Murine Hind Limb Long Bone Dissection en Bone Marrow Isolation

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor de dissectie van lange achterbeenbotten (dijbeenderen en scheenbeenderen) van de laboratoriummuis. We beschrijven verder een snelle techniek voor beenmergisolatie uit deze botten die centrifugatie gebruikt voor het verwijderen van beenmerg uit de beenmergholte.

Samenvatting

Onderzoek naar het bot en het beenmerg is van cruciaal belang in vele onderzoeksgebieden, waaronder fundamentele botbiologie, immunologie, hematologie, kankermetastase, biomechanica en stamcelbiologie. Ondanks het belang van het bot in gezonde en pathologische toestanden, is het echter een grotendeels onderbelicht orgaan vanwege een gebrek aan gespecialiseerde kennis van botdissectie en beenmergisolatie. Muizen zijn een veelgebruikt modelorganisme om effecten op bot en beenmerg te bestuderen, wat een gestandaardiseerde en efficiënte methode vereist voor de dissectie van lange botten en isolatie van beenmerg voor de verwerking van grote experimentele cohorten. We beschrijven een eenvoudige dissectieprocedure voor het verwijderen van het dijbeen en scheenbeen die geschikt is voor downstream toepassingen, inclusief maar niet beperkt tot histomorphologische analyse en sterktetesten. Daarnaast beschrijven we een snelle procedure voor de isolatie van beenmerg uit de lange botten via centrifugatie met beperkte handelingstijd, ideaal voor celsortering, primaire celcultuur of DNA-, RNA- en eiwitextractie. Het protocol is gestroomlijnd voor snelle verwerking van monsters om experimentele fouten te beperken en is gestandaardiseerd om gebruikersvariabiliteit te minimaliseren.

Inleiding

De studie van lange botten en de cellen van het beenmerg staat centraal in een groot aantal onderzoeksdisciplines, waaronder, maar niet beperkt tot, botbiologie, kankerbiologie, immunologie, hematologie en biomechanica. Het bot is een zeer dynamisch orgaan dat samen met het kraakbeen het skelet vormt om mechanische ondersteuning te bieden tegen belasting en bescherming van de inwendige organen. Bovendien zijn de minerale componenten van bot een opslagplaats voor de kritische signaalmoleculen calcium en fosfor, evenals andere factoren¹. Ten slotte herbergen botten het beenmerg en bieden, samen met metabolisch actieve botvormende osteoblasten en botresorbering veroorzakende osteoclasten, de stamcelnich die nodig is voor het onderhoud van hematopoëtische en lymfoïde celpopulaties.

Bot en beenmerg worden aangetast bij veel aandoeningen, wat vaak leidt tot beenmergdisfunctie, ernstige botpijn en pathologische fracturen. Bot is een veelvoorkomende plaats voor metastase in veel solide tumoren, met name borstkanker en prostaatkanker, waarbij tumorcellen direct de beenmergniche aangaan om de vicieuze cirkel van botmetastase en verdringing van hematopoëtische stamcellen te initiëren^2,3. Hematopoëtische maligniteiten, waaronder myeloom en leukemie, worden gekenmerkt door beenmergdisfunctie en regulering van gezond botremodellering¹. Andere niet-maligne skeletaandoeningen zijn ook actieve onderzoeksgebieden, zoals artrose, osteoporose, scoliose en rachitis. Zelfs bij een anderszins gezond individu leidt biomechanisch falen in een bot tot een pijnlijke fractuur. Al deze aandoeningen vertegenwoordigen actieve onderzoeksgebieden met als doel nieuwe preventieve maatregelen en behandelingsregimes te identificeren om morbiditeit en mortaliteit te verminderen.

Om de veelvoud aan rollen van het bot en het beenmerg te onderzoeken, zowel onder fysiologische als pathologische omstandigheden, is het van cruciaal belang dat onderzoekers beschikken over een eenvoudige en efficiënte gestandaardiseerde methode voor het dissekeren van de lange muisbotten voor snelle verwerking van grote in vivo experimenten. Het hier beschreven dissectieprotocol is geschikt voor alle lange botanalyses, waaronder ex vivo beeldvorming, histologie, histomorfometrie en sterkteverificatie, onder anderen. Evenzo is een gestandaardiseerde beenmergisoleermethode met hoge beenmergcellenherstel en lage intergebruikersvariabiliteit belangrijk voor experimentele analyse zoals fluorescein-geactiveerde celsortering (FACS) of kwantitatieve PCR (qPCR) evenals downstream-toepassingen zoals primaire celcultuur van beenmergcellen.

Protocol

Alle dierlijke werk werd in overeenstemming met de in de Guide geschetst voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health aanbevelingen goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite.

1. Hind Limb Long Bone Dissection

1. Euthanaseren de muis in overeenstemming met de institutionele richtlijnen.
2. Plaats de muis in een liggende positie en bevestig door pinning alle vier de poten door de muis voetzooltjes onder het enkelgewricht.
3. Spuit de muis met 70% ethanol, goed dousing de benen.
4. Maak een kleine incisie aan de rechterkant van de middellijn in de onderbuik, net boven de heup.
5. Verleng de incisie langs de been en langs het enkelgewricht.
6. Trek de huid en snijd de quadriceps spieren verankerd aan proximaal uiteinde van het femur op de voorste zijde van het dijbeen bloot te leggen en pin uit het been, het plaatsen van de pen in een hoek van 45 graden van het bord.
7. Met het blade van de schaar tegen de dorsale zijde van het dijbeen, snijd de hamstrings van het kniegewricht.
8. Trek de huid en de hamstrings verankerd aan het proximale einde van het dijbeen naar de achterste zijde van het dijbeen bloot te leggen en pin uit het been, het plaatsen van de pen in een hoek van 45 graden van het bord.
9. Met de tang, houdt het distale uiteinde van het femur, net boven het kniegewricht. Leid de bladen van de schaar op beide zijden van de femorale schacht naar het heupgewricht, zorg dat in de femur zelf te snijden.
10. Na het bereiken van de heupkop, aangegeven door de schaar iets openen, draai de schaar met het bovenblad van de schaar bewegen direct over de heupkop naar het dijbeen ontwrichten, en let op het bot onder de heupkop niet te breken.
11. Pak de bovenkant van de femorale as met de tang, snijd het zachte weefsel weg van de femurkop om deze uit het acetabulum.
12. Trek de hele been bot, met inbegripfemur, knie en scheenbeen, en weg van het lichaam, zorgvuldig wegsnijden van het bindweefsel en spieren verbinden het been aan de huid.
13. Soms gedwongen het enkelgewricht en weer gebruik maken van de schaar in een draaiende beweging aan het scheenbeen ontwrichten.
14. Grijpen de distale einde van het scheenbeen, zorg ervoor dat u de pezen verbreken, trekt u de tibia omhoog en weg van het lichaam en het prikbord.
15. Snijd de resterende bindweefsel vastmaken van het pijpbeen de muis bij de knie.
16. Verwijder extra spier- of bindweefsel bevestigd aan het femur en de tibia.
17. Voor alle toepassingen die het been nodig hebben om intact (histologie, histomorfometrie, biomechanische testen, enz.) Blijven doorgaan met standaard in-house protocollen (zoals in ^4-7). Beenmerg te isoleren, gaat u verder met deel 2.

2. Lange Bone Voorbereiding van Bone Marrow Isolation

1. Met behulp van de tang, pakt het dijbeen met de knieschijf afgekeerd eennd het proximale einde (heupkop) naar beneden.
2. Soms gedwongen het kniegewricht en gebruik de schaar in een draaiende beweging van de tibia en femur ontwrichten.
3. Snijd elke bindweefsel houdt het bovenbeen en onderbeen samen.
4. Met behulp van de tang, pakt het dijbeen met de voorste afgekeerde zijde en het proximale uiteinde (heupkop end) naar beneden.
5. Leid de schaar de femurschacht aan de condylen.
6. Voorzichtig draai de schaar heen en weer naar de knobbels, de knieschijf te verwijderen, en de epifyse naar de metafyse bloot te leggen.
7. Verwijder extra spier- of bindweefsel bevestigd aan het femur via forceps, scharen en Kimwipes.
8. Met behulp van de tang, pak de tibia met de voorste afgekeerde zijde en het distale einde (enkel end) naar beneden.
9. Als het scheenbeen epiphysis intact is, begeleiden de schaar de tibia schacht naar de condylen.
10. Voorzichtig draai de schaar heen en weer om de knobbels te verwijderen en epifyse naar de metaph bloottion.
11. Verwijder extra spier- of bindweefsel aan de tibia behulp forceps, scharen en Kimwipes.

3. Bone Marrow Isolation

1. Duw een 18 G naald door de bodem van een 0,5 ml microcentrifugebuis.
2. Plaats de lange botten (maximaal 2 scheen- en 2 tibiae) in de buis, knie-end naar beneden eind naar beneden en sluit het deksel.
3. Nest de 0,5 ml microcentrifugebuis in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
4. Centrifugeer de buizen bij geneste ≥10,000 xg in een microcentrifuge 15 seconden.
5. Controleer of het beenmerg is gekomen uit de botten werden gesponnen door visuele inspectie. De botten moeten verschijnen wit en er moet een grote visuele pellet in de grotere buis.
6. Gooi de 0,5 ml microcentrifugebuis met de beenderen.
7. Suspendeer het beenmerg in geschikte oplossing (bijvoorbeeld PBS, kweekmedia FACS buffer) en vult experimentele protocol (DNA, RNA of eiwit isolatie,FACS-analyse, of primaire celkweek).

Resultaten

De hier beschreven protocol geoptimaliseerd voor snelle ontleding van de muis femur en tibia met minimale schade aan het botweefsel. Deze techniek is geschikt voor een aantal downstream analyses, waaronder biomechanica studies, histomorfometrie (Figuur 1 A - B) en histologie (figuur 1C) ^4,7. De representatieve histomophometric micoCT 3D reconstructie (Figuur 1 A - B) toont aan dat zowel de poreuze bot en corticale mantel worden gesteld dat een accurate kwantificering van de gestandaardiseerde structurele parameters voor bothistomorfometrie, zoals trabeculaire aantal, dikte en afstand; volume bot; en corticale dikte, naast andere maatregelen ^8. De vertegenwoordiger histologisch deel toont een H & E gekleurde formaline gefixeerde en ontkalkt tibia (figuur 1C). De afbeelding toont de integriteit van zowel de verkalkte béén en cellulaire beenmerg voor histologische analyse.

Het beenmerg isolatie procedure behoudt de steriliteit van het beenmerg ruimte, heeft een lage handling ter beperking van verontreiniging, en doet het snijden van de lange bot niet nodig, waardoor het verlies van beenmerg opbrengst verminderen. Het beenmerg is geschikt voor vele verdere toepassingen, waaronder flowcytometrie ⁵ en PCR-analyses. Bovendien kan deze werkwijze worden gebruikt om beenmerg te primaire celkweek van beenmergcellen, waaronder osteoclasten en osteoblasten (Figuur 2A - B) isoleren ^4,6.

Figuur 1. Histomorfometrische en histologische analyses van muis pijpbeen. Driedimensionale microCT reconstructie van een muis tibia toont (A) de buitenste corticale schil en (B trong>) trabeculair bot (schaal bar = 0,5 mm). (C) histologische H & E kleuring van een ontkalkt en deelbaar tibia (4x). Afbeeldingen met dank aan Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Primaire Bone Marrow Cultuur van de Cel voor differentiatie van osteoclasten en osteoblasten. (A) TRAP kleuring voor meerkernige osteoclasten na 7 dagen in osteoclastogenic media (4x). (B) Alkaline fosfatase (paarse kleur) voor osteoblasten en alizarinerood (rode kleur) vlek voor mineralisatie na 21 dagen in osteogene media. Afbeeldingen met dank aan Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA.iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

We presenteren een eenvoudige en efficiënte methode voor het verwijderen van achterste lange botten van muizen en de daaropvolgende isolatie van beenmerg. Deze methode behoudt de hoge structurele en cellulaire integriteit van de botten en het beenmerg en heeft een lage verwerkingstijd, waardoor de kans op door de gebruiker veroorzaakte breuk of botbeschadiging die downstream analyses kunnen beïnvloeden, wordt geminimaliseerd. Bovendien vereist de centrifugatiemethode voor het isoleren van beenmerg geen snijden van het bot om het beenmergruiimte of -vloeistof bloot te leggen om het beenmerg te spoelen, waardoor potentiële besmettingspunten worden verminderd. Bovendien is de centrifugetechniek relatief hoogdoorvoerig met minder hands-on tijd dan andere methoden, waardoor de verwerkingstijd wordt verkort.

Hoge variatie is inherent aan in vivo muisstudies vanwege de hoge fenotypische variatie tussen muizen. Om de onderzoeksimpact van dure en arbeidsintensieve muisstudies te maximaliseren, is het van cruciaal belang om technische experimentele fouten^9,10 te minimaliseren. De tijd van dierenafslachting tot downstream analyse of weefselfixatie introduceert experimentele variatie die subtiele veranderingen kan overwinnen en grote verschillen tussen groepen kan verminderen. Daarom is snelle verwerking van monsters essentieel voor nauwkeurige gegevensanalyse. De hier beschreven technieken voor het dissecteren van lange botten en het isoleren van beenmerg zijn geoptimaliseerd voor snelle verwerking van dieren en monsters om technische variatie te verminderen.

Dit protocol kan breed worden toegepast op vele onderzoeksgebieden, inclusief onderzoek naar het botweefsel zelf of het ondervragen van de cellen van het beenmerg. Bovendien zal deze eenvoudige aanpak voor het dissecteren van lange botten onderzoekers op aanverwante gebieden in staat stellen om direct beenbijdragen te ondervragen om onze kennis van beenmergdisfunctie in anderszins onderbelichte pathologieën uit te breiden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Pinboard
Pins
70% Ethanol
Dissectie schaar
Dissectie pincet
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120
16 G naald
1.5 ml Microcentrifuge buisje
0.5 ml Microcentrifuge buisje
Microcentrifuge