Methodenartikel

Identificatie van MyoD Interactoomanalyse gebruik van Tandem Affinity Purification Gekoppeld aan massaspectrometrie

DOI:

10.3791/53924

⸱

17 mei 2016

 ,  ,  ,  , 
1Epigenetics and Cell Fate, UMR 7216 CNRS, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS - Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MyoD is een myogene transcriptiefactor met een sterk vermogen om myogene transdifferentiatie van vele volledig gedifferentieerde niet-spiercellijnen te induceren. De epigenetische mechanismen die bij deze transdifferentiatie betrokken zijn, zijn grotendeels onbekend. Hier beschrijven we een methode voor dubbele affiniteitszuivering, gevolgd door massaspectrometrie, om MyoD-partners uitputtend te karakteriseren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skeletspieren terminale differentiatie begint met de inzet van pluripotente mesodermale voorlopercellen te myoblasten. Deze cellen nog steeds de proliferatie- of ze kunnen differentiëren en zekering in meerkernige myotubes, die verder rijpen om myovezels te vormen. Skeletspieren terminale differentiatie wordt georkestreerd door de gecoördineerde actie van de verschillende transcriptiefactoren, in het bijzonder de leden van de Muscle Regulatory Factors of MRFs (MyoD, myogenin, Myf5 en MRF4), ook wel de myogene bHLH transcriptiefactoren familie. Deze factoren werken samen met chromatine-remodeling complexen binnen uitgewerkte transcriptie regulerende netwerk om het skelet myogenesis bereiken. Hierbij wordt MyoD beschouwd als de meester myogene transcriptiefactor bij het ontstaan ​​van de spieren terminale differentiatie. Deze opvatting wordt versterkt door het vermogen van MyoD niet-spiercellen zetten in skeletspiercellen. Hier beschrijven we een aanpak gebruikt om MyoD identificereneiwitpartners limitatief om de verschillende factoren die bij skeletspier differentiatie helderen. De lange-termijn doel is om de epigenetische mechanismen die betrokken zijn bij de regulatie van de skeletspieren genen, dwz., MyoD doelen begrijpen. MyoD partners worden aangegeven met Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) vanaf een heteroloog gekoppeld met massaspectrometrie (MS) karakterisering, gevolgd door validatie van de rol van de relevante partners in skeletspier terminale differentiatie. Afwijkende vormen van myogene factoren, of de afwijkende regelgeving, worden geassocieerd met een aantal van spieraandoeningen: aangeboren myasthenia, myotone dystrofie, rhabdomyosarcoom en gebreken in de spieren regeneratie. Als zodanig myogene factoren een pool van mogelijke therapeutische doelwitten in spieraandoeningen, zowel wat de mechanismen die ziekte zelf en regeneratieve mechanismen die ziektebehandeling kunnen verbeteren veroorzaken. Zo is de gedetailleerde understanding van de intermoleculaire interacties en genetische programma gecontroleerd door de myogene factoren essentieel voor een rationeel ontwerp van efficiënte therapieën.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eukaryote multicellulaire organismen zijn samengesteld uit verschillende organen en weefsels. Elke functionele weefsel heeft een specifiek gen-expressie patroon dat wordt bepaald bij elke differentiatiestap. Celdifferentiatie omvat activering van specifieke genen, onderhoud van hun expressie en algemeen zwijgen van een aantal genen, die betrokken zijn bij celproliferatie. Skeletspierdifferentiatie of myogenese, dus een meerstaps-proces, dat begint met het bepalen van mesodermale stamcellen in myoblasten en vervolgens leidt tot de differentiatie van deze myoblasten in eerste mono-kernhoudende en vervolgens meerdere kernen, myotubes . Zo myoblasten worden 'bepaald' cellen, die nog steeds in staat zijn te laten groeien, maar ze zijn toegewijd aan de skeletspieren afstamming, en kan dus alleen differentiëren in skeletspiercellen ofwel tijdens de embryonale ontwikkeling of bij volwassen spier regeneratie. Het proces van de skeletspieren terminal verschillenentiation wordt georkestreerd door een specifieke genetische programma dat begint met de permanente verlaten de celcyclus van myoblast precursorcellen die leidt tot een definitieve silencing van proliferatie geassocieerde genen, zoals E2F doelgenen 1. Inderdaad, tijdens het proces van terminale differentiatie, proliferatie van myoblasten arrestatie een cruciale stap die de expressie van specifieke genen skeletspier en fusie van myoblasten in myotubes 2 voorafgaat. Een dergelijk programma maakt spier stamcellen volwassen, ook wel satelliet-cellen, om te differentiëren tijdens het regeneratieproces volgende skeletspieren letsel.

Zoogdieren myogenesis is sterk afhankelijk van een familie van myogene basic helix-loop-helix (bHLH) transcriptiefactoren MyoD, Myf5, MRF4 en myogenin, vaak aangeduid als de familie van de skeletspieren bepaling factoren of MRFs (Muscle Regulatory Factors) 3. Elk van hen speelt een essentiële rol in de specificatie en differentiatie van de skeletspieren cellen en heeft een specifieke uitdrukking patroon 5-7 april. De activering van Myf5 en MyoD vormt de bepalende stap die cellen verbindt aan de myogene lineage, en daaropvolgende expressie van myogenin triggers myogenesis met activatie van skeletspieren specifieke genen, zoals MCK (Muscle Creatine Kinase). Myogene bHLH transcriptiefactoren samen met leden van de familie MEF2 in de activatie van spier- genen uit eerder stille loci 8. Ze stimuleren ook de skeletspier gentranscriptie als heterodimeren met alomtegenwoordige bHLH eiwitten, E12 en E47, bekend als E-eiwitten, die de zogenaamde E-dozen in diverse gen-regulatoire gebieden 8 te binden. Twist, Identiteitskaart (remmer van differentiatie) en andere factoren negatief regelen dit proces, door te concurreren met MyoD voor E eiwitten binden 8.

MyoD wordt beschouwd als de voornaamste speler in triggering spier terminale differentiatie 9 aangezien het het vermogen tot bepaling myogene / differentiatie (trans-differentiatie) programma in vele volledig gedifferentieerde non-spiersystemen 10-13 induceren. Inderdaad, gedwongen expressie van MyoD induceert de trans-differentiatie van verschillende celtypes zelfs die afgeleid van een ander embryonale oorsprong 12. Zo kan MyoD hepatocyten, fibroblasten, melanocyten, neuroblasten, en adipocyten zetten in spier-achtige cellen. De trans-differentiërende werking van MyoD omvat een abnormale activatie van het myogene genetische (met name de doelwitgenen) in een niet-musculaire omgeving, gelijktijdig aan de onderdrukking van de genetica`s (met name, proliferatie genen).

In prolifererende myoblasten, wordt MyoD uitgedrukt, maar is niet in staat om zijn doel genen te activeren, zelfs wanneer het zich bindt aan hun promotoren 14-16. Daarom is de eis MyoD continu worden uitgedrukt in niet-gedifferentieerde myoblasten steeds vrij elusive. MyoD kon zijn doel genen als gevolg van de aanwerving van repressieve chromatine modificerende enzymen onderdrukken in delende myoblasten vóór het laden van het activeren van chromatine remodeling enzymen 14,17. Bijvoorbeeld, in prolifererende myoblasten, MyoD is geassocieerd met transcriptionele co-repressor KAP-1, histondeacetylasen (HDACs) en repressieve lysine methyltransferasen (kmts), waaronder histon H3 lysine 9 of H3K9 en H3K27 kmts en actief onderdrukken de doelwitgenen expressie door de oprichting van een lokaal repressieve chromatinestructuur 14,17. Belangrijk is dat een recent rapport blijkt dat MyoD zelf direct gemethyleerd door de H3K9 KMT G9a wat resulteert in de remming van zijn transactiverende activiteit 16.

De epigenetische mechanismen betrokken bij de trans-differentiatie van niet-spiercellen door MyoD grotendeels onbekend. Met name sommige cellijnen resistent tegen MyoD geïnduceerde trans-differentiatie. Dus in HeLa-cellen, MyoD is inactief ofzelfs functioneren dan repressor plaats van transcriptie-activator door gebrek aan expressie van de BAF60C subeenheid van chromatine remodeling complex SWI / SNF 18. Dit model kan dus gekozen om beter te karakteriseren van de mechanismen van MyoD geïnduceerde genrepressie. Het is ook geschikt om het vermogen van MyoD repressieve chromatine milieu veroorzaken bij zijn doel loci met de daarbij behorende partners en dus ontdek de MyoD-afhankelijke repressieve mechanismen in delende myoblasten te fine-tunen terminale differentiatie testen.

Hier beschrijven we het protocol voor de identificatie van MyoD partners met behulp van Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) gekoppeld aan massaspectrometrie (MS) karakterisering. Het gebruik van HeLa-S3-cellen stabiel tot expressie Flag-HA-MyoD toegestaan ​​voldoende materiaal naar de MyoD complexen van gefractioneerde kernextracten zuiveren. De identificatie van MyoD partners in het heterologe systeem volgde validatiop in een relevante systeem.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van HeLa-S3 Nuclear Salt-extraheerbare en chromatine-gebonden fracties

  1. Het verzamelen van de cellen
    1. Groeien HeLa-S3 Flag-HA-MyoD en HeLa-S3 Flag-HA (controlecellijn) in Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine (groei medium) bij 37 ° C en 5% CO2 in een vochtige incubator.
      Opmerking: HeLa-S3-cellen stabiel tot expressie Flag-HA-MyoD en HeLa-S3-cellen getransduceerd met de lege vector (HeLa-S3 Flag-HA) kan worden vastgesteld hetzij bij protocol beschreven: 19,20, of door de auteurs.
    2. Amplify cellen tot 10 volledig confluente 150 mm gerechten van elke cellijn (HeLa-S3 vlag-HA-MyoD en HeLa-S3 vlag-HA-cellen).
    3. Verzamel de bovenstaande vloeistof (bevatten niet hechtende subpopulatie) in 5 L spinner.
    4. Was de hechtende subpopulatie met 10 ml PBS per 150 mm schaal, trypsinize cellen gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur temperatuur (0,05% trypsine-EDTA oplossing, 2 ml van een 15 cm schaal).
    5. Voeg 4 ml medium per 150 mm schaal en laat de cellen in 50 ml buizen.
    6. Combineer de supernatant van stap 1.1.3 (in 5 L spinner) en de cellen uit stap 1.1.5, voeg 500 ml verse voorverwarmde groeimedium voor elke cellijn.
    7. Transfer celsuspensie in 5 L spinner en groeien cellen gedurende ten minste 60 uur bij 37 ° C en 5% CO2 in een vochtige incubator.
    8. Voeg 500 ml vers groeimedium kweken cellen gedurende 24 uur.
    9. Voeg 1 liter vers kweekmedium en kweken cellen gedurende 24 uur.
    10. Neem 1 ml van de celsuspensie om de cellen te tellen en controleren levensvatbaarheid van de cellen. Kleur 30 pi celsuspensie met 30 ul van 0,4% trypan blauw en tel tot leven (niet blauw) cellen onder de microscoop met behulp van hemocytometer.
    11. Houd de cel dichtheid bij 2-6 x 10 5 cellen / ml door het toevoegen van verse groeimedium dagelijks; niet meer dan 1 x 10 6 cellen / ml. Het maximumvolume van een 5 L spinner is 2,5 L.
      Opmerking: Voor de volgende stappen gaat u door batches van 2-2,5 L van de cultuur in een dichtheid 1 x 10 6 cellen / ml. Herhaal stap 1.1.12 - 1.1.14 voor het verzamelen van ongeveer 20 L (≈ 20 g droog pellet) van elke cellijn alvorens over te gaan naar de volgende stap.
    12. Pellet cellen door centrifugatie bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en werp de supernatant.
    13. Resuspendeer cellen in 100 ml ijskoude PBS door pipetteren en centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C om de pellet te wassen.
    14. Herhaal het wassen door resuspenderen van de cellen met 25 ml ijskoude PBS, het overbrengen van de suspensie in 50 ml buis en centrifugeren bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
      Opmerking: Celpellets kunnen onmiddellijk worden gebruikt of bevroren in vloeibare stikstof en gedurende enkele dagen bewaard bij -80 ° C.
  2. Isolatie van kernen
    Opmerking: Voer de stappen 1.2.1 - 1.4.3 in de koude kamer.
    1. Pre-chill Buffers en homogenisatoren.
    2. Bij gebruik ingevroren materiaal snel ontdooien de celpellets in een waterbad bij 37 ° C.
    3. Resuspendeer 20 g (≈ 20 ml) van cellen in 20 ml (een volume gelijk aan de omvang van de celpellet) hypotone buffer A (tabel 3) met 10 ml van de buffer eerst, vervolgens toevoegen van 5 ml, vervolgens toevoegen een 5 ml. Was de pipetten goed met verse buffer om het maximum van cellen krijgen.
    4. Breng 40 ml celsuspensie in de voorgekoeld homogenisator met een nauwsluitende stamper.
    5. Homogeniseren cellen met 20 slagen in een homogenisator (20 in en uit bewegingen) en breng celsuspensie in 50 ml buis.
    6. Was de homogenisator met 7 ml sucrose buffer (1/3 van het oorspronkelijke celvolume, tabel 3) het maximum van cellen herstellen. Breng deze suspensie snel in de 50 ml buis uit stap 1.2.5 om de kernen te behouden en de lekkage te beperken.
    7. Stain een 30 pl monster met 30 ul van 0,4% trypan blauw, analyseert onder de microscoop naar de lysis efficiency te controleren (als de lysis succesvol is, moeten alle kernen blauw zijn). Indien nodig, herhaal homogenisatie stap.
    8. Centrifugeer gedurende 7 min bij 10.000 xg en 4 ° C om de nuclei te pelleteren. Sla de supernatant als de cytoplasmatische fractie.
  3. Voorbereiding van de Nuclear Salt-extraheerbare (SE) Fraction
    1. Resuspendeer de kernen pellet in 8 ml sucrose buffer (een inhoud gelijk aan de grootte van de kernen pellet). Druppel voor druppel toevoegen onder mengen goed op een vortex 8 ml buffer met hoog zoutgehalte (1 kernen volume pellet, tabel 3) tot een eindconcentratie van 300 mM NaCl krijgen. Incubeer gedurende 30 minuten op ijs en meng elke 5 min.
    2. Verlagen NaCl concentratie 150 mM door toevoeging van 8 ml (1/3 van het totale volume) sucrose-buffer. Centrifugeer 10 minuten bij 13.000 xg en 4 ° C. Verzamel de bovenstaande vloeistof (nucleair zout-extraheerbare fractie, SE).
      Opmerking: Ofwel ga dan naar stap 1.3.3 of laat de SEfractie op ijs tijdens de bereiding van chromatine-gebonden fractie en vervolgens ultra-centrifuge beide fracties tegelijk.
    3. Ultra-centrifuge SE gedurende 30 min bij 85.000 xg bij 4 ° C. Neem supernatant (≈ 26 ml).
    4. Freeze 100 pi aliquot in vloeibare stikstof. Verder met stap 2 "eiwitcomplex zuivering" met de rest van het extract.
      Opmerking: Het monster wordt gebruikt als input control tijdens stap 5.1.1.
  4. Bereiding van chromatine-gebonden fractie
    1. Resuspendeer de pellet (uit stap 1.3.5.) Nauwkeurig in 7 ml (volume gelijk aan de grootte van de pellet) sucrose-buffer.
    2. Voeg CaCl2 tot een eindconcentratie van 1 mM (28 pl 0,5 M CaCl2 gedurende 14 ml suspensie) aan MNase (stap 1.4.4) activeren en meng.
    3. Voorverwarmen suspensie gedurende 1 min bij 37 ° C.
    4. Voeg 70 ul micrococcal nuclease (MNase) tot de uiteindelijke concentratie te krijgen van 0,0025 U / gl (1/200 verdunning van 0,5U / gl voorraad) en meng.
    5. Incubeer precies 12 min bij 37 ° C. Meng elke 4 min.
    6. Onmiddellijk plaats de reactie op het ijs.
    7. Om MNase te beëindigen, voeg 112 ul van 0,5 M EDTA pH 8,0 (1/125 verdunning) om een ​​eindconcentratie van 4 mM. Incubeer gedurende 5 minuten op ijs.
    8. Ultrasone trillingen 5 maal gedurende 1 minuut bij hoge amplitude, tussen twee sonicaties mogelijk een onderbreking van 1 min (10 min in totaal).
    9. Ultracentrifuge gedurende 30 min bij 85.000 xg en 4 ° C.
    10. Verzamel de bovenstaande vloeistof (nucleosoom verrijkte fractie, NE, ≈ 12 ml).
    11. Freeze 50 pi aliquot in vloeibare stikstof. Verder met stap 2 "eiwitcomplex zuivering" met de rest van het extract.
      Opmerking: Het monster wordt gebruikt als input control tijdens stap 5.1.1.

2. eiwitcomplexen Purification

Opmerking: Ga in parallel uittreksels uit elke cellijn (HeLa-S3 vlag-HA-MyoD en de controle, Hela-S3 vlag-HA).

  1. De Vlag het gebaseerd Zuivering
    1. Voorwas Vlag hars. Gebruik 600 ul van de Vlag hars (van het commerciële 50% aandelen) voor elk punt in de proef (SE en NE fracties voor elke cellijn).
    2. Transfer hars in 15 ml buis, resuspendeer in 13 ml koud tegn (tabel 3), centrifugeer gedurende 2 min bij 1000 x g en verwijder supernatant. Herhaal 5 keer. Na de laatste wasbeurt resuspendeer Vlag hars in gelijke volume van tegn (300 ul voor elke experimentele punt).
    3. Voor elk experimenteel punt meng 600 pi gewassen vlag hars en de bijbehorende eiwitextracten (in een 15 ml buis voor de 12 ml NE en in een 50 ml buis voor de 26 ml fracties SE, respectievelijk). Incubeer op een roterend wiel gedurende de nacht bij 4 ° C.
    4. Centrifugeer gedurende 2 min bij 1000 xg bij 4 ° C, de supernatant opzij zetten en laten 4 ° C totdat het resultaat van de zuivering efficiëntietest (2,2).
    5. Voor de SE monsters, resuspendeer de Vlag harsin 4 ml tegn overgebracht in een 15 ml buis. Herhaal dit 3 maal, telkens overdracht naar hetzelfde 15 ml buis om te voorkomen dat korrels. Centrifugeer 2 min bij 1000 xg en 4 ° C en verwijder supernatant.
    6. Wassen Flag hars 7 keer in een 15 ml buis met behulp van 13 ml tegn centrifugeren en 2 min bij 1000 xg en 4 ° C.
    7. Na de laatste wasbeurt, resuspendeer in 1 ml tegn en de overdracht in een 1,5 ml low-bindend buis. Centrifugeer 2 min bij 1000 xg en 4 ° C en de bovenstaande vloeistof.
    8. Resuspendeer in 200 ul Flag peptide oplossing bij 4 mg / ml bij pH 7,8 voor elk experimenteel punt. Meng de kralen en peptide. Voeg 200 gl tegn buffer en incuberen bij 4 ° C gedurende ten minste 4 uur of een nacht gebonden eiwitten te elueren.
    9. Centrifugeer gedurende 2 min bij 1000 xg bij 4 ° C en breng het hars en supernatant (Flag eluaat) een lege spinkolom in een 2 ml buisje.
    10. Centrifugeer de kolom, verzamel de overgebleven supernatant in 2 ml buis.
    11. Verzamel de vlag hars door toevoeging tegn buffer aan de kolom en naar de tweede vlag elutie met 200 gl Flag peptide oplossing (4 mg / ml) overnacht bij 4 ° C voor elk experimenteel punt.
    12. Herhaal stap 2.1.9 - 2.1.10 naar tweede elutie verzamelen. Combineer eerste en tweede eluaten.
  2. Test van zuiveringsrendement
    Opmerking: Tijdens stap 2.1.11 - 2.1.12, het uitvoeren van SDS-PAGE en zilverkleuring (2.2.1 - 2.2.2).
    1. Neem 15 ul van de eluaten, voeg 5 ul van 4x beladingsbuffer en 2 pl 10x reductiemiddel; laat 5 minuten bij 96 ° C en uitvoeren van een SDS-polyacrylamide 4-12% gel volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Vlekken op de gel met behulp van zilverkleuring kit (volg de instructies van de fabrikant). Als er duidelijke verschillen in eiwit patronen tussen vlag-HA-MyoD en vlag-HA mock eluaten, in het bijzonder de band van de vlag-HA MyoD (ongeveer 50 kDa, figuur 1A), gaan naar de volgende step.
  3. Hemagglutinine (HA) -gebaseerde Zuivering
    1. Wassen HA hars door overdracht in 15 ml buis, opnieuw suspenderen in 13 ml tegn centrifugeren en 2 min bij 1000 xg bij 4 ° C. Herhaal wasstap 5 keer. Na de laatste wasbeurt resuspendeer kralen in gelijke volume van tegn buffer.
      Opmerking: Het volume moet worden aangepast aan de efficiëntie van Flag-gebaseerde zuivering. Begin met 300 pi van het commerciële 50% aandelen voor elk punt in de proef.
    2. Transfer HA hars voor elk punt in de proef in een 1,5 ml lage binding buis. Centrifugeer 2 min bij 1000 xg bij 4 ° C, het maximaal elimineren van de wasbuffer (Tabel 3) en voeg de eluaten van Flag-gebaseerde zuivering HA hars.
    3. Incubeer buizen op de draaiende schijf overnacht bij 4 ° C.
    4. Centrifugeer gedurende 2 min bij 1000 xg bij 4 ° C, de supernatant opzij zetten en laten 4 ° C totdat het resultaat van de zuivering efficiëntietest (2.3.12.).
    5. Opnieuwschorten de HA hars in 0,5 ml tegn, over te dragen aan een nieuw dieptepunt bindend 1,5 ml buis. Herhaal resuspensie keer toevoegen aan dezelfde 1,5 ml buis om te voorkomen dat korrels en centrifugeer 2 min bij 1000 xg en 4 ° C. Verwijder supernatant.
    6. Was beads 8 keer met 1 ml tegn telkens centrifugeren 2 min bij 1000 xg en 4 ° C en verwijderen van supernatant (voorkomen dat korrels). Na de laatste wasbeurt, de overdracht van de kralen in 0,5 ml buizen.
    7. Verwijder zoveel supernatant mogelijk. Voeg 100 ul van HA vrij peptide oplossing (4 mg / ml) bij pH 7,8 op kralen gebonden eiwitten te elueren. Incubeer op het roterende wiel een nacht bij 4 ° C.
      Opmerking: De hoeveelheid HA-peptide moet worden aangepast aan de overvloed van de complexen.
    8. Centrifugeer gedurende 2 min bij 1000 xg bij 4 ° C en breng het hars en supernatant (HA eluaat) een lege spinkolom in een 2 ml buisje.
    9. Centrifugeer de kolom overgebleven supernatant te verzamelen in de 2 ml buis.
    10. Voer een tweede elutie met 100 pl HA peptide (4 mg / ml) voor elk punt in de proef. Incubeer op het roterende wiel een nacht bij 4 ° C. Herhaal stap 2.3.8 - 2.3.9 naar tweede elutie verzamelen.
    11. Combineer eerste en tweede eluaten.
    12. Test zuiveringsrendement door SDS-PAGE en zilverkleuring (zie stap 2.2.) (Figuur 1A).
    13. Concentreer de HA eluaat tot 30 ul met behulp van centrifugaal filter units met een 10 kDa cut-off (nominale moleculaire gewichtslimiet, NMGL) volgens de instructies van de fabrikant.
    14. Verdeel de geconcentreerde monsters in twee delen: 22.5 (3/4) en 7,5 (1/4) pl. Snap bevriezen 1/4 van monsters in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C. Gebruik de 3/4 deel voor stap 3.
      Opmerking: Het bevroren 1/4 deel wordt gebruikt voor de bevestiging van massaspectrometrie resultaten op Western blot (zie stap 5,1).

3. massaspectrometrie Analyse

Opmerking: De volgende stappen moeten met de massaspectrometrie faciliteit die het onderzoek zal uitvoeren worden besproken.

  1. Supplement 3/4 (22,5 ui) van de monsters met 7,5 ul van 4x beladingsbuffer en 3,3 pl 10x reductiemiddel en kook gedurende 5 minuten bij 96 ° C.
  2. samples belasting op een SDS-polyacrylamide 4-12% gel. Run gel bij 150 V constant gedurende 5 minuten om alle eiwitten op de gel voeren zonder afscheiding.
  3. Was de gel met water; vast te stellen voor 20 - 30 min Met lijm oplossing (10% azijnzuur, 50% methanol, 40% ultra-schone water) dan was het vaste gel 5 keer in ultra-schone water.
  4. Snijd de banden met de eiwitten, op te slaan in 1 ml water in een 1,5 ml tube en stuur die naar massaspectrometrie faciliteit.

4. Data Analysis

Let op: Dit is een algemene leidraad voor de analyse. De exacte procedure is afhankelijk van de specifieke wijze van de door MS gevensgebruikt om de analyse uit te voeren (bijvoorbeeld 21,22).

  1. Vergelijk de lijst van de geïdentificeerde eiwitten in "MyoD" eluaten met de lijst verkregen uit overeenkomstige negatieve controle voorbereiding. Uit te sluiten van de analyse van de eiwitten die in beide lijsten.
  2. Verwijder eiwitten die ≤2 totaal aantal geïdentificeerde peptiden uit resterende lijst.
  3. Toegang functionele annotatie en functionele indeling van de verkregen lijst van eiwitten met behulp van DAVID Bioinformatica Resources (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) en classificeren van de lijst van de eiwitten 23,24.
  4. (Optioneel) verwijderen uit de lijst "lifters", geladen niet-nucleaire eiwitten met sterke onvoorziene binding aan negatief geladen DNA 25. Deze bevatten cytoskelet, cytoplasma, mitochondriën, membraan en receptoreiwitten (eiwitvouwing cytoskelet en Restgroep eiwitten in de tabellen 1 en 2).
  5. Vergelijk deze lijsten van de MyoD interactoren van SE en NE fracties algemene eiwitten en eiwitten die specifiek zijn voor elke fractie (figuur 2) te identificeren.

5. Bevestiging van Identified Interactors door Western Blot

  1. Bevestiging in HeLa-S3 vlag-HA-MyoD en HeLa-S3 vlag-HA
    1. Dooi eluaatmonsters verkregen bij de stap 2.3.14 (7,5 pi) op ​​ijs. Voeg 12 pl tegn buffer, 10 ui 4x beladingsbuffer en 3 pl 10x reductiemiddel. Kook monsters gedurende 5 minuten bij 96 ° C.
    2. Opstellen van monsters voor de Western blotting.
      1. Ontdooi aliquots van de stappen 1.3.9 en 1.4.11 en meet eiwitconcentratie, bijvoorbeeld met BCA kit (Aanwijzingen fabrikant).
      2. Gebruik 15 ug van het eiwit per baan. Meet de juiste hoeveelheid van het extract en het volume van het monster aanpassen tot 15 gl met tegn buffer.
      3. Voeg 5 ul 4x ladingsbuffer en1,5 pl 10x reductiemiddel. Kook monsters gedurende 5 minuten bij 96 ° C.
    3. Voer een western blot analyse met antilichamen van belang (specifiek voor partner kandidaat die tijdens MS-analyse) met behulp van 15 pl eluaatmonsters. Met ingang extracten als controle van endogene eiwitniveaus (Figuur 3A).
  2. Bevestiging in de Relevante Cellular System
    1. Voorbereiding van de totale nucleaire extract van C2C12 muis myoblasten.
      1. Groeien muis C2C12-myoblasten in DMEM medium aangevuld met 15% foetaal kalfsserum, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine bij 37 ° C en 5% CO2 in een vochtige incubator. Nooit meer dan 80% cel samenvloeiing aan cellen in proliferatieve toestand te houden.
      2. Groeien tenminste twee 150 mm schalen van C2C12 voor een punt (een antilichaam) van immunoprecipitatie (IP). Zuig het medium, wassen cellen tweemaal met 10 ml PBS.
      3. Schraap de cellen en verzamelen in 15 ml buis. Centrifuge bij 250 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Teruggooi supernatant.
      4. Schatten het volume van de celpellet (= V cel). Voorzichtig resuspendeer de pellet in 3 volumina V cell hypotone buffer B cytoplasmatische membraan (tabel 3) verstoren.
      5. Voeg 0,44 x V celvolume van 10% NP-40 tot een eindconcentratie van 1% bereikt (v / v). Keer de buis een paar keer om te mengen.
      6. Voeg 0,89 x V celvolume van SR (tabel 3) om de kernen integriteit te bewaren. Keer de buis een paar keer om de suspensie gehomogeniseerd en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 2000 xg om nuclei te pelleteren.
      7. Verwijder het supernatant (cytosolische fractie). Schatting van het volume van de kernen pellet (= V nuc). Resuspendeer kernen pellet in één volume V nuc van sucrose buffer.
      8. Druppel voor druppel toevoegen onder mengen goed op een vortex één volume V nuc hoge zout buffer tot een eindconcentratie van 300 mM krijgenNaCl, en incubeer 30 min op ijs. Meng om de 5 min.
      9. Voeg een volume V nuc van sucrose buffer en CaCl2 (eindconcentratie 1 mM) (om NaCl-concentratie tot 150 mM te verlagen). Mengen.
      10. Voorverwarmen suspensie gedurende 1 min bij 37 ° C, voeg micrococcal nuclease uiteindelijke concentratie van 0,0025 U / pl (1/200 uit voorraad van 0,5 U / pl) te krijgen. Mengen.
      11. Incubeer precies 12 min bij 37 ° C. Meng elke 3 min.
      12. Onmiddellijk plaats reactie op ijs en voeg EDTA (eindconcentratie 4 mm) MNase activiteit te stoppen. Incubeer gedurende 5 minuten op ijs.
      13. Sonificeer 5 keer voor 0,5 minuten elk met een hoge amplitude. Tussen twee sonicaties, zodat een breuk van 0,5 min (5 min in totaal).
      14. Ultra-centrifuge gedurende 30 minuten bij 85.000 xg en 4 ° C. Verzamel de supernatant (totale nucleaire extract).
      15. Meten eiwitconcentratie van de totale nucleaire extract, bijvoorbeeld met BCA kit (Aanwijzingen fabrikant), waarna immediatEly naar stap 5.2.2.
    2. Immunoprecipitatie (IP) van endogene MyoD.
      1. Om pre-clear de extracten, was 10 ul van proteïne G agarose parels voor elk IP-punt.
        1. Breng de benodigde hoeveelheid proteïne G agarose korrels in een 1,5 ml buis, hersuspenderen in 1,4 ml koude tegn, centrifugeer gedurende 2 min bij 1800 x g en verwijder supernatant. Herhaal dit 3 keer.
      2. Meng voorgewassen proteïne G agarose kralen met de juiste hoeveelheid van de totale nucleaire extract. Gebruik 500 ug totaal nucleair extract eiwit per IP punt.
      3. Incubeer op een draaiend wiel bij 4 ° C gedurende 2 uur tot vooraf duidelijk de extracten.
      4. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1800 xg bij 4 ° C. Houd supernatant.
      5. Meng 5 ug MyoD Ab of 5 ug konijn IgG met 500 ug pre-ontruimd totale nucleaire extracten in 1,5 ml lage binding buizen. Voeg tegn buffer tot 1 ml. Incubeer op een draaiend wiel bij 4 ° C overnacht.
        Opmerking: Voer de fadat stappen tijdens stap 5.2.2.3.
      6. Pre-wash 7,5 pl proteïne A / G stock kralen oplossing per IP punt.
        1. Breng de benodigde hoeveelheid kralen in een 1,5 ml buis, resuspendeer kralen in 1 ml tegn en centrifugeer bij 1800 xg bij 4 ° C gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant. Herhaal dit 3 keer.
      7. Resuspendeer proteïne A / G kralen in 1,5 ml blokkeeroplossing (Tabel 3) en incubeer op een roterend wiel gedurende de nacht bij 4 ° C.
      8. Centrifugeer totale nucleaire extracten geïncubeerd met Abs (stap 5.2.2.5) bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Houd supernatant.
      9. Centrifuge geblokkeerde proteïne A / G-hars (stap 5.2.2.7) bij 1800 g gedurende 2 min bij 4 ° C. Gooi supernatant en resuspendeer in 1 ml tegn buffer. Re-centrifuge bij 1800 xg gedurende 2 min bij 4 ° C te wassen blokkerende buffer.
      10. Resuspendeer geblokkeerde proteïne A / G hars in 1 ml tegn buffer en het monster in nieuwe low-eiwit binding buizen tot 7,5 ul blo verkrijgencked proteïne A / G hars per IP punt. Centrifugeer bij 1800 xg bij 4 ° C gedurende 2 minuten en verwijder zoveel mogelijk van de supernatant.
      11. Voeg de totale nucleaire extracten geïncubeerd met het Abs (of controle-IgG) met de A / G-hars. Meng en incubeer 2 uur bij kamertemperatuur (RT) op een roterend wiel.
      12. Centrifugeer suspensie 1800 xg bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. Gooi supernatant, resuspendeer in 1 ml wasbuffer en de overdracht schorsing naar nieuw dieptepunt bindende buizen. Incubeer bij kamertemperatuur op een roterend wiel gedurende 5 min.
      13. Centrifugeer suspensie bij 1800 xg bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten, resuspendeer in 1 ml wasbuffer en geïncubeerd bij kamertemperatuur op een roterend wiel gedurende 5 min. Herhaal 4 keer. Voor de laatste wasbeurt transfer naar een nieuw dieptepunt bindende buis.
      14. Verwijder het supernatant maximaal. Voeg 7 pl wasbuffer, 7 ul van 4x beladingsbuffer en 3 pl 10x reductiemiddel aan de korrels, mengen en koken gedurende 5 minuten bij 96 ° C.
      15. Voer een western blot analyse met antilichamen van interest (specifiek voor partner kandidaat voor het immuunsysteem neergeslagen eiwit). Met 1% (5 ug) input extracten als controle van endogene eiwitniveaus (Figuur 3B).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de regulering van MyoD activiteit te begrijpen, ondernam we de volledige karakterisering van de MyoD complexen met behulp van biochemische zuivering, op basis van de immunozuivering van een dubbele tag vorm van MyoD gevolgd door massaspectrometrie (MS). Het gebruik van HeLa-S3 cellijn die vlag-HA-tag MyoD en een controle-cellijn die vlag-HA toelaat om genoeg materiaal om de MyoD complex te zuiveren door het uitvoeren van dubbel-affiniteitszuivering van Flag-HA-MyoD krijgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De gepresenteerde methode maakt uitputtend identificatie van partners van een transcriptiefactor, MyoD. Geopenbaard MyoD partners in een heteroloog systeem resistent tegen MyoD geïnduceerde differentiatie, namelijk HeLa-S3-cellen. Dus per definitie, die MyoD partners zijn alomtegenwoordig uitgedrukt. Deze omvatten algemene en sequentie-specifieke transcriptiefactoren, chromatine-modificerende enzymen, RNA verwerking eiwitten, kinasen (tabellen 1 en 2). Omdat HeLa-S3-cellen zijn resisten...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk in het Ait-Si-Ali-lab werd ondersteund door de Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon); Institut National du Cancer (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; Université Paris Diderot en het 'Wie ben ik?' Laboratory of Excellence #ANR-11-LABX-0071 gefinancierd door de Franse regering via haar 'Investeringen voor de Toekomst' programma beheerd door de ANR onder subsidie #ANR-11-IDEX-0005-01. EB werd ondersteund door een INCa-subsidie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Cellijnen
HeLa-S3ATCCCCL-2.2
C2C12ATCCCRL-1772
Utrusting
SpinnerCorning778531
Homogenizer:  Dounce homogenisator Wheaton432-1273 en 432-1271
Agitatieapparaat voor spinnersBellco778531
SonicatorDiagenodeUCD 200
HemocytometerMarienfeld Superior 640610
Laag-bindende buizenSorenson27210
Lege draaikolomBio-Rad7326204
Reagentia
SDS-polyacrylamide 4-12%  gelLife technologiesNP0336BOX
4x laadbuffer Life technologiesNP0007
10x reducerend middelLife technologiesNP0004
ZilverkleuringskitLife technologiesA8592
Centrifugeerfiltereenheden, 10KMilliporeUFC501024
Protein G agarose kralenSigma-AldrichP4691
Protein A/G  ResinThermo Scientific53132
Flag resin (anti-Flag M2-agarose affiniteitsgel)Sigma-AldrichA2220
HA resin (monoklonaal Anti-HA agarose)Sigma-AldrichA2095
MNaseSigma-AldrichN3755
Flag vrij peptide (DYKDDDDK)Ansynth Service BVAangepaste syntheseResuspendeer tot 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8
HA vrij peptide (YPYDVPDYA)Ansynth Service BVAangepaste syntheseResuspendeer tot 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8
Bicinchoninic acid-gebaseerde eiwitanalysekit : BCA-kitThermo Scientific23225
ProteïneremmersSigma-AldrichS8830
Luminol-gebaseerde versterkte chemiluminescentie (ECL) HRP-substraatLife technologies34075
BSASigma-AldrichA9647
Gesneden zalmzaad DNA (Deoxyribonucleïnezuur natriumzout uit zalmtestes)Sigma-AldrichD1626
Spermine tetrahydrochlorideSigma-AldrichS1141
SpermidineSigma-AldrichS0266
GlycerolSigma-AldrichG5516
PBSSigma-AldrichD8537
MOPS running bufferLife technologiesNP0001
DMEM (hoge glucose)Sigma-AldrichD0822Voorverwarmen  bij 37 °C voor gebruik
Trypsine-EDTA (0,05% fenolroodLife technologies25300-054
SerumGE healthcare life sciences PAA A15-102Elk lot serum moet eerst worden getest voor uw cellen.
Penicilline en Streptomycine Life technologies15140-122
Trypan Blauw-oplossing, 0,4%Life technologies15250-061
Water (steriel gefilterd)Sigma-AldrichW3500
Antilichamen
HA van rat (12CA5)Roche11583816001
FlagSigma-AldrichA8592
MyoDSanta Cruzsc-32758Te gebruiken voor western blotting
MyoDSanta CruzSC-760Te gebruiken voor immunoprecipitatie en western blotting
CBFbetaSanta CruzFL-182 
HP1alphaEuromedex2HP2G9
HP1betaEuromedex1MOD1A9AS
HP1gammaEuromedex2MOD1GC
Suv39h1Cell Signaling Technology8729
BAF47BD Biosciences612111
Myf5Santa CruzSC-302
TubulinSigma-AldrichT9026
ActinSigma-AldrichA5441
IgG MuisSanta CruzSC-2025
IgG KonijnSanta CruzSC-2027
Geit anti-rat -HRPSigma-AldrichA9037
Geit anti-konijn -HRPSigma-AldrichA6154 
Geit anti-muis -HRPSigma-AldrichA4416

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ait-Si-Ali, S., et al. A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells. Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).
  2. Buckingham, M. Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors. Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).
  3. Arnold, H. H., Winter, B. Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators. Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle formation in vertebrates. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).
  5. Yun, K., Wold, B. Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context. Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).
  6. Molkentin, J. D., Olson, E. N. Defining the regulatory networks for muscle development. Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).
  7. Arnold, H. H., Braun, T. Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review. Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).
  8. Puri, P. L., Sartorelli, V. Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications. J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).
  9. Tapscott, S. J. The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription. Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).
  10. Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts. Cell. 47 (5), 649-656 (1986).
  11. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51, 987-1000 (1987).
  12. Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242, 405-411 (1988).
  13. Weintraub, H., et al. Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).
  14. Mal, A., Harter, M. L. MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).
  15. Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1. Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).
  16. Ling, B. M., et al. Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).
  17. Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation. Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).
  18. Forcales, S. V., et al. Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex. The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).
  19. Nakatani, Y., Ogryzko, V. Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes. Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).
  20. Ouararhni, K., et al. The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity. Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).
  21. Fritsch, L., et al. A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex. Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).
  22. Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a. Genome Biol. 8 (12), R270(2007).
  23. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  24. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
  25. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142 (5), 810-821 (2010).
  26. Yahi, H., et al. Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).
  27. Philipot, O., et al. The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 5 (2), (2010).
  28. Joliot, V., et al. The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 9 (10), e108858(2014).
  29. Tanese, N. Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
  30. Singh, K., et al. A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation. Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).
  31. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  32. Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. Chromatin modification and muscle differentiation. Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).
  33. Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation. J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).
  34. Caretti, G., et al. The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation. Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).
  35. Knoepfler, P. S., et al. A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1. Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).
  36. Albini, S., Puri, P. L. SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange! Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).
  37. Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

MyoD InteractomeTandem Affinity PurificationMass SpectrometrySkeletal Muscle DifferentiationTranscription Factor PartnersCell FractionationFLAG Tag PurificationNuclear Extract AnalysisWestern Blot ValidationProtein Complex Isolation

Gerelateerde artikelen