Een Step by Step Protocol voor Subretinal Surgery in Rabbits

Samenvatting

Netvliespigmentepitheel (RPE) vervangende strategieën en gen-gebaseerde therapie in aanmerking komen voor een aantal retinale degeneratieve aandoeningen. Voor klinische toepassing worden grote oog dierlijke modellen moeten chirurgische technieken bij patiënten toepassing bestuderen. Hier presenteren we een konijnenmodel voor subretinale chirurgie gericht RPE transplantatie, die veelzijdig en kostenefficiënt.

Samenvatting

Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), retinitis pigmentosa, en andere RPE gerelateerde ziekten zijn de meest voorkomende oorzaken van onomkeerbaar verlies van het gezichtsvermogen van volwassenen in industrieel ontwikkelde landen. RPE transplantatie lijkt een veelbelovende therapie, aangezien het disfunctioneel RPE kan vervangen, de functie en daardoor herstellen visie.

Hier beschrijven we een methode voor het transplanteren van een gekweekte RPE monolaag op een steiger in de subretinale ruimte (SRS) van de konijnen. Na vitrectomie xenotransplantatie werden afgeleverd in de SRS met behulp van een op maat gemaakt shooter, bestaande uit een 20-gauge metalen mondstuk met een polytetrafluorethyleen (PTFE) gecoate zuiger. De huidige techniek evolueerde in meer dan 150 konijnen operaties meer dan 6 jaar. Post-operatieve follow-up kan worden verkregen met behulp van niet-invasieve en repetitieve in vivo beeldvorming, zoals spectrale domein optical coherence tomography (SD-oktober), gevolgd door perfusie gefixeerd histologie.

the methode heeft duidelijk omschreven stappen voor het eenvoudig leren en hoog slagingspercentage. Konijnen worden beschouwd als een groot oog diermodel bruikbaar in preklinische studies voor klinische toepassing. In dit verband konijnen kostenefficiënt en misschien gemakkelijk alternatief voor andere grote gaten diermodellen.

Inleiding

Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) is de meest voorkomende oorzaak van slechtziendheid bij volwassenen in industrieel ontwikkelde landen 50 jaar of ouder, zoals het verlies van het centrale zicht veroorzaakt. Ongeveer 15% van deze patiënten lijden aan de "natte" vorm van de ziekte, waarbij neovascularisatie afkomstig van het vaatvlies en verstoort de retinale functie ^1. Deze variant kan worden behandeld door een zeer effectieve therapie met herhaalde intra-vitreale injecties van antiangiogene drugs ^2. De overgrote meerderheid van de patiënten (~ 85%) lijdt de droge vorm, die wordt gekenmerkt door extracellulaire afzettingen (bijvoorbeeld drusen) onder het retinale pigmentepitheel (RPE). Deze afzettingen veroorzaken RPE disfunctie leidt tot retinale atrofie in de macula. Gezien het ontbreken van een curatieve therapeutische opties, AMD zich ontwikkeld tot een intensief ontwikkeling van onderzoek gebied, waar veel verschillende curatieve therapeutische benaderingen worden getest. Chirurgische RPE vervangingeen aantrekkelijke toekomstige mogelijkheid om deze slopende ziekte ³ verslaan.

Autologe transplantatie subretinale RPE vervangt disfunctioneel of verloren RPE in macula, en heeft het potentieel om de fysiologische functie ^4-9 herstellen. Deze chirurgische techniek had een doorbraak bij de ontwikkeling van RPE protocollen differentiatie van humane embryonale stamcellen (hESC) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC), waardoor de wetenschapper een onbeperkte bron van cellen voor transplantatie RPE ^10. RPE transplantatie wordt nu erkend als een aantrekkelijke first-in-toepassing op de mens voor stamcellen afgeleid geneeswijze. Het oog biedt een uitstekende chirurgische toegang en verfijnde in vivo monitoring tools ^11-13.

Om de RPE te transplanteren, een manier is met een minimaal invasieve levering met behulp van een cel suspensie, als alternatief, om beter te bewaren RPE karakteristieken en transplantatie-functie, kunstmatige carrier substrAtes (scaffolds) voor RPE vervanging worden overwogen ^4,14,15. Grote diermodellen nodig zijn voor preklinische validatie, maar toch gedetailleerde technische informatie over dierlijke behandeling en chirurgische techniek ontbreekt tot op heden ^16-23.

Wij en anderen ^11,24 hoewel er aanwijzingen van het tegendeel ^25, suggereren het gebruik van een stijf doch elastisch dragersubstraat omdat het werk veiliger, behoudt monolaag integriteit en functionaliteit. Na verloop van tijd hebben we een aantal speciaal ontworpen instrumenten en aanverwante technieken getest op de implantatie van cel-carrier ondersteund RPE transplantaties in de subretinale ruimte (SRS). We gebruik gemaakt van intra-operatieve video-opnamen, in vivo scanning laser Ophthalmoscopie gecombineerd met spectrale domein optical coherence tomography (SLO / SD-oktober), en histologie aan de implantatie succes ^14,26,27 te evalueren. Hier bieden wij onze huidige aanbeveling voor subretinale RPE implantaten bij konijnen,die werden getest in 5 verschillende konijnen stammen, 7 cel dragermaterialen en 4 RPE celbronnen in meer dan 150 procedures.

Protocol

Ethiek van de behandeling van dieren in oogheelkundig onderzoek: We verkregen goedkeuring van de ethische commissie van de Medische Faculteit van de Universiteit van Bonn, en zich te houden aan de aangegeven door de Vereniging voor Onderzoek in Vision en Oogheelkunde (ARVO) richtlijnen. Bovendien werden alle procedures goedgekeurd door de staat regelgevende instanties van Noord-Rijnland-Westfalen. De dieren werden binnenshuis gehouden in een gespecialiseerde faciliteit in een kamer met airconditioning met temperaturen tussen 18 - 20 ° C, blootstelling aan reguliere daglicht, in een gestandaardiseerde individuele kooien met vrije toegang tot voedsel en water.

Opmerking: Om de dieren te waarborgen operatieve affiniteit wordt een dier gezondheid scoreblad gevolgd waarin de volgende definitieve dier uitsluitingscriteria bestaat uit: 20% gewichtsverlies in vergelijking met het gewicht van de toelating; schijnbare cyanose van het dier; dier rillingen, heeft krampen of niet kunnen bewegen in coördinatie; . ataxie / paresthesie, bijvoorbeeld, verlamt; apathie; extreme automutilatie (huidwonden, afgehakte ledematen).

1. Instrument Sterilisatie

1. Plaats de herbruikbare instrumenten in ultrasoonbad.
2. Voeg 500 ml gedestilleerd water en 2 ml instrument desinfectiemiddel.
3. Clean instrumenten gebruiken sweep-functie voor 15 min.
4. Verwijder instrumenten uit ultrasoon bad en spoel grondig met gedestilleerd water gedurende 5 minuten.
5. Plaats instrumenten in een autoclaaf en het gebruik van het standaard programma (sterilisatie van de instrumenten in het kader van 121 ° C gedurende 20 min).

2. Instrument Voorbereiding

1. Opzetten en onderhouden van een steriel veld, door te werken in een afgesloten ruimte, het dragen van chirurgische scrubs, masker en haren te bedekken. Ontsmet uw handen voor het dragen van steriele chirurgische handschoenen. Voor gedetailleerde aanpak te zien ^28.
2. Plaats gesteriliseerde instrumenten op een steriel laken.
3. Plaats 1 ml injectiespuit gevuld met 40 mg triamcinolon bevestigd aan een 27 G naald voor injectie, 10 ml spuit met Balance zoutoplossing (BSS) en 5 ml spuit of glijmiddel op laken.
4. Plaats 3-0 zijde, 7-0 Vicryl, oculaire sticks (tot conjunctivale / sclerale bloeden te stoppen), twister gaas sponzen, wondsluitstrips (de vitrectomie tip buis fixeren), en kroonluchter endoillumination fiber draad op een laken.
5. Uitpakken 25 G kroonluchter endoilluminator en verbinding maken met lichte machine met behulp van steriele technieken (zie stap 2.1). Sluit vitrectomie set inclusief high speed vitrector en Venturi cassette om vitrectomie machine met behulp van steriele technieken (zie stap 2.1).
6. Open 500 ml BSS flesje en sluit oplossing Venturi Cassette volgens instructies van de fabrikant.

3. Voorbereiding van anesthesie en positionering van de Animal

1. Weeg dier nauwkeurige medicatie dosering te verzekeren.
2. Bereid intramusculaire (IM) verdoving met behulp van 1 spuit met 27 G naald met 0,35 mg / kg ketamine en 0,25 mg / kg medetomidine voor de start. Flip de spuit te mengen.
3. Bereid 2 spuiten met 1/3 tHij doseert de anesthesie tijdens de operatie te handhaven.
4. Bereid spuit met 20 ml van 5% glucose-oplossing en 18 G naald voor subcutane injectie als een intraveneuze infusie alternatief.
5. Geef 3 x 1 druppel mydriatische oogdruppels voorafgaand aan vitrectomie voor pupil dilatatie.
6. Cover konijn met een deken om te kalmeren voordat verdoving injectie, te injecteren in de achterste ledematen (bilspier) en massage rond de plaats van injectie gedurende 30 sec.
   Opmerking: Het eerste schot van IM verdoving duurt ongeveer 1-2 uur. Afhankelijk van het konijn omvang, geneesmiddeltolerantie, vetlaag, stress en lichaamstemperatuur. Het eerste teken van de narcose vervagen is een nystagmus (moet worden gecontroleerd door de chirurg), de volgende injecties duurt ongeveer 30 - 45 min.
7. Bevestigen juiste verdoving, door na te gaan hypnose, hyporeflexie, analgesie en spierverslapping van het dier.
8. Geef subcutane injectie (Pt. 3.3) in de nek huidplooi, zodra het konijn is bewusteloos.
9. methylc toevoegenellulose smeermiddel elke 5-10 min in geopereerde oog, voeg smeermiddel en tape deksels in niet-geopereerde oog.
10. Plaats de bedekte konijn op de operatietafel bedekt met een afdekking, zoals een katoenen deken in een optimale positie (neus enigszins verhoogde door een mal van de deken, zodat het niveau oogoppervlak) voor chirurgische microscoop. Lijn oog loodrecht doel microscoop.
11. Zorg voor een goede kerntemperatuur van het lichaam met behulp van rectale thermometer (normothermia 39 ± 1 ºC) ^29.
12. Cut wimpers met een schaar (wat zalf op blade) om postoperatieve infecties te verminderen.
13. Ontsmet het oog via 2-3 druppels 0,1 g / ml povidonjood topicaal gedurende 1 min en spoel met steriel BSS.
14. Bedek oog met steriele doek met voorgesneden opening in het midden voor het oog en dek af met (sticky) incisie afdekdoek 12 x 17 cm.

4. Vitrectomie

1. Proptose en veilige oog met 3-0 zijde met behulp van inverted remklauw en het uitvoeren van een conjunctivale peritomy.
   1. Incise het bindvlies met een Vannas schaar dicht bij limbus maar ver genoeg van de bloedvaten (~ 1 mm afstand).
   2. Ontleden het bindvlies door een "T-cut". Eerst vergroten peritomy de schaar parallel limbus en conjunctiva incisie de verticaal in de vorm van een "T" ca. 6-7 mm. scheiden het bindvlies zorgvuldig botweg.
2. Voer een sclerotomie met behulp van een 23 G microvitreoretinal (MVR) mes om 8 uur op rechteroog / OD (04:00 op linkeroog / OS) door voorzichtig het plaatsen van de scherpe punt van het mes in de richting van de oogzenuw. trekken langzaam het mes in dezelfde richting en te voorkomen dat de uitbreiding van de sclerotomie.
3. Invoegen en hechtdraad op maat zijpoort-infusie canule ²⁷ met behulp van 7-0 zijden hechtdraad en zet de intra-oculaire druk (IOD) bij 24 mmHg.
4. Voer een sclerotomie 25 G platte kop trocart om 2 uur op OD (10 o '; Klok op OS) zoals in stap 4,2.
5. Plaats 25 G kroonluchter licht in platte kop trocar, fixeer met plakband en zet de lichtbron op ca. 30%.
6. Indien nodig, verwijder edematous hoornvliesepitheel met behulp van een # 20 scalpel voor een betere intra-oculaire visualisatie.
7. Voer een sclerotomie vergelijkbaar met stap 4.2 om 10 uur op de OD (02:00 op OS), (pre-) plaats U-vormige 7-0 hechtingen rond sclerotomie zonder binden van de knoop, en steek vitrectomie snijder tip.
8. Begin vitrectomie ³⁰ rond de ingangspoort, dan verder over de optische schijf en de fibrae medullares met behulp van high speed vitrector door het snijden van het glasvocht in kleine stukjes bij max. 2000 - 3000 delen / min, opzuigen bij max. 200 mmHg met de genoemde parameter setup van de vitrectomie machine (tabel 1)
9. Voer een glasvochtloslating (PVD) door het scheiden van het glasvocht van het netvlies door het houden van de hoge snelheid vitrector over de achterste paal eennd (indien mogelijk voorzichtig) overste van de schijf ^31, terwijl aspireren alleen bij max. 200 mmHg zonder te snijden.
10. Injecteer ca. 50 ul (20 mg) triamcinolon of verdund fluoresceïne (ca. 0,1 mg / ml) intravitreaal om verwijdering van de zwevende glaslichaam via achterpool en midperiphery visualiseren en te vergemakkelijken (bij totaal) tijdens vitrectomie. Vermijd oversteken onder de lens. Inspringen perifere glasvocht scheren door een (ervaren) assistent wordt aanbevolen als gas tamponnade gewenst is.
11. Voeg 20 eenheden / ml heparine en 0,5 mg epinefrine om uiteindelijke concentratie van 0,001 mg / ml in de BSS infusieoplossing parallel of na stap 4,10.
    Let op: Als heparine / epinefrine niet intra-oculaire worden geïnjecteerd hun effecten zijn vertraagd, afhankelijk van infusie debiet.

5. Laden Shooter

Let op: De hierin beschreven werk valt niet onder de principes van de Verklaring van Helsinki vallen; het niet menselijke patiënten te betrekken. Hier, standard RPE cellen werden geïsoleerd uit foetale menselijke ogen, gekweekt en gedifferentieerd op ongecoat 10-um-dikke polyesterfilm (PET) inzetstukken volgens onze eerder gepubliceerde protocol ^14. Een toestemming om te werken met de humane foetale materiaal werd verkregen van de ethische commissie van de Universiteit van Bonn. Als alternatief hES-RPE werden verscheept van de Skottman lab (manuscript in prep.), Waar ze werden gekweekt volgens de beschreven door Vaajasaari et al techniek ^32.; voor deze cellen een toestemming is verkregen van de R. Koch Instituut, Berlijn, Duitsland.

1. Spoel celkweek voorafgaand aan de voorbereiding van het implantaat 3x met oogheelkundige kwaliteit BSS.
2. Vul een standaard celkweek schotel (100 x 20 mm) met 10 ml oogheelkundige leerjaar BSS.
3. Voeg de celkweek inzetstuk in de BSS en centreren de schotel onder een lichtmicroscoop.
4. Pons een 2,4 x 1,1 mm implantaat met een stompe, ovaal, op maat gemaakte naald op een vlakke, boonvormige substraat te verkrijgenmet twee lange randen en twee ronde randen.
5. Voorzichtig overspoelen de naald door de tweede poort met BSS voor het spoelen van het implantaat in de BSS gevuld maat gemaakte laadstation (figuur 1).
6. Optioneel snij een ronde uiteinde van het implantaat (<0,5 mm), om er maar een derde rand te verkrijgen.
7. Zorg ervoor dat het implantaat in de juiste richting door te verzekeren dat de monolaag ondersteboven op de celdrager. Om te veranderen positioneren zorgvuldig gebruik maken van twee scalpels.
8. Duw het implantaat voorzichtig en volledig in de schutter instrument met de naaldhouder totdat alle implantaat binnenkant van de punt is bevestigd. De plunjer moet blijven teruggetrokken.
9. Houd de "geladen" shooter tip in laadstation onder BSS tot het moment van de implantatie.

6. Implantatie

1. Aanpak neurale retina met uitschuifbare 41 G subretinale injectienaald verbonden met een gasdichte injectiespuit (ervoor zorgen dat alle luchtbellen zijn geëvacueerduit een buis!).
2. Injecteren BSS (met calcium en magnesium / CM) subretinally en daardoor een blaar netvliesloslating (BRD) van ongeveer 2 te maken - 3 disc diameter (DD). Twee BRD per oog kan veilig worden verhoogd.
3. Vergroot retinotomy tot 1,5 mm met verticale 23 G VR-schaar. De subretinale ruimte is nu toegankelijk voor implantatie of verdere manoeuvreren.
4. Extend sclerotomie (precies) met een 1,4 mm incisie mes om 20 G aanpak.
5. Poging die door de sclerotomie met behulp van een 20 G shooter dummy, te vergroten als nodig is om een ​​soepele, maar toch knus overgang van het geplaatste shooter te verzekeren.
6. Pas met de geladen shooter ²⁷ tot sclerotomie idealiter op 24 mmHg.
7. Aanpak retinotomy rand en verwijder het implantaat subretinally vanuit een epiretinaal positie.
8. Stel het implantaat met halfgesloten 23 G schaar, pincet of 41 G-naald om zeker te zijn is goed gepositioneerd onder de retina- redelijk weg van de retinotomy.

7.Ending Operation

1. Verwijder 25 G kroonluchter en infuuscanule.
2. Hechten alle sclerotomies.
3. Injecteer 25 pi (10 mg) triamcinolon door 08:00 sclerotomie (vóór hechten laatste sclerotomie).
4. Controleren / afstellen IOP door palpatie en injecteer BSS via 30 G naald / spuit, indien nodig.
5. Suture bindvlies met 7-0 Vicryl.
6. Verwijder proptosing 3-0 zijde sling langzaam (Vermijd diep orbitale veneuze plexus!).
7. Voeg dexamethason / antibiotische zalf onder deksel.
8. Positie 1 uur bedekt met deken geopereerde oog naar boven (w / o gas) of omlaag (met lucht / gas).
9. Do dier onbeheerd niet verlaten totdat het voldoende bewustzijn borstbeen recumbence handhaven herwint.
10. Do konijn niet vervoeren voor de verdoving volledig verdwijnt, kan deze worden versneld door het injecteren van medetomidine omkeren middel gelijk aan hoeveelheid medetomidine gegeven.

8. Post-operatieve Animal Care

1. Houdenkonijnen onder geschikte omstandigheden (temperatuur, licht, voedsel, water, ruimte, enz.) en nauwlettend toezicht in een gespecialiseerde faciliteit.
2. Zorg ervoor dat dier is goed uitgerust, dwz., Geen uitgebreide periodes van voedsel of water ontbering.
3. Kijk voor eventuele wonden of verwondingen, vooral op injectieplaats.
4. Houd wonden droog om infecties te voorkomen. Antibiotica geven wanneer infectie wordt vermoed: dexamethason 1 mg / g, neomycinesulfaat 3500 IU / g, polymyxine B sulfaat 6000 IU / g zalf werd tweemaal per dag gedurende 1 week postoperatief aangebracht op het oogoppervlak.
5. Voeg dexamethason / antibiotische zalf voor de komende 7 dagen na de operatie twee keer per dag voor een betere oculaire oppervlak regeneratie en minder postoperatieve pijn.
6. Geef systemische analgetica (Carprofene 4 mg / kg tweemaal daags) voor de eerste 48 uur.
7. Heeft een dier niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn heeft herwonnen aan borstbeen recumbence handhaven.
8. Heeft een dier niet terug datheeft een operatie ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld.
9. Hebben dieren niet bloot aan onnodig leed.

9. SLO / SD-oktober Guidance

1. Voor te bereiden en te injecteren intramusculaire (IM) verdoving met behulp van 1 spuit met 27 G naald met 0,175 mg / kg ketamine en 0,125 mg / kg medetomidine voor de start. Flip de spuit te mengen.
2. Voeg een smeermiddel tenminste elke 5 min in oog hydrateren en om vrijer SD-oktober imaging, eventueel een aangepaste contactlens kan worden gebruikt.
3. Bevestig een stalen platform aan de hoofdsteun aan het dier stabiliseren in de gewenste positie.
4. Plaats konijn op stalen platform, het plaatsen van zijn oog loodrecht op probe.
5. Houd het hoofd van het konijn van de lagere jukbeen (mandibula), het vermijden van de luchtpijp.
6. kanteling van het hoofd dier met ongeveer 45º naar de SD-oktober sonde naar de kijkhoek op het implantaat te optimaliseren.
7. Gebruik een 30-graden lens en de volgende parameters voor optiMAL oktober imaging [HS]: 30 graden instellingen voor enkele lijn scant met ART-modus ingesteld op 100 (gemiddeld) en 20 x 20 graden instellingen voor volume scans met ART-modus ingesteld op 15; hoge resolutie-modus is niet noodzakelijk.
8. Gebruik SLO infrarode reflectantie beeldvorming om het brandvlak van het implantaat (fig. 2A) vinden; optimale scherpstelling wordt bereikt wanneer (alle) het implantaat randen zijn scherp ^14.
9. Voeg dexamethason 1 mg / g, neomycine sulfaat 3500 IU / g, polymyxine B-sulfaat 6000 IU / g zalf onder deksel als u klaar bent.

Resultaten

De resultaten van de beschreven werkwijze voor implantatie subretinale zijn in Tabel 2 getoond Engraftment onder het netvlies had een succespercentage van ongeveer 61% bij een kern vitrectomie werd uitgevoerd en steeg tot 76%, bij glasvochtloslating geïnduceerd. Deze cijfers omvatten ca. 21% van de dieren die ofwel intra-operatief of in de eerste postoperatieve 3 dagen stierven. Deze techniek kan worden gebruikt om twee steigers op verschillende gebieden gelijktijdig retinale implantaat in een oog.

De konijnen ondergingen postoperatief in vivo opvolging via SD-OCT en histologische verwerking zoals beschreven door Stanzel et al. ²⁷ (figuur 2). Fig. Scanning laser oftalmoscoop infrarood reflectie beeld van geïmplanteerde gekweekt RPE op een polyester membraan (PET) 2A toont na een ongecompliceerde transplantatie. Dehalo rond implantaat correspondeert met atrofie fotoreceptor. Fig. 2B toont corresponderende SD-oktober, bericht het netvlies, vooral de buitenste nucleaire laag (ONL) dunner, hyper reflecterende band op SD-oktober boven implantaat, terwijl de neurale netvlies aangrenzend aan het implantaat toont bijna normale reflectie bands. Deze resultaten suggereren een atraumatische aflevering. Fig. 2C Hematoxiline / eosine (H / E) kleuring van de implantaten die subretinale littekens en ONL atrofie rond de retinotomy plaats waarschijnlijk het gevolg van iatrogene manipulatie toont een aaneengesloten maar onregelmatig gepigmenteerde laag over PET. Membraan van Bruch onder het implantaat bleek ook aaneengesloten te zijn, en de choriocapillaris bevat enkele verspreide erytrocyten. Deze morfologische resultaat zijn vergelijkbaar met de SD-oktober en versterking van de thesis van een atraumatische aflevering.

vijg ure 1: Laden Shooter met Human iPSC-RPE gekweekt op PET Cell Carrier. A) toont ponsen uit een implantaat met behulp van op maat gemaakte naald. B) Bean-vormige implantaat gesneden uit celkweek. C) Positionering van het implantaat vóór het laden. D) Laden van shooter met implantaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken .

Figuur 2: gekweekte humane hES-RPE op PET Cell Carrier 4 weken in Rabbit Subretinal Space. A) image infrarood reflectie SLO Shows, de groene lijn markeert de dwarsdoorsnede getoond in Fig. 2B. B) Overeenkomstige SD-oktober C) H / E vlek, zie tekst of ^26,27 voor meer informatie.ove.com/files/ftp_upload/53927/53927fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Parameter	gebruikte instellingen
vitrectomie	6000 sneden / min
Vacuüm	200 mmHg
Rise tijd	1 seconde
Lucht	24 mmHg
Irrigatie	24 cmH 2 O
DiathErmy	30%

Tabel 1: Parameter Instellen van de vitrectomie Machine.

vitrectomie	Implant	konijnen bediend	succesvolle implantaat	gefaald implantaat	Dood	Slaagkans%
Core vitrectomie	PET	30	19	4	7	63.33
	PET + RPE	70	42	12	16	60
PVD, ± plasmine w / PPV	PET	28	21	2	5	75
	PET + RPE	22	17	2	3	77,27

Tabel 2: Samenvatting van de laatste 150 activiteiten, waaronder Methode en Implant Type.

Discussie

Met behulp van een konijn model, is een veilige en reproduceerbare methode gepresenteerd voor transvitreal levering van gekweekte RPE op mobiele dragers in de subretinale ruimte met een op maat ontworpen shooter instrument. De beschreven methode biedt een korte / geoptimaliseerd chirurgische techniek voor het eenvoudig te leren, omdat het gaat om standaard technieken bij vitrectomie met subretinale manoeuvres. Uitkomst wordt aanzienlijk vergemakkelijkt door een schone vitreoretinale interface en intra-oculaire infuus dat vloeistof turbulentie vermijdt over de implantatie, het induceren van bleb netvliesloslating (BRD) bij lage IOP, het voorkomen van netvlies en schade sclera door de droogte en de juiste positionering van het konijn.

Wij waarschuwen Aangezien verscheidene intra-operatieve complicaties allen tijde voorkomen, belemmeren het succes van de implantatie, bijvoorbeeld intra- oculaire bloedingen, anaesthesie vervagen in essentiële stappen zoals de implantatie inklappen van BRD vanwege instrument manipulatie of oculaire hypotonie, rAbbit overlijden als gevolg van overmatige doses van de anesthesie, lage bloeddruk tijdens lange operatie waardoor hypoxische hersenschade of hyperthermie. Maar deze complicaties af met de tijd als ze snel worden aangepakt en opgelost door het verhogen van de ervaring van het chirurgisch team.

Sommige complicaties zou kunnen worden verminderd door het volgen van een paar eenvoudige, maar cruciale stappen. Smeermiddel worden toegevoegd om de 5-10 min cornea, sclera en conjunctivale beschadiging tijdens gebruik te voorkomen, en het handhaven van een duidelijke intraoculaire media, kan gedroogde / zwart sclera oorzaak van wonddehiscentie, wat leidt tot oculaire hypotonie en zijn / of intra-operatieve lekkage van sclerotomies. Heparine moet worden toegevoegd om de vorming van fibrine een film die bijzonder subretinale implantatie uitdagende en tegelijk toevoegen van epinefrine verminderen bloeden onder heparine ¹⁶ maakt voorkomen. Te lange heparine / epinefrine belichtingstijden (> 1 uur) te worden vermeden cornea ede voorkomenma door endotheliale decompensatie ^33, hypertensieve crisis of intra-operatieve fataliteit. Nauwgezet glasvocht verwijderd dient te worden uitgevoerd op instrumenten (ingang) poort aan het netvlies en / of choroïdale detachementen te voorkomen. Intra-oculaire instrumenten moeten worden wees in de richting posterior pool tot lens touch (oorzaken iatrogene cataract) of (post ter plaatse) schade aan het netvlies te voorkomen. Een intraoculair zijpoort infusiecanule worden gebruikt, omdat het vermindert de straalstroom rond het implantatiegebied, waardoor ongecontroleerde scheuren van de retinotomy en ineenstorting van de BRD voorkomen. BRD inductie in de middellijn (verticale as van de oogzenuw) of in de buurt van optische vezels medullaire moet worden vermeden om uitgebreide iatrogene netvliesloslatingen voorkomen. Ten slotte, last but not least BRD moet worden geïnduceerd bij lage IOP, om subretinale BSS injectie te vermijden gebruik van buitensporig debieten die kunnen leiden tot schade aan het netvlies (bijv., Door rekken).

Veel onderzoek variabelen zoals mobiele carrier varianten, foetale, volwassene of stamcel afgeleid RPE cel bronnen, keuzemogelijkheden voor immunosuppressiva, enz., kan worden verkend ^14,26,27,34. Verdere verbetering zoals serum-vrij RPE kweekmethoden, karakterisering van xenoRPE in subretinale ruimte, het verwijderen van de gastheer RPE laag ¹⁴ of strategieën voor het implantaat verankering zijn de huidige work in progress.

Tot op heden zijn de beschreven technieken zijn gebruikt op 5 verschillende konijn stammen, met inbegrip van chinchilla bastaard, Chinchilla bastard / KBL hybriden, Nieuw-Zeeland White / Rode Kruis, Nieuw-Zeeland White (albino) en Nederlands gordel. Zowel mannelijke als vrouwelijke konijnen werden geopereerd met konijnen tenminste 1,5 kg of 2 maanden (afhankelijk van soort). De meeste operaties waren op gepigmenteerde konijnen (chinchilla bastard of chinchilla bastaard hybriden) met gewichten tussen 2,5-3 kg.

Al het konijn stammen hebben we de kans om te werken met moesten lijken sommige eigenaardigheden hebben. Gezien de exclusive beschikbaarheid van gepigmenteerde konijnen van de chinchilla bastard stam in Duitsland in 2009-13, hebben we de meeste ervaring met deze dieren verzameld. Helaas is niet meer beschikbaar omdat de fokkerij is stopgezet, maar steekt zeer goed Nieuw Zeelandse witte / Rode Kruis behalve voordeliger dikker sclera en groter oog volumes in de laatste. Chinchilla bastard hybriden hebben aanzienlijke intra-operatieve fibrine vorming en vereisen heparine / epinefrine gebruik zoals hierboven beschreven om ervoor te zorgen succesvolle subretinale manoeuvres. Dit protocol is ook uitgevoerd in niet-gepigmenteerde albino konijnen (New Zealand White), echter bijzonder BRD Creatie en subretinale implantatie moeilijker gezien verminderd contrast waardering. De haalbaarheid van het induceren van een glasvochtloslating leek niet konijn stam afhankelijk in onze handen.

Transvitreal subretinale levering is waarschijnlijk de toekomst chirurgische strategie van keuze gezien is het de meest comm onderweg tegenwoordig klinisch om het netvlies. Als gevolg hiervan vele andere groepen zoals technieken hebben ingediend voor gekweekte RPE op carrier ondersteunt in dierlijke werk ^11,15,23,35. Aramant et al. ³⁶ een instrument dat in plaats plaatst duwt de hydrogel-ingekapselde zachte implantaat om haar subretinale doelplaats. Het ontwerp van Thumann et al. Maakt gebruik van een holle spatel, die de vervoerder ondersteunde implantaat releases door drijvende het uit door middel van vloeistofinjectie ^19. Beide voormalige strategieën vereisen subretinale inbrengen van het instrument, dat naar onze mening is meer kans op complicaties, in vergelijking met een epiretinally appositioned instrument. Montezuma et al. ²² beschreef een subretinale inserter instrument voor de levering van subretinale chip implantaten bij varkens, maar verder geen werk is sinds om het beste van onze kennis gepubliceerd. We hebben kunnen de beschreven techniek uitbreiden enige wijziging varken geweest.

jove_content "> Ons geprefereerde cel dragers 10 micron dikke polyester (PET) membranen. Vanuit chirurgisch perspectief, dit materiaal gunstige stijfheid en elasticiteit parameters, naast de brede toepassingsgebied in celcultuur experimenten. We hebben vergelijkbare ervaringen met uitgebreide tetrafluorethyleen (ePTFE) ³⁷ of nanovezel membranen electrospun uit PET, poly-melkzuur / capronolactic acid (PLCL) of poly -. melkzuur-co-glycolzuur (PLGA), alsook samengestelde nanovezel (PLGA of PET) en ultradunne PET ²⁶ Wanneer PET membranen worden gebruikt ons metallic schutter instrument, ze hebben incidentele neiging tot elektrostatische lading, die het uitwerpen uitdagingen van de schutter ^27. Ultradunne polyimide membranen kunnen in onze handen niet worden geïmplanteerd in de subretinale ruimte met de hierboven geschetste protocol vertonen ( manuscript in voorbereiding).

Marmor et al. hebben systematisch bestudeerd spontane resorption van subretinale vloeistof in iatrogene gelokaliseerde netvliesloslatingen ^38-41. Zelfs na manipulatie in de subretinale ruimte werden deze gevonden te worden opgenomen door postoperatieve dag 4 in rustig ingrepen. Laser retinopexie niet uitgevoerd om de randen van de retinotomy verzekeren. Hoewel de contra-intuïtief in vergelijking met de menselijke ingreep, wordt de lucht / gas tamponnade niet vereist. Tenzij zorgvuldige verwijdering van perifere glasachtige kan worden bereikt, met name in de hogere kwadrant, kan in feite leiden tot grote netvliesscheuren afkomstig van de retinotomy plaats. Het is alleen aan te raden om de vloeistof lucht uitwisseling met de daaropvolgende 20% SF6-gas tamponnade uit te voeren om intraoperative iatrogene netvliesloslatingen of bij een bepaalde positie van het implantaat moet worden beveiligd redden.

Hoewel de mechanisch geïnduceerde ablatie van de neurale retina en RPE fotoreceptor schade bij konijnen ^42,43 veroorzaken, de omvang varieert (zelfs regelmatig BSS) dehankelijk van factoren zoals IOP, spuittype gebruikte injectievolume met daarbij geïnduceerde retinale strekken, enz. We hebben ook getest het vaak aanbevolen Ca / Mg-vrij BSS gefaciliteerd onthechting ^42-44, maar vond dat het veroorzaakt intraoperatieve lens vertroebeling (met name bij verhoogde temperatuur), en aanzienlijk vertraagt ​​of zelfs schaadt het netvlies re-bevestiging ^27. Langzame subretinale injectie van 20-30 ul volume van de reguliere BSS met een 100 ul spuit wordt daarom aanbevolen; injectienaald bewegingen moet minimaal zodat de retinotomy afdichtingen rondom het zijn en het voorkomen van Bruch's membraan schade. Sommige van de iatrogene schade kan worden opgelost door RPE wondgenezing, en de waargenomen relatieve behoud van ONL dikte na herbevestiging, suggereert dat de RPE / fotoreceptor complex deze stoornis kan tolereren, zoals ook beschreven door anderen ^45.

-Cellen gebaseerde therapieën of netvlies protheses nodig preklinische animal testen voorafgaand aan de reglementaire goedkeuring en de veiligheid van de mens studies te beginnen. De voormalige verschillen van land tot land. Het konijn model hier beschreven, kan dienen als een kostenefficiënte en minder uitdagend platform voor het vaststellen van of zelfs het uitvoeren van alle eisen door de regelgevende instanties. Bovendien kan zij vervolgens dienen voor de opleiding van chirurgen in de uiteindelijke multicenter klinische onderzoeken of verdere verbeteringen van de techniek langs de weg.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
s30 ultrasoon reinigingsapparaat	Elmasonic	100 4631	2.75 L
DE-23  autoclaaf	Systec	C 2209	23 L
Spuit	BD	300013 300995  301285 300294 300330	1 ml x3 2 ml x3 5 ml x1 10 ml x1 20 ml x1
Naald	BD	305196 305136	18 G x1  27 G x5
Scalpel	Feather	2975#20	mestje#20 x3
Chirurgisch doek	HARTMANN LOHMANN & RAUSCHER	277 502 25 440	60 x 40 cm x2 12 x 17 cm
Oculair sticks	LOHMANN & RAUSCHER	16 516	66 x 5 mm
Twister gaasjes	HARTMANN	481 274	x2
Hechtstrips	HARTMANN	540 686	x4
Opmi Visu CS Microscoop	Zeiss	N/a	incl. fundus beeldvormingssysteem BIOM II
Chandelier endo-illuminatie	Geuder	G-S03503 + G-S03504	25 G incl. trocar
Lichtmachine	Geuder	G-26033	Xenotron III
Vitrectomie apparaat	Geuder	G-60000	MegaTRON S4 S4/ HPS
Vitrector	Geuder	G-46301	MACH2 glasvocht snijder 23 G
Venturi cassette	Geuder	G-60700
Sideport-infusie canule	Geuder	custom	23 G x1
3-0 zijden hechtdraad	ETHICON	V546G	x1
Rekglas	Geuder	G-19135	x2
Vannas schaar	Geuder	G-19777	x1
Sclerotomie mes	Ziemer	21-2301	1x 23 G 1x 20 G
7-0 zijden hechtdraad	ETHICON	EH6162H	x1
Naaldhouder	Geuder	G-32320	x2
Iris pincet	Geuder	G-18910	x1
Colibri pincet	Geuder	G-18950	x1
Uitbreidbare subretinale injectienaald	DORC	1270.EXT	41 G
VR schaar	Geuder	G-36542	25 G
Grieshaber pincethouder	Alcon	712.00.41	23 G
Gebogen schaar pincet punten	Alcon	723.52	23 G
Implantaat laadstation	Dow Corning	3097358-1004	SYLGARD 184 Siliconen Elastomer Kit
Blunt ovale implantaat trephine	Geuder	custom-made	2.4 x 1.1 mm
Shooter dummy	Geuder	G-32227	x1
Shooter	Geuder	G-S03443	x1
Flute naald	DORC	1281.SD	20 G (Vacuum)
Handmatige microliter spuit	Hamilton	24535	100 µl
Weefsel kweek platen	Greiner bio-one	664160	100 x 20 mm
Spectralis Multi-Modaliteit Beeldvormingssysteem	Heidelberg Engineering	N/a	Spectralis HRA  + OCT
Geneesmiddelen en oplossingen
Naam	Bedrijf	Actieve stof	Opmerkingen
Mucadont-IS	Merz Hygiene	virucidaal instrumenten desinfectiemiddel	2 L
Mucocit T	Merz Hygiene	Aldehyde-vrije instrumenten desinfectiemiddel	2 L
Ketamin 10%	WDT	Ketamine	10 ml (100 mg/ml)
Domitor	Orion Pharma	Medetomidine hydrochloride	10 ml (1 mg/ml)
Antisedan	Orion Pharma	Atipamezole hydrochloride	10 ml (5 mg/ml)
Neosynephrin POS 10%	URSAPHARM	Phenylephrine HCl	10 ml
Mydriacyl	Alcon	Tropicamid	10 ml (5 mg/ml)
Methocel 2%	Omni Vision	hydroxypropyl methylcellulose	10 g
PURI CLEAR	ZEISS	Balance zout oplossing (BSS)	500 ml
Glucose 5%	B.Braun	Glucose 5%  oplossing	100 ml
Heparin-Natrium-25.000	Ratiopharm	Heparine	5 ml (2.500 unit/ml)
Suprarenine	SANOFI	Epinefrine	1 ml (1 mg/ml)
Triamcinolon	University of Bonn apotheek	preservatiefvrije Triamcinolon	1 ml (40 mg/ml)
Isoptomax oogzalf	Alcon	dexamethason 1 mg/g neomycine sulfaat 3.500 IU/g polymyxine B sulfaat 6.000 IU/g	10 ml
Betaisodona	Mundipharma	Povidon-Jodium	30 ml (1 g/10 ml)
Optive	ALLERGAN	natrium carboxymethylcellulose glycerol	10 ml