Methodenartikel

Visualisatie van vasculaire en Parenchymale Regeneratie na 70% Gedeeltelijke hepatectomy in normale muizen

DOI:

10.3791/53935

⸱

13 september 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General, Visceral and Vascular Surgery, Jena University Hospital, 2Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, 3Fraunhofer Institute for Medical Image Computing MEVIS, 4Institute of Pathology, Klinikum Chemnitz gGmbH

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hulpmiddelen die worden gebruikt voor het visualiseren van vasculaire regeneratie vereisen methoden voor het contrasteren van de vasculaire bomen. Deze film toonde een delicate injectietechniek die werd gebruikt om een optimaal contrast van de vasculaire bomen te bereiken en illustreerde de potentiële voordelen die resulteren uit een gedetailleerde analyse van het resulterende specimen met behulp van µCT en histologische seriële secties.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een gemodificeerde silicone injectieprocedure werd gebruikt voor visualisatie van de lever vaatstelsel. Deze bestond uit het in vivo injectie van de silicone verbinding, via een katheter 26 G, in het portaal of de vena hepatica. Na silicone injectie werden organen geëxplanteerd en voorbereid voor ex-vivo micro-CT (μCT) scannen. De siliconen injectie procedure is technisch uitdagend. Het bereiken van een succesvol resultaat vergt veel microchirurgische ervaring van de chirurg. Een van de uitdagingen van deze procedure houdt de bepaling van de adequate perfusiesnelheid de siliconenverbinding. De perfusiesnelheid van de silicone verbinding moet worden gedefinieerd op basis van de hemodynamische van het vaatstelsel van belang. Ongepast perfusie tarief kan leiden tot een onvolledige perfusie, kunstmatige dilatatie en scheuren van vasculaire bomen.

De 3D reconstructie van het vasculaire systeem is gebaseerd op CT-scans en werd bereikt met behulppreklinische software zoals HepaVision. De kwaliteit van de gereconstrueerde vasculaire boom is direct gerelateerd aan de kwaliteit van siliconen perfusie. Vervolgens berekende vasculaire parameters voor vasculaire groei, zoals vasculaire totale volume werd berekend op basis van de vasculaire reconstructies. Contrasterende de vasculaire boom met siliconen toegestaan ​​voor verdere histologische work-up van het monster na μCT scannen. Het monster kan worden onderworpen aan seriële snijden, histologische analyse en objectglaasje scannen en daarna 3D reconstructie van het vasculaire bomen op basis van histologische afbeeldingen. Dit is een voorwaarde voor de detectie van moleculaire gebeurtenissen en hun verdeling met betrekking tot het vaatstelsel. Deze gemodificeerde siliconen injectieprocedure kan ook worden gebruikt voor het visualiseren en reconstrueren de vasculaire systemen van andere organen. Deze techniek heeft het potentieel uitgebreid worden toegepast op studies over vasculaire anatomie en groei van diverse dierlijke eenziektemodellen nd.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leverregeneratie wordt vaak bepaald door de toename van de lever gewicht en volume en door beoordeling van de hepatocyt proliferatiesnelheid 16. Echter, wordt de lever regeneratie niet alleen inducerende parenchymale regeneratie, maar ook vasculaire regeneratie 6. Daarom moet de groei van vasculaire nader worden onderzocht met betrekking tot zijn rol in de progressie van leverregeneratie. Visualisatie van de lever vasculaire systeem is cruciaal voor het bevorderen van ons begrip van vasculaire regeneratie. Talrijke indirecte methoden ontwikkeld om de onderliggende moleculaire mechanismen van hepatische regeneratie vasculaire onderzoeken. Traditioneel detectie van cytokinen (vasculaire endotheliale groeifactor, VEGF) 14, chemokinen en hun receptoren (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) 4 zijn de steunpilaar voor het bestuderen van vasculaire regeneratie geweest. Echter, een 3D-model, met kwantitatieve analyse van de vasculatuur kritische anatomische toevoegenaan een beter begrip van de belangrijke relatie tussen parenchymale en vasculaire regeneratie krijgen.

Om de lever vasculaire systeem, dat vereist contrasterende het vasculaire bomen te visualiseren, werden muizen geïnjecteerd met een radiopake siliconenrubber contrastmiddel direct in de portal of leverinsufficiëntie veneuze vasculaire boom. Na polymerisatie van de silicone en uitname van het orgaan, werden de lever monsters onderworpen aan μCT scannen met een CT-scanner. De scans resulteerde in voxel afbeelding representaties van de siliconen-injectie specimens 9.

Voor kwaliteitscontrole, werd het vasculaire systeem voor het eerst gevisualiseerd in 3D met behulp van preklinische software. Segmentatie werd uitgevoerd door een drempel tussen het zachte weefsel intensiteit en de intensiteit vat. Het verkregen masker vat werd zichtbaar gemaakt met oppervlak rendering. De software werd ook rekening handmatig bepalen van twee parameters van Vascular groei: maximale scheepslengte en radius.

Een preklinische software werd vervolgens gebruikt voor 3D-reconstructie van vasculaire bomen en nacalculatie van de toe- of afvoer van vasculaire gebieden 13. Daarnaast is deze software automatisch bepaald aantal parameters van vasculaire groei, zoals de totale lengte van alle zichtbare vasculaire structuren ook bekend als de totale ribbe of totale verblijf.

De siliconen perfusie procedure werd uitgevoerd bij naïeve muizen en in muizen die onderging 70% gedeeltelijke hepatectomie (PH). Levers werden verzameld op verschillende observatie tijdstippen na resectie voor het analyseren van vasculaire en parenchymale leverregeneratie met behulp van de eerder genoemde visualisatie en kwantificering techniek.

De hoofddoelen van deze film zijn: (1) tonen de delicate injectie-techniek vereist om optimale contrasterende en (2) tonen de mogelijke voordelen verkregen fr verwezenlijkenOM een gedetailleerde analyse van de resulterende monster met behulp van μCT en histologische seriecoupes. Na het bekijken van deze film wordt de lezer een beter begrip van hoe siliconeverbinding injecteren in een specifieke vaatstelsel en het nut en de toepasbaarheid van de techniek hebben.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz Abteilung Tiergesundheit und Tierschutz, Duitsland. Omdat het portaal veneuze systeem los van de lever veneuze systeem werd gevisualiseerd, werden afzonderlijke dieren die nodig zijn voor de verschillende vasculaire bomen.

1. Reagentia Voorbereiding

  1. Heparine-zoutoplossing
    1. Voeg 0,1 ml héparine in 10 ml zoutoplossing (5 IU / ml).
  2. Silicone compound mengsel
    1. Voeg 2 ml MV-120 in een 5 ml buis. Verdun MV-120 door toevoeging van 3 ml MV verdunningsmiddel resulteert in een 40% oplossing.

2. Portal veneuze systeem Silicone Injection

  1. laparotomie
    1. Plaats de muis in de anesthesie inductie kamer en verdoven met 2% isofluraan en 0,3 l / min zuurstof.
    2. Bevestig de verdoofde muis op de operatietafel met behulp van tape met continue inademing van 2%oflurane en 0,3 l / min zuurstof. Controleer de toe-snuifje reflex terugtrekking van de muis en start de werking als de reflex afwezig is.
    3. Voeg een dwarse incisie op de buik met een schaar van de huidlaag en een elektrische coagulator de spierlaag. Beweeg de darmen naar de linkerkant met behulp van katoen tips en hebben betrekking op de darmen met een zoutoplossing gedrenkt gaasje.
  2. katheterinsertieplaatsen
    1. Ontleden poortader onder de microscoop met micro-pincet. Plaats een 6-0 zijden hechtdraad onder de ader extrahepatische portal, in ongeveer 1 mm afstand tot de splitsing en bind het losjes voor later gebruik.
    2. Injecteren bereid heparine-zoutoplossing via een ader van de penis (mannelijk) of inferior vena cava (vrouwelijke) voor systemisch heparinisatie gedurende 5 minuten.
    3. Steek de 26-gauge (26 G) katheter met een naald in de poortader en zet het vast met een klem
  3. Heparine-zoutoplossing en siliconen verbinding perfusie
    1. Load heparine-zoutoplossing solution in 5 ml spuit en zet perfusie apparaat. Vul het catheter volledig met heparine-zoutoplossing om luchtbellen te voorkomen.
    2. Sluit de allonge aan de katheter en strak ze op te lossen. Start heparine-zoutoplossing perfusie met een perfusie snelheid van 0,4 ml / min.
    3. Ligeer pre-geplaatste 6-0 zijden hechtdraad voor dubbele vaststelling van de katheter en het blokkeren van de bloedstroom van de milt ader en mesenteriale ader. Euthanatize de muis door verbloeding via perfusie onder verdoving.
    4. Spoel de lever via zoutoplossing gedurende de gehele perfusie procedure om het vochtig te houden.
    5. Voeg 0,1 ml verharder in de MV-120 buis. Veranderen heparine-zoutoplossing spuit siliconen spuit.
    6. Begin silicone perfusie perfusie met een snelheid van 0,2 ml / min gedurende ongeveer 1 min tot het kathetersysteem Prefill en de poortader installatie te vullen. Stop met silicone perfusie wanneer de schepen op het oppervlak blauw worden.
  4. monsterneming
    1. Houd de lever in situ until het silicone volledig na ongeveer 15 tot 30 minuten gepolymeriseerd. Ontleden ligamenten aansluiten van de lever en de aangrenzende organen met zorg aan de lever intact te houden. Explanteer de lever en zet het in formaline voor fixatie.

3. Verminderde veneuze systeem Silicone Injection

  1. Voer laparotomie zoals uitgevoerd in stap 2.1 en bloot operatiegebied volledig.
  2. katheterinsertieplaatsen
    1. Ontleden poortader onder de microscoop met micro-pincet. Plaats een 6-0 zijden hechtdraad onder de ader extrahepatische portal, in ongeveer 1 mm afstand tot de splitsing en bind het losjes voor later gebruik.
    2. Injecteren bereid heparine-zoutoplossing via een ader van de penis (mannelijk) of inferior vena cava (vrouwelijke) voor systemisch heparinisatie gedurende 5 minuten.
    3. Steek een 26 G catheter (catheter 1) met een naald in de poortader en zet het vast met een klem. Plaats een andere 26 G catheter (catheter 2) met de naald in de vena cava inferior en zet het vast met een klem.
    4. Afbinden de takken van de vena cava inferior (met inbegrip van links en rechts renale aderen) en het distale einde met behulp van 6-0 synthetisch, monofilament, niet-absorbeerbare polypropyleen hechtdraad.
  3. Heparine-zoutoplossing en siliconen verbinding perfusie
    1. Laad heparine-zoutoplossing in 5 ml spuit en zet perfusie apparaat. Vul catheter 1 compleet met heparine-zoutoplossing om luchtbellen te voorkomen. Sluit uitbreiding buis catheter 1 en zet het stevig vast. Start heparine-zoutoplossing perfusie met een snelheid van 0,4 ml / min.
    2. Ligeer pre-geplaatste 6-0 zijden hechtdraad voor dubbele vaststelling van de katheter en het blokkeren van de bloedstroom van de milt ader en mesenteriale ader. Euthanatize de muis door verbloeding via perfusie onder verdoving.
    3. Spoel de lever via zoutoplossing gedurende de gehele perfusie procedure om het vochtig te houden. Voeg 0,1 ml verharder in de MV-120 buis. Exchange heparine-zoutoplossing spuit met siliconen spuit.
    4. Plaats een klem op de suprahepatic inferior vena cava om de uitstroom van de lever belemmeren.
    5. Sluit de allonge aan katheter 2 en begin silicone perfusie met een perfusie snelheid van 0,2 ml / min gedurende ongeveer 2 minuten om een ​​objectieve levervaten volume te bereiken zoals gerapporteerd. Stop met silicone perfusie wanneer de schepen op het oppervlak blauw worden.
  4. monsterneming
    1. Ontleden lever ligamenten berokkende schade te voorkomen aan de lever. Explanteer de lever en zet het in formaline voor fixatie.

4. Micro-CT (μCT) Scannen

Om de geëxplanteerde lever monster scannen met behulp van μCT, zijn de volgende stappen die nodig zijn.

  1. Neem de lever monster uit de fixatie-oplossing. Plaats de lever op de μCT bed. Doe de μCT bed met de lever monster in de μCT.
  2. Verwerven topogram voor aanvang van de scan. Gebruik een subscan voor de kleine lever monster en twee subscans voor grote steekproeven.
  3. Selecteer een81, CT-protocol met een hoge resolutie (bijv HQD-6565-390-90). Dit protocol verwerft 720 projecties met 1032 x 1012 pixels bij een volledige omwenteling met de scantijd van 90 sec per sub-scan. Start de μCT scan.

5. Histologische seriecoupes

  1. Insluiten de lever model in paraffine als geheel na μCT scannen. Snijd hele paraffine monster in 4 pm secties, waardoor een reeks van 2000 tot 2500 delen.
  2. Vlek secties met de juiste kleuring techniek te visualiseren moleculaire gebeurtenissen van belang, zoals Ki-67 als proliferatie marker en HMGB1 als een marker van ischemische schade. Bepaal de volgorde van de kleuring in ten opzichte van de wetenschappelijke vraag.
  3. Gebruik een hele dia scanner om de gekleurde coupes digitaliseren.
  4. Voer 3D-reconstructie van vasculaire boom (s) (al haalbaar) en visualiseren 3D-verdeling van de moleculaire gebeurtenissen met betrekking tot vasculaire boom (onderzoek in uitvoering).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

kwaliteitscriteria

De kwaliteit van siliconen injectie kan worden beoordeeld met het blote oog tijdens de procedure. De kleine bloedvaten op het oppervlak van de lever te vullen geleidelijk aan met de blauwe verbinding. Als de normale vasculaire structuur werd waargenomen op het oppervlak lever, de siliconen rubber injectie kwaliteit was goed. Wanneer de perfusie volume onvoldoende was, werden de kleine bloedv...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Contrasterende de vasculaire boom door siliconen injectie en μCT scanning is geïntroduceerd in tumor modellen en neurologische ziekte modellen vaak naar de angiogene progressie 5,7,8,10 bestuderen. Verbeteringen in de methodologie van siliconen injectie werden gemaakt in de huidige studie voor het visualiseren en kwantificeren van vasculaire groei na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen.

Er zijn een aantal kritische stappen aandacht nodig om goede perfusie kwaliteit. Allereerst w...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs danken voor de financiering door het Duitse Ministerie van Onderwijs en Wetenschap (BMBF) via het systeembiologienetwerk "Virtual Liver", subsidienummers 0315743 (ExMI), 0315765 (UK Jena), 0315769 (MEVIS). De auteurs danken ook Frank Schubert voor technische ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
PERFUSOR® VIB.BRAUN87 222/0
Pipetus®-akkuHirschmann9907200
PipettenGreiner606180
micro scissorsFine Science Tools (F·S·L)No. 14058-09
micro serrefineFine Science Tools (F·S·L)No.18055-05
Micro clamps applicatorFine Science Tools (F·S·L)No. 18057-14
Straight micro forcepsFine Science Tools (F·S·L)No. 00632-11
Curved micro forcepsFine Science Tools (F·S·L)No. 00649-11
needle-holderFine Science Tools (F·S·L)No. 12061-01
1 ml syringeB.Braun9161406V
5 ml syringeB.Braun4606051V
extension and connection linesB.Braun425600030 cm, inner ø 1.2 mm
6-0 silk (Perma-Hand Seide)Ethicon639H
6-0 proleneEthicon8711H
Microfil® MV diluentFLOW TECH, INC
Microfil® MV - 120FLOW TECH, INCMV - 120 (blue)
MV curing agentFLOW TECH, INC
Heparin 2500 I.E./5 mlRotexmedicaETI3L318-15
SalineFresenius Kabi Deutschland GmbHE15117/D DE
Imalytics Preclinical softwareExperimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany
HepaVisionFraunhofer MEVIS, Bremen, Germany
NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scannerHamamatsu Electronic Press, Japan C9600
Tomoscope Duo CT CT Imaging GmbH, Erlangen, GermanyTomoScope® Synergy

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bearden, S. E., Segal, S. S. Neurovascular alignment in adult mouse skeletal muscles. Microcirculation. 12 (2), 161-167 (2005).
  2. Brown, R. P., Delp, M. D., Lindstedt, S. L., Rhomberg, L. R., Beliles, R. P. Physiological parameter values for physiologically based pharmacokinetic models. Toxicol.Ind.Health. 13 (4), 407-484 (1997).
  3. Dai, D., et al. Elastase-Induced Intracranial Dolichoectasia Model in Mice. Neurosurgery. , (2015).
  4. Ding, B. S., et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature. 468 (7321), 310-315 (2010).
  5. Downey, C. M., et al. Quantitative ex-vivo micro-computed tomographic imaging of blood vessels and necrotic regions within tumors. PLoS.One. 7 (7), 41685(2012).
  6. Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. , (2014).
  7. Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. Am.J.Pathol. 184 (2), 431-441 (2014).
  8. Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT. J.Neurosci.Methods. 221, 70-77 (2014).
  9. Gremse, F., et al. Hybrid microCT-FMT imaging and image analysis. J.Vis.Exp. (100), (2015).
  10. Jing, X. L., et al. Radiomorphometric quantitative analysis of vasculature utilizing micro-computed tomography and vessel perfusion in the murine mandible. Craniomaxillofac.Trauma Reconstr. 5 (4), 223-230 (2012).
  11. Melloul, E., et al. Small animal magnetic resonance imaging: an efficient tool to assess liver volume and intrahepatic vascular anatomy. J.Surg.Res. 187 (2), 458-465 (2014).
  12. Schwier, M., Bohler, T., Hahn, H. K., Dahmen, U., Dirsch, O. Registration of histological whole slide images guided by vessel structures. J.Pathol.Inform. 4 ((Suppl)), 10(2013).
  13. Selle, D., Preim, B., Schenk, A., Peitgen, H. O. Analysis of vasculature for liver surgical planning. IEEE Trans.Med.Imaging. 21 (11), 1344-1357 (2002).
  14. Shergill, U., et al. Inhibition of of VEGF- and NO-dependent angiogenesis does not impair liver regeneration. Am.J.Physiol Regul.Integr.Comp Physiol. 298 (5), 1279-1287 (2010).
  15. Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. J.Surg.Res. 184 (1), 365-373 (2013).
  16. Wei, W., et al. Rodent models and imaging techniques to study liver regeneration. Eur.Surg.Res. 54 (3-4), 97-113 (2015).
  17. Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. J.Vis.Exp. (92), e51955(2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Vasculaire regeneratiehepatectomiemodelsiliconeninjectieMicroCT scanning3D vasculaire reconstructiepoortaderinjectieleveraderperfusiewhole slide scannerKi 67 markerHepaVision software

Gerelateerde artikelen