie benadering oogst MH selectief leukocyten voorkomen van besmetting door andere leukocyten uit andere lever compartimenten. Ten tweede, de perfusie techniek beter behoudt de integriteit, de activiteit en de fysiologische milieu van MH leukocyten, anders dan het weefsel verwerking benaderingen die cellen beschadigen of hun morfologie te veranderen en door weefselbeschadiging, het induceren van de afgifte van verschillende factoren die duidelijk moduleren immuunsysteem activiteit.
De lever is een belangrijk doelwit orgaan voor kanker metastase eennd voor verschillende infecties 16. Zoals MH cellen unieke kenmerken is het belangrijk om deze specifieke populatie onder verschillende omstandigheden te bestuderen met betrekking tot deze pathologieën. Zo is het waard op te merken dat systemische activering van het immuunsysteem door verschillende BRM (bijvoorbeeld poly I: C of CpG-C) bleken te activeren MH-leukocyten meer dan 5 circulerende leukocyten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Ethiek Verklaring: Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) goedgekeurd bij Tel Aviv University.
1. Ratten Protocol
- voorbereidingen
- Bereid gehepariniseerde oplossing PBS (30 eenheden / ml) bij kamertemperatuur (KT) te gebruiken door toevoeging van 30 eenheden conserveermiddel heparine per ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) 1x oplossing. Bereken 35 ml per dier.
- Pass gehepariniseerde PBS door de peristaltische pomp lijnen en de vlinder naalden om luchtbellen te verwijderen.
- Steriliseren chirurgische instrumenten - 2 scharen, forceps afgestompte randen, 2 hemostats en tand-weefsel tang (autoclaaf bij 121 ° C gedurende ten minste 30 min de zwaartekracht (droog) instelling).
- Perfusie van de lever en de collectie van MH-leukocyten
- Euthanaseren het dier door een overdosis van 8% isofluraan. Uit voorzorg, plaats een 50 ml buis met een isofluraan-soaked pad rond de rat hoofd tot het openen van de borstholte.
- Open de peritoneale en borstholte naar de lever en het hart-complex onmiddellijk bloot te leggen na het stoppen van de ademhaling. Vermijd bloeden door dit proces.
- In het bijzonder, beginnen de incisie in de onderbuik middellijn punt, zonder deze te beschadigen interne organen, en de vooruitgang naar beide zijden schuin in de richting van de ribben, snijden via hen borst holte levels.
- Binnen ongeveer een minuut, verzamel zoveel mogelijk bloed (~ 6 ml van een 250 g dier) vanaf het rechter ventrikel in een injectiespuit.
- Klem de caudale vena cava met een hemostaat zo dicht mogelijk bij het hart, aan de collectie van het perfusaat mogelijk te maken.
- Trek de darmen en buiten het dier het recht van de experimentator, om de poortader bloot te leggen.
- Plaats een 25 G IV katheter, verbonden met een peristaltische pomp, in de poortader, zo staartvin mogelijk,maar rostraal van de milt ader.
- Plaats een 25 G vlindernaald, verbonden met een 5 ml spuit, in de inferior vena cava, caudaal van de hemostaat.
- Schakel de peristaltische pomp met een snelheid van ongeveer 3 ml / min en voorzichtig laat de eerste ml perfusievloeistof die zijn verontreinigd met bloed in de injectiespuit. Ga door tot het perfusaat kleur bochten bleke rode (ongeveer 5/3 ml). Merk op dat de kleur van de lever veranderen en ze lichtbruin.
- Zonder stoppen van de peristaltische pomp, vervangt de 5 ml oogsten spuit met een 20 ml spuit oogsten en laat minstens 20 ml lever perfusaat gebruik van een hogere snelheid van perfusie (tot 4 ml / min). Permanent toezicht op het perfusaat stroom in het verzamelen spuit, en vacuüm dat is te sterk (die de naald kunnen verstoppen door middel van het instorten van de vena cava muren) te vermijden.
- Perfusie beëindigen wanneer de kleur van de lever wordt lichtbruin.
- leukocyten Extraction
- Centrifugeer de perfusaat gedurende 10 min bij 400 xg, 24 ° C.
- Zuig het supernatant
- Voeg 10 ml PBS, centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min, en zuig de supernatant. Op basis van de studie doelen gebruiken voorbereiding zoals is, of extra zuiveringen (bv dichtheid-gradiënt scheiding) uit te voeren.
- In het bijzonder laag 4 ml perfusaat meer dan 4 ml van de dichtheid-gradiënt scheiding massa in een 50 cc polypropyleen centrifugebuis. Spin de buizen bij 754 xg, kamertemperatuur, gedurende 30 minuten met afbreken.
- Het verkrijgen van de mononucleaire lagen aan de dichtheid-gradiënt scheiding-supernatant interface van door handmatige pipetteren, wassen in PBS, en invoegen in een 5 ml buis.
2. Mouse Protocol
- voorbereidingen
- Bereid gehepariniseerde oplossing PBS (30 eenheden / ml) voor gebruik op kamertemperatuur (KT) door toevoeging van 30 eenheden conserveermiddel heparine per ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) 1x solution. Bereken 20 ml per dier.
- Pass gehepariniseerde PBS door de peristaltische pomp lijnen en de vlinder naalden om luchtbellen te verwijderen.
- Steriliseren chirurgische instrumenten - 2 scharen, forceps afgestompte randen, 2 hemostats en tand-weefsel tang (autoclaaf bij 121 ° C gedurende ten minste 30 min de zwaartekracht (droog) instelling).
- Perfusie van de lever en de collectie van MH-leukocyten
- Euthanaseren het dier door een overdosis van 8% isofluraan. Uit voorzorg, plaats een 15 ml buis met daarin een-isofluraan gedrenkte pad rond de muis hoofd tot het openen van de borstholte.
- Bevestig de ledematen van de muis om een bed.
- Open de peritoneale en borstholte naar de lever en het hart-complex onmiddellijk na het stoppen van de ademhaling bloot te leggen, waardoor de lagere aspect van het membraan intact (het creëren van een drainerende borstholte zwembad). Vermijd bloeden door dit proces.
- Specifiek start de snede in de ondersteabdominale middellijn point, zonder deze te beschadigen interne organen, en de vooruitgang naar beide zijden schuin in de richting van de ribben, snijden via hen borst holte levels.
- Pullout de darmen en buiten het dier het recht van de experimentator, om de poortader bloot te leggen.
- Plaats een 30 g naald, verbonden met een peristaltische pomp in de poortader rostraal van de milt ader.
- Snijd de onderste vena cava boven het membraan afvoer en verzameling van het perfusaat uit de borstholte mogelijk.
- Schakel de peristaltische pomp met een snelheid van ongeveer 3 ml / min en voorzichtig laat de eerste 3 ml perfusievloeistof die zijn verontreinigd met bloed uit de borstholte zwembad.
- Gooi dit perfusaat. Herhaal dergelijke wassen opnieuw als nodig, met zoutoplossing en daarna pas het verzamelen van perfusaat lever.
- Begint opnieuw perfusie aan een snelheid van 4 ml / min en 10 ml verzamelen van perfusaat uit de borstholte viaeen vlinder verbonden met een injectiespuit.
- Perfusie beëindigen wanneer de kleur van de lever wordt lichtbruin.
- leukocyten Extraction
- Centrifugeer het perfusaat gedurende 10 min bij 400 x g.
- Zuig het supernatant.
- Voeg 10 ml PBS, centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min, en zuig de supernatant basis studiedoelen Gebruik preparaat zoals is, of extra reinigingen (bijvoorbeeld dichtheidsgradiënt scheiding) voeren.
- In het bijzonder laag om de 4 ml perfusaat meer dan 4 ml van de dichtheid-gradiënt scheiding massa in een 50 cc polypropyleen centrifugebuis. Spin de buizen bij 754 xg, kamertemperatuur, gedurende 30 minuten met afbreken.
- Het verkrijgen van de mononucleaire lagen aan de dichtheid-gradiënt scheiding-supernatant interface van door handmatige pipetteren, wassen in PBS, en invoegen in een 5 ml buis.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In F344 ratten vergeleken we de cytotoxiciteit van MH-NK-cellen (vanuit de lever sinusoïden geforceerde leverperfusie) om cytotoxiciteit van de gehele lever celpopulatie na mechanisch malen van het leverweefsel, en de cytotoxiciteit van circulerende leukocyten. Alle celpreparaten werden ten minste 3 maal gewassen, zoals routine immunologische tests, en als doelwit cellijnen gebruikten we de allogene YAC-1 of syngene MADB106 doelwitcellijnen. Zoals aangegeven in figuren 1-...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De lever perfusie methode die hierin maakt een selectief oogsten en het bestuderen van de unieke populatie van marginating lever leukocyten. Lever- NK-cellen, ook wel pit cellen 3, vormen een onderscheidende NK cel populatie die in de lever sinusoïden wonen. Ze zijn te vinden in ratten, muizen 17 en bij de mens 18,19. Vergeleken met geïsoleerde perifere NK cellen pitcelen aangetoond hogere cytotoxiciteit tegen YAC-1 en CC531s doelwitcellijnen 20, werden naar een groter aantal ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs en dit werk werden ondersteund door NIH/NCI-subsidie # R01CA172138 (aan SBE).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26 G | |
| Butterfly needle | OMG | 21 G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| Hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| 22 W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp |
Referenties
- Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
- Benish, M., Melamed, R., Rosenne, E., Neeman, E., Sorski, L., Levi, B., Shaashua, L., Matzner, M., Ben-Eliyahu, S. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunologic Research. 58, 28-39 (2014).
- Wisse, E., van't Noordende, J. M., van der Meulen, J., Daems, W. T. The pit cell: description of a new type of cell occurring in rat liver sinusoids and peripheral blood. Cell Tissue Res. 173, 423-435 (1976).
- Vermijlen, D., et al. Hepatic natural killer cells exclusively kill splenic/blood natural killer-resistant tumor cells by the perforin/granzyme pathway. J Leukoc Biol. 72, 668-676 (2002).
- Gao, B., Radaeva, S., Park, O. Liver natural killer and natural killer T cells: immunobiology and emerging roles in liver diseases. J Leukoc Biol. 86, 513-528 (2009).
- Kaneda, K. Liver-associated large granular lymphocytes: morphological and functional aspects. Arch Histol Cytol. 52, 447-459 (1989).
- Podack, E. R., Hengartner, H., Lichtenheld, M. G. A central role of perforin in cytolysis? Annu Rev Immunol. 9, 129-157 (1991).
- Kamada, M. M., et al. Identification of carboxypeptidase and tryptic esterase activities that are complexed to proteoglycans in the secretory granules of human cloned natural killer cells. J Immunol. 142, 609-615 (1989).
- Wisse, E., et al. On the function of pit cells, the liver-specific natural killer cells. Semin Liver Dis. 17, 265-286 (1997).
- Bouwens, L., Remels, L., Baekeland, M., Van Bossuyt, H., Wisse, E. Large granular lymphocytes or "pit cells" from rat liver: isolation, ultrastructural characterization and natural killer activity. Eur J Immunol. 17, 37-42 (1987).
- Vanderkerken, K., et al. Origin and differentiation of hepatic natural killer cells (pit cells). Hepatology. 18, 919-925 (1993).
- Luo, D., et al. The role of adhesion molecules in the recruitment of hepatic natural killer cells (pit cells) in rat liver. Hepatology. 24, 1475-1480 (1996).
- Shresta, S., MacIvor, D. M., Heusel, J. W., Russell, J. H., Ley, T. J. Natural killer and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for the rapid induction of apoptosis in susceptible target cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 5679-5683 (1995).
- Luo, D., et al. Involvement of LFA-1 in hepatic NK cell (pit cell)-mediated cytolysis and apoptosis of colon carcinoma cells. J Hepatol. 31, 110-116 (1999).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of mouse liver-associated natural killer activity by biologic response modifiers occurs largely via rapid recruitment of large granular lymphocytes from the bone marrow. J Immunol. 143, 372-378 (1989).
- Schluter, K., et al. Organ-specific metastatic tumor cell adhesion and extravasation of colon carcinoma cells with different metastatic potential. Am J Pathol. 169, 1064-1073 (2006).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver. J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).
- Winnock, M., et al. Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis. Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).
- Hata, K., et al. Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver. Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).
- Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids. Hepatology. 12, 70-75 (1990).
- Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. PNIRS Annual Scientific meeting, Seattle, , (2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
