Glycan Node Analyse: een bottom-up benadering van Glycomics

Samenvatting

Dit artikel presenteert een verbeterde vorm van een nieuwe bottom-up glycomische techniek die is ontworpen om het gepoolde samenstellingsprofiel van glycanen in niet-gefractioneerde biofluiden te analyseren door de chemische afbraak van glycanen in hun samenstellende bindingsspecifieke monosacchariden voor detectie door GC-MS. Mogelijke toepassingen omvatten vroege detectie van kanker en andere glycan-beïnvloedende aandoeningen.

Samenvatting

Glycans, gesynthetiseerd in een niet-sjabloon-gedreven proces door enzymen genaamd glycosyltransferasen, spelen een sleutelrol in verschillende belangrijke intra- en extracellulaire gebeurtenissen. Veel pathologische aandoeningen, met name kanker, beïnvloeden de genexpressie, wat op zijn beurt de relatieve abundantie en activiteitsniveaus van glycosidasehydrolase- en glycosyltransferase-enzymen kan dereguleren. Unieke abnormale hele glycanen die het gevolg zijn van gedereguleerde glycosyltransferase(s) zijn vaak aanwezig in sporenhoeveelheden binnen complexe biovloeistoffen, waardoor hun detectie moeilijk en soms stochastisch is. Echter, met de juiste monstervoorbereiding kan een van de oudste vormen van massaspectrometrie (gaschromatografie-massaspectrometrie, GC-MS) routinematig de verzameling van takpunt- en koppelingsspecifieke monosachariden ("glycan-knooppunten") detecteren die aanwezig zijn in complexe biovloeistoffen. Als aanvulling op traditionele top-down glycomics-technieken omvat de hier besproken aanpak het verzamelen en condenseren van elk afzonderlijk glycan-knooppunt in een monster tot een enkele onafhankelijke analytische signaal, wat gedetailleerde structurele en kwantitatieve informatie biedt over veranderingen in het glycoom als geheel en onthult mogelijk gedereguleerde glycosyltransferasen. Verbeteringen aan de permethylatie en de daaropvolgende vloeistof/vloeistof-extractiefasen die hier worden geboden, verbeteren de reproduceerbaarheid en het totale opbrengst door minimale blootstelling van pergemethyleerde glycanen aan alkalische waterige omstandigheden te vergemakkelijken. Wijzigingen in de acetyleringsfase verhogen verder de mate van reactie en het totale opbrengst. Ondanks hun reproduceerbaarheid, blijken de totale opbrengsten van N-acetylhexosamine (HexNAc) gedeeltelijk pergemethyleerde alditolacetaten (PMAA's) inherent lager te zijn dan hun verwachte theoretische waarde ten opzichte van hexose PMAA's. Het berekenen van de verhouding van de oppervlakte onder het geëxtraheerde ionenchromatogram (XIC) voor elke individuele hexose PMAA (of HexNAc PMAA) tot de som van dergelijke XIC-gebieden voor alle hexosen (of HexNAcs) biedt een nieuwe normalisatiemethode die relatieve kwantificering van individuele glycan-knooppunten in een monster mogelijk maakt. Hoewel momenteel beperkt in termen van zijn absolute detectielimieten, versnelt deze methode de analyse van klinische biovloeistoffen en toont aanzienlijk potentieel als een aanvullende aanpak voor traditionele top-down glycomics.

Inleiding

Glycolipiden, glycoproteïnen, proteoglycanen en glycosaminoglycanen vormen de vier hoofdklassen van complexe heterogene koolhydraten gezamenlijk bekend als glycanen. Zo alomtegenwoordig en een integraal onderdeel van het plasmamembraan, glycocalyx, en extracellulaire matrix en vloeistoffen, glycanen deel te nemen aan zulke uiteenlopende biochemische processen als endocytose, intracellulaire mensenhandel, celmotiliteit, signaaltransductie, moleculaire herkenning, receptor activering, celadhesie, gastheer-pathogeen interactie , intercellulaire communicatie immunosurveillance en immuunrespons initiëren. ¹ aanwezig in bijna elk gebied van het leven, enzymen bekend als glycosyltransferasen die glycan polymeren bouwen handelen combinatie met glycoside hydrolasen (ook bekend als glycosidases, wat neerkomt glycanen breken) te bouwen, verbouwen, en uiteindelijk produceren afgerond glycan polymeren ^2. Hoewel elk glycosyltransferase kan werken op verschillende glycoconjugaten, een glycosyltransferaseAldus wordt een algemeen linkage- en anomeer specifieke glycosidische binding in door de monosaccharide-eenheid met een bepaalde geactiveerde nucleotidesuiker donor (bijvoorbeeld GDP-fucose) een bepaalde categorie nucleofiele acceptoren (bijvoorbeeld een lipide, polypeptide, nucleïnezuur, of groeien oligosaccharide). Er wordt geschat dat meer dan 50% van de eiwitten (in het bijzonder membraan en secretorische eiwitten) zijn post-translationeel gemodificeerd door glycosylering ³ Rudimentary combinatorische berekeningen geven een waardering voor de grote variabiliteit, veelzijdigheid en specificiteit die aan glycoproteïnen door glycosylering.; bijvoorbeeld als een polypeptide substraat in 10 glycosylatieplaatsen en elke plaats kan een glycosidische binding met 1 van slechts 3 verschillende monosacharide-reducerende uiteinden te vormen, dan het theoretisch uiteindelijke glycoproteïne kan aannemen 3 ¹⁰ = 59.049 verschillende identiteiten. In glycoproteïnen glucosidebindingen algemeen vormen de zijketen stikstof of asparagine residuen in de sequentie Asn-X-Ser / Thr ter verkrijging van N-glycanen ² en zijketen hydroxylgroepen van serine en threonine residuen verkregen O-glycanen ⁴ (X kan elk aminozuur behalve proline is). De samenstelling van glycome een cel (dat wil zeggen, het complement van glycosylering producten) is uniek en beperkt, omdat, op enkele uitzonderingen na, glycosyltransferases vertonen strenge donor, acceptor, en koppeling specificiteit. ⁵ Belangrijke en overvloedige bloed plasma glycoproteïnen lijden afwijkende glycosylering als downstream gevolg glycosyltransferase van abnormale expressie en activiteit als gevolg van vele pathologische aandoeningen, met name kanker en infectieziekten. ^6-24

Voornamelijk als gevolg van epigenetische factoren, de glycome aanzienlijk meer divers, dynamisch en complex dan het proteoom en transcriptoom. ^25,26 Terwijl ongeveer 1% van het zoogdiergenoom codeert de vorming, modificatie enassemblage van glycanen, ²⁷ glycosylering verloopt in een niet-matrijs-gestuurde wijze-een schril contrast met polypeptide en nucleïnezuur biosynthese. De interactie tussen de relatieve hoeveelheid en activiteit van glycosylering enzymen en dergelijke omgevingsfactoren als voedingsstof en voorloper beschikbaarheid bepaalt uiteindelijk de aard, de snelheid en de omvang van glycosylering. ^5,28 embryogenese (bv, vastberadenheid en differentiatie), cellulaire activatie, en progressie door middel van de celcyclus invloed genexpressie (dwz transcriptie en vertaling) en wijzigen van de identiteit en de hoeveelheid beschikbare glycosyltransferases, waarvan de activiteit is de onmiddellijke stroomopwaarts determinant van de cel glycaan-profiel. Omdat (een deel van) de proliferatieve, lijm, en invasieve eigenschappen van kankercellen lijken op die van gewone embryogene cellen, specifieke veranderingen in glycan biosynthetische routes (bijv voorloper accumulatie, gedereguleerde expressie, aberrant modificatie structurele afknotting of nieuwe vorming) dienen als universele kanker biomarkers die verschillende stadia van tumorvorming, progressie, migratie en invasie ²⁹ geven Hoewel glycosylering is zeer complex, blijkbaar op enkele verbeteringen in glycosylering kunnen carcinogenese en metastase mogelijk.; blijkbaar, bepaalde "afwijkende" glycosyleringsproducten inderdaad kankercellen profiteren door hen in staat om het immuunsysteem erkenning ontwijken en overleven de eisen van de migratie in onherbergzame intravasculaire en metastatische omgevingen. ^28,30,31 Niet verrassend, hebben experimenten aangetoond dat de patronen van veranderde verstoren of voorkomen genexpressie en afwijkende glycan vorming kan het ontstaan ​​van tumoren Toch halt toe te roepen. ^29, de afwijkende glycanen gedetecteerd in een Biofluid monster (bijvoorbeeld, urine, speeksel en bloed plasma of serum) misschien niet direct indicatoren van kanker (of een andere ziekte), maar stroomafwaarts uitkomsten van subtiele, maar belangrijkeveranderingen in het immuunsysteem of meetbare vertakkingen van een kwaadaardige aandoening bij een onvoorspelbare orgaan. ³²

Hoewel ze bieden universele informatie over de glycome, vele moleculaire interactie gebaseerde glycomics technieken (bijvoorbeeld lectine / antilichaam-arrays en metabole / covalente etikettering) afhankelijk van de detectie van de hele glycan structuren en geen gedetailleerde structurele informatie over de verschillende glycanen niet te verstrekken. In contrast, kunnen massaspectrometrie (MS) te identificeren en kwantificeren van individuele glycan structuren en dergelijke structurele informatie de bevestigingsplaatsen om kernen polypeptide te onthullen. Gedereguleerde expressie of activiteit van één glycosyltransferase kan een cascade van schadelijke moleculaire gebeurtenissen in meerdere glycosyleringsroutes initiëren. Omdat elke glycosyltransferase kan werken op meer dan één glycoconjugaat substraat en in verschillende groeiende glycan polymeren, gedereguleerde biosynthese cascades opleveren disproportioneel verhoogde hoeveelheden van één glycan product maar verschillende heterogene klassen van afwijkende glycanen in intra- of extracellulaire vloeistoffen. ³³ Dergelijke unieke afwijkende glycanen worden soms onpraktisch als biomarkers voor kanker of andere glycan-affectieve aandoeningen, omdat, vergeleken met de grote pool van goed gereguleerde glycanen, deze afwijkende glycanen slechts een zeer klein deel dat kan vaak niet detecteerbaar blijven zelfs dergelijke zeer gevoelige technieken zoals massaspectrometrie. Bijvoorbeeld in intra- en extracellulaire lichaamsvloeistoffen, het brede eiwitconcentratie spectrum (waarvan acht ordes van grootte overspant) kan detectie van schaarse glycoproteïnen die worden gemaskeerd door de meer voorkomende soort voorkomen. ³² Bovendien bepalen glycosyltransferase activiteit blijft een aanzienlijke praktische en theoretische uitdaging, omdat veel glycosyltransferases afwezig zijn in klinische biovloeistoffen of inactief ex vivo worden. Ondanks de moeilijkheid consistenTLY opsporen en kwantificeren van ultra-kleine hoeveelheden uniek geheel glycanen, hebben beoefenaars van massaspectrometrie enorme vooruitgang geboekt in de richting van het gebruik van intact glycanen klinische markers. Recent hebben wij als aanvulling op de analyse van intacte glycanen dat gebruik GC-MS, vergemakkelijkt de detectie van alle samenstellende branch-point en koppeling-specifieke monosacchariden ( "glycan nodes ') die samen uniciteit verlenen aan elke glycan en in vele gevallen rechtstreeks dienen als moleculaire surrogaten dat de relatieve activiteit van de verwijtbare glycosyltransferase (s) te kwantificeren.

Sinds zijn eerste directe toepassing op glycaan analyse in 1958 gemeld, is gaschromatografie (GC) bewezen een krachtige techniek om per-gemethyleerd mono- en disachariden te analyseren, ³⁴ bepalen hun anomericity en absolute configuratie, en ze te scheiden voor daaropvolgende massaspectrometrische analyse. ³⁵ tussen 1984 en 2007, Ciucanu en collega'singevoerd en geraffineerd een vaste fase glycan permethylation techniek die natriumhydroxide en joodmethaan toegepast, gevolgd door vloeistof / vloeistofextractie of gepermethyleerd glycanen met water en chloroform. ^35,36 Tussen 2005 en 2008, Kang en medewerkers geïntegreerd een tijdbesparende rotatie -column aanpak in de permethylation stap. ^37,38 In 2008, het Goetz onderzoeksgroep bedacht een kwantitatieve vaste fase permethylation glycaan-profilering methode met behulp van matrix-geassisteerde laserdesorptie-ionisatie (MALDI) massaspectrometrie om te vergelijken en mogelijk onderscheid invasieve en niet -invasive borstkankercellen; ³⁹ toen, in 2009, de Goetz team gecombineerde enzymatische en technieken chemische stof in klieven O-glycanen uit intacte glycoproteïnen in een sterk basische vaste fase permethylation regeling ⁴⁰ Hoewel de Goetz procedure vergemakkelijkt gelijktijdige permethylation en chemische release. van O-glycanen, was het alleen van toepassing op pre-geïsoleerde glycoeiwitten. We pasten deze techniek in 2013 en aangepast voor de hele niet-gefractioneerde biovloeistoffen en monsters gehomogeniseerd weefsel door het opnemen van trifluorazijnzuur (TFA) hydrolyse, reductie en acetylering stappen. ³³ Deze extra stappen ook glycanen van glycolipiden en N los gebonden glycanen van glycoproteïnen en om te zetten ze in gedeeltelijk gemethyleerde alditol acetaten (PMAAs, figuur 1), waarvan de karakteristieke methylatie-en-acetylering patronen analyse door GC-MS en uniek vergemakkelijken kenmerken de samenstellende glycan knooppunten in de oorspronkelijke intacte glycan polymeer ⁴¹ (figuur 2). ³³ Uiteindelijk is dit procedure levert een samenstelling portret van de glycanen in een complex Biofluid door directe relatieve kwantificatie van glycan unieke eigenschappen zoals "kern fucosylatie", "6-sialylering", "splitsend GlcNAc" en "beta 1-6 vertakking" - elk afgeleid van een GC-MS chromatographic piek. Dit artikel geeft verdere optimalisatie van het permethylation, acetylering, isolatie, en clean-up fase, samen met verbeteringen in de wijze van relatieve kwantificatie.

Protocol

Let op: Vermijd huid en / of oogcontact met een van de reagentia gebruikt in dit experiment. Bij blootstelling, grondig spoelen het getroffen gebied met water en onmiddellijk een arts raadplegen.

1. Permethylation en Glycan Extraction

1. Column Voorbereiding
   1. Verkrijgen zoveel microfuge spinkolom eenheid waarin het te analyseren monsters. Breek en maak de plastic reservoir buis caps. Plaats een microfuge mini filter in elk reservoir buis. Plaats de gemonteerde microfuge spinkolommen (met de mini filters) in een microfugebuis rek.
   2. Het verkrijgen van een voorraad van natriumhydroxide (NaOH) kralen (20-40 mesh). Transfer sommige NaOH om een ​​kleine wegen boot of, indien de vochtigheid wordt veroorzaakt klonteren, een hot porseleinen mortier als de werkvoorraad van NaOH. Vermijd het gebruik van massa's van NaOH of geplet / poedervorm NaOH kralen.
      Let op: NaOH is een krachtige toxine en corrosieve basis. Spoel de blootgestelde huid / ogen met water gedurende 15 min. ThorougHLY het reinigen van de werkbank na het voltooien van het experiment.
   3. Met behulp van een klein bolletje of een spatel, transfer NaOH kralen uit de werkvoorraad aan de microfuge mini filters met NaOH te vullen tot aan de eerste buitenste afschuining (~ 5 mm onder de rand). Tik op de gevulde microfuge filters op de bank-top in te pakken / condenseren de NaOH kralen.
      Opmerking: In dit experiment, waardoor hinderlijke adsorptie minimaliseren hygroscopische NaOH korrels, het niveau van de toegevoegde vloeistoffen (bijvoorbeeld, acetonitril, dimethylsulfoxide, analytoplossing) boven het oppervlak van de NaOH Celite behouden en direct contact met de lucht te beperken.
   4. Het verkrijgen van een voorraad van acetonitril (ACN). Transfer ~ 350 pi ACN aan elke NaOH-verpakt microfuge mini filter. Houd de NaOH ondergedompeld onder ACN en verwijder grote luchtbellen door roeren met een tip-gekrompen gel-loading pipet tip.
      Let op: Acetonitril is een brandbaar irriterend.
   5. Column Centrifugeren
      1. Schik de microfuge kolommen symmetrisch in een centrifuge; Gebruik een balansbuis indien nodig. Mors geen NaOH korrels in de centrifuge. Sluit het deksel centrifuge.
      2. Centrifugeer de kolommen (dat NaOH en ACN) voor ~ 15 sec bij 2400 x g.
      3. Na voltooiing van het centrifugeren, verwijder microfuge kolommen uit de centrifuge, en gooi de ACN in een gevaarlijk afvalcontainer. Houd de kolom NaOH verpakking intact.
   6. Voeg ~ 350 gl dimethylsulfoxide (DMSO) aan elke NaOH verpakte microcentrifuge mini filter. Houd de NaOH ondergedompeld onder DMSO en verwijder eventuele grote luchtbellen met een pipet tip. Zoals eerder beschreven, centrifuge kolommen voor ~ 15 sec bij 2400 x g en verwijder het DMSO terwijl de NaOH verpakking intact.
      Let op: DMSO is mutageen en irriterende en wordt gemakkelijk geabsorbeerd door de huid.
   7. Sluit alle microfuge mini filters met de stekkers in de spin-filterkit. Transfer ~ 350 ul DMSO aan elk NaOH-verpakt microfuge mini filter en gebruik maken van een 200 ul pipet tip om luchtbellen te verwijderen in de NaOH verpakking, zodat DMSO alle regio's binnen dan NaOH verpakking bereikt. Vermijd breken of overmatig schrapen van de NaOH kralen; NaOH poeder ongewenst. Beëindig deze stap zo snel mogelijk.
2. Voorbereiding van de Plasma Quality Control (QC) Monster (s)
   Let op: Om ervoor te zorgen consistente resultaten over experimentele batches, overwegen gebruik te maken van ten minste één portie van een monster genomen van een grote, homogene massa collectie van het biologisch materiaal van belang te analyseren in elke partij. Als bijvoorbeeld de analyse van bloedplasma, gebruikt monster (s) van een bulkverzameling bloedplasma als QC monster (s) per cyclus. Werkwijze QC monsters op dezelfde wijze als onbekende monsters.
   1. Centrifuge een stock sample van QC plasma voor 4 min bij ~ 10.000 x g. Tijdens het centrifugeren, kunnen sommige high-density neerslag bezinken aan The onderkant en een aantal lage dichtheid neerslag kunnen drijven naar de top van het plasma. Vermijd zowel bij het verwijderen van monster (s) van plasma.
   2. Ga verder met "1.3) Monstervoorbereidingstesten" hieronder. Vervolgens terug naar deze stap na centrifugeren plasma voltooid.
   3. Trekken 9 pl plasma QC gecentrifugeerd en overgebracht naar een geschikt gemerkte 1,5-ml polypropyleen proefbuis met een snap-cap shut (hierna "1,5-ml plastic reageerbuis"). Voeg 1 pl gedeïoniseerd water aan elk monster; desgewenst gebruiken als drager voor interne standaard (s).
   4. Voeg 270 ul DMSO om dit plasma controle. Vortex om volledige oplossing te verzekeren.
3. monstervoorbereiding
   1. Verkrijgen veel 1,5-ml plastic testbuisjes het aantal biologische (analyt) monsters.
   2. Overdracht 9 pi van elke biologische (analyt) monster de bijbehorende 1,5 ml plastic reageerbuis. Breng 1 pl gedeioniseerd water en 270 ul DMSO aan elk monster buis.
   3. Krachtig mengen (bijvoorbeeld vortex en / of herhaaldelijk pipet op en neer) van de monsters naar volledige oplossing te garanderen in DMSO.
      Let op: Voer de volgende stappen in een zuurkast. Gebruikt in de volgende stappen, joodmethaan (CH ₃ I), dichloormethaan (CH _{2Cl 2,} aka methyleenchloride) en chloroform _(CHCl3, trichloormethaan), zijn vluchtige vloeistoffen kan oplossen bepaalde kunststof (bijvoorbeeld nitril) . Zorg ervoor dat u handschoenen bestand tegen oplosmiddelen gebruiken. Vanwege hun lage viscositeit en hoge dampdruk kunnen deze reagentia druppelen van een pipetpunt tijdens overdracht. Minimaliseren reagens verlies en de mogelijke blootstelling door het houden van de voorraad oplossing grenzend aan het ontvangende vaartuig.
   4. Transfer voldoende totale joodmethaan een kleine, schone buis. Elk analyt monster zal 105 pl joodmethaan vereisen. Transfer ~ 500 ul dichloormethaan in another schone buis. Om spuit verstoppingen te voorkomen, spoel de spuit met dichloormethaan onmiddellijk na joodmethaan overdracht.
      Voorzichtig: Joodmethaan fotogevoelig is, vluchtig en potente toxine tasten het centrale zenuwstelsel of het veroorzaken van de dood bij inademing of ingeslikt. Dichloormethaan is een potentieel kankerverwekkend, mutageen voor reproductieve en krachtige irriterende staat beschadiging van verschillende organen of het veroorzaken van de dood.
   5. Gebruik een analytische spuit om 105 pl joodmethaan toe te voegen aan elk te analyseren monster. Cap analyseren buizen onmiddellijk joodmethaan verdamping te minimaliseren. Grondig vortex en eventueel kort centrifuge alle monsters zodat er geen vloeistof in de kap overblijft. Elke kleur veranderen (bijvoorbeeld om bruin, paars of geel) signaleert joodmethaan degradatie, waarin de volgende permethylation reactie kan in gevaar brengen.
   6. Spoel de analytische spuit gebruikt om joodmethaan brengen met dichloormethaan minstens 3 keer. Dit maakt het weer voorkomenm verstopping. Gooi deze spoelen, samen met extra joodmethaan en dichloormethaan in een organisch vat gevaarlijk afval. Plaats gebruikte reageerbuisjes in een gevaarlijk afvalcontainer.
   7. Vraag een nieuwe set van 2 ml plastic reservoir buizen. Verwijder snap-caps indien gewenst.
   8. Koppel de microfuge mini filters. Centrifuge de unplugged kolommen voor 15 sec bij 2400 x g, en dan gooi het reservoir buizen samen met de DMSO effluent.
   9. Re-plug de gecentrifugeerd spin-kolommen, en leg ze in de nieuwe reservoir buizen. Nummer elke spin kolom en de bijbehorende reservoir buis met hetzelfde monster nummer. Zorg ervoor dat het mini filter stekkers zijn strak; mogelijke lekkage kan de volgende stap beïnvloeden. Minimaliseren de tijd tussen het verwijderen van DMSO uit de spinkolommen en overdracht van de analyt monsters op de spin kolommen.
   10. Permethylation
       1. Kwantitatief elke monsteroplossing over aan de overeenkomstige NaOH-bead-gevulde microfuge rotatie column. Gebruik een 1000-ul pipet tip voor deze stap. Na overdracht golfplaat ~ 2 mm van het uiteinde van een 200 ul tip en laat de inhoud kolom te gebruiken als een roerder. Herhaal dit voor alle monsters.
          Opmerking: De lage viscositeit van joodmethaan kunnen sample veroorzaken omdat de analyt oplossing kan druppelen van de pipetpunt tijdens de overdracht. Houd de monsterbuis en de spin kolom naast elkaar met één hand en de monsteroplossing met de andere hand snel overdragen.
       2. Laat de permethylation reactie verlopen gedurende 11 min. Roer elk monster ten minste 4-5 keer tijdens deze periode. Efficiënte permethylation, die optreedt aan het oppervlak van NaOH korrels vergemakkelijken, gebruik tip gekrompen gel-loading pipetpunten als roerwerken meng de inhoud kolom mengen. Agressieve mengen kan het rotatiefilter doorboren, verpulveren en schorten NaOH korrels (die de effectiviteit van verdere vloeistof / vloeistofextractie kan verminderen), en / of laat verlies van monster (de sample doordrenkte NaOH korrels kunnen overstromen van de kolom).
       3. Ter voorbereiding van de volgende vloeistof / vloeistof extractiestap, stelt een voldoende hoeveelheid 0,5 M natriumchloride (NaCl) oplossing in een 0,2 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,0), bij kamertemperatuur worden opgeslagen. Elk monster wordt in totaal ~ 12 ml NaCl-oplossing voor alle drie cycli van vloeistof / vloeistofextractie nodig.
       4. Na voltooiing van de 11-min permethylation periode onmiddellijk maar voorzichtig de stekker uit de kolommen en centrifugeren ze gedurende 15 sec bij 2400 x g. Gooi de pluggen.
   11. Verwijder onmiddellijk spin-kolommen uit de centrifuge en leg ze in een nieuwe reeks van lege spin-reservoir buizen, waardoor de flow-through-oplossing voorzien van vers gepermethyleerd glycanen achter. Doe niets weggooien.
   12. Zo snel mogelijk, voeg 300 ul acetonitril (ACN) voor de droge, NaOH gevulde rotatie filters. Centrifugeer de rotatie filters gedurende 30 seconden bij 9600 x g.
   13. immediately daarna breng de belangrijkste permethylation oplossing (dat wil zeggen, de oplossing werd geïncubeerd met NaOH kralen voor 11 min versponnen gecentrifugeerd filter in een centrifugebuis voor de toevoeging van 300 ul van ACN in de vorige stap) tot 13 ​​x gesilaniseerd 100 mm reageerbuizen ⁴² met 3,5 ml van 0,2 M natriumfosfaat buffer die 0,5 M NaCl, pH 7,0 en mengen (vortex) onmiddellijk. Vermijd de overdracht van eventuele stevige witte residu tijdens deze stap. Doe dit voor elk monster voordat u verder gaat met de volgende stap.
   14. Onverwijld overdracht (combineer) de ACN spin-door middel van in elk reservoir buis (met) de rest van het vloeibare monster in hun respectievelijke gesilaniseerde glazen buis en meng (vortex) onmiddellijk. Nogmaals, vermijd de overdracht van eventuele stevige witte residu tijdens deze stap. Cap, schudden, en vortex de glazen buis. Herhaal dit voor elk monster. Gooi de NaOH kolommen en Pasteurpipetten in geschikte afvalcontainers.
4. Vloeistof / vloeistof Extractie en Glycan Purification
   1. Binnen in de zuurkast, voeg 1,2 ml chloroform aan elk monster. Onmiddellijk daarna, cap de gesilaniseerde glazen buizen en krachtig de inhoud te mengen.
   2. Voorverwarmen metaalblokken tot ongeveer 75 ° C per verdamping verdeelstuk. Gebruik verwarming blokken met putten die is geschikt voor de 13 mm x 100 mm glazen buizen.
   3. Zorg voor een nieuwe reeks van gesilaniseerde Pasteurpipetten, non-gesilaniseerd Pasteur pipetten en gesilaniseerd reageerbuizen met kappen.
      Voorzichtig: Chloroform _(CHCI3) een irriterend, mutageen en potentieel carcinogeen kunnen permeëren door sommige soorten handschoenen.
   4. Kort centrifuge (~ 3000 xg)-monster bevattende glazen buisjes aan de waterige en organische lagen scheiden.
   5. Gebruik een niet-gesilaniseerd Pasteur pipet genoeg van de bovenste waterlaag zodanig dat extraheren ~ 3 mm van de waterlaag boven de onderste organische laag blijft.
   6. Voeg 3,5 ml van de 0,5 M NaCl oplossing in een 0,2 M natriumfosfaatbuffer (pH 7) aan elk glazen buis krachtig mengen en kort centrifugeren (~ 3000 xg). Zoals in de vorige stap (1.4.3), gebruikt een niet-gesilaniseerd Pasteur pipet om de waterige laag te extraheren.
   7. Herhaal de vorige stap (1.4.4), maar laat ~ 1 ml van de waterige laag.
   8. Gebruik een schone gesilaniseerd Pasteur pipet om de organische laag te dragen aan een schone en gemerkte gesilaniseerd 13 x 100 mm glazen testbuis. Vermijd waterverontreiniging door extractie op de volgende wijze:
      1. Houd de huidige en nieuwe gesilaniseerd reageerbuizen naast elkaar in één hand. Met de andere hand, druk op de pipet bol om bellen te maken, terwijl het plaatsen van de pipet naar beneden door de waterlaag.
      2. Eenmaal in de organische laag, stoppen met het maken bellen, houdt u de pipet bol gestage om de organische en waterige lagen te stabiliseren en weer scheiden. Vervolgens langzaam de lamp vrij om zoveel mogelijk van de organi trekkenc layer mogelijk zonder waterverontreiniging.
      3. Snel verhogen de pipetpunt door de waterlaag en weerstaan ​​de natuurlijke reflex van de lamp (waardoor intrekking sommige waterverontreiniging) enigszins los, terwijl tegelijkertijd de pipet uit de buis.
      4. Een snelle overdracht van de lage viscositeit organische laag aan de aangrenzende nieuwe buis. Eventuele waterverontreiniging wordt getoond als kleine druppeltjes vloeistof bovenop de geëxtraheerde organische laag in de nieuwe glazen buisjes. Als waterig / NaCl besmetting zichtbaar is, verwijder deze dan met een pipet; centrifugeren indien nodig waterige druppeltjes bundelen tot een enkele druppel.
   9. Gooi oude glazen buizen, pipetten, en waterig en organisch afval oplossingen. Was en recyclen glazen buis caps.
   10. Droog alle monsters in een lichte en constante stroom van stikstof in een voorverwarmde verdamping verdeelstuk bij 75 ° C gedurende ~ 5 minuten in een zuurkast. Om verdampingskoeling te garanderen tijdens alle droge-down steps, moet een zachte en constante stroom van stikstof de vloeistof oppervlak verstoren zonder spatten of spatten van de vloeistof. Verwijder monsters uit de verdamping spruitstuk na volledige droging van de uiteindelijke steekproef. Witte vlekken op de bodem van een gedroogde glazen buizen geven buffer / NaCl besmetting.
   11. Pauzeren procedure hier als er onvoldoende resterende tijd op de dag om de TFA hydrolysestap voltooien. Tijdelijk (dat wil zeggen, 's nachts) op te slaan droog monsters bij -20 ° C. Om de procedure voort te zetten na de opslag, de monsters uit de -20 ° C vriezer en laat ze volledig warmen voor uncapping.
   12. Terwijl monsters warm, ter voorbereiding van trifluorazijnzuur (TFA) hydrolyse (volgende stap), de verwarmingsmantel zodanig dat de temperatuur van de vloeibare inhoud reageerbuis zal 121 ° C bereikt. Bereid de TFA-oplossing van TFA voorraad (zie stap 2.1 hieronder).

2. trifluorazijnzuur (TFA) Hydrolyse

Let op: Trifluorazijnzuur (TFA) is een bijtend organisch zuur en giftige irriterende.

1. Bereid een voldoende hoeveelheid van een 2,0 M oplossing in TFA in gedeïoniseerd water. Elk analysemonster wordt 325 pl 2,0 M oplossing in TFA vereisen. Geconcentreerde TFA is 13,0 M.
2. Voeg 325 ul van 2,0 M TFA elke analyt monster. Om TFA verdamping en het monster te voorkomen tijdens de daaropvolgende droogstap (2.3), strak cap elk monster buis onmiddellijk na het toevoegen van TFA. Markeer de oplossing in alle glazen buizen. Vortex elk monster grondig voor de volgende stap.
3. Incubeer de goed afgesloten monsterbuizen gedurende 2 uur in een geschikt voorverwarmde verwarmingsblok of oven zodat de inhoud bereikt een temperatuur van 121 ° C. Bij gebruik van een verwarmingsblok plaats van een oven, cover monsterbuizen met aluminiumfolie om condensatie van TFA aan de bovenkant van de buis en gedeeltelijk drogen van het monster residu op de bodem van de buis te voorkomen. Controleer het monster oplossing niveaus na 20-30 min.minimale TFA verdamping verzekeren. Indien nodig, draai de doppen verdere of doppen te vervangen voor een strakkere pasvorm.
4. Gedurende de 2-uur laten wachten, stelt een verdamping spruitstuk 75 ° C voor de volgende stap (zie 2.4).
5. Wanneer de 2-uur verwarmingsperiode volledig droge monsters bij 75 ° C onder een voorzichtige stroom stikstofgas gedurende ~ 15 minuten. Niet monsters onbeheerd voor meer dan 15 minuten vertrekken. Controleer regelmatig monsters, en stoppen met verwarmen en drogen zodra alle monsters droog zijn.
6. Pauzeren procedure hier als er onvoldoende resterende tijd op de dag om de reductiestap voltooien. Tijdelijk (dat wil zeggen, 's nachts) op te slaan monsters bij -80 ° C. Om de procedure voort te zetten na de opslag, de monsters uit de -80 ° C vriezer, en hen in staat stellen om volledig te warmen voor uncapping.

3. Vermindering

1. In een zuurkast, stelt een voldoende hoeveelheid van een 10 g / l natriumboorhydride _(NaBH4) oplossing in 1 M ammonium hydroxide _(NH4OH). Elk monster wordt 475 ul van deze oplossing vereist. Maak een nieuwe oplossing voor elke partij van de monsters. Geconcentreerd ammoniumhydroxide (27-30% w / w NH ₃₎ ongeveer 14,5 M.
   Let op: Natriumboorhydride _(NaBH4) is een hygroscopisch, reactief met water toxine en krachtige irriterende dat releases-upon contact met water licht ontvlambare dampen die ernstige brandwonden bij contact inademing, inslikken of oog- / huidirritatie veroorzaken.
   Let op: ammoniumhydroxide (NH ₄ OH) is een bijtend irriterend en toxine kunnen veroorzaken ernstige brandwonden en onomkeerbare orgaanschade bij contact inademing, inslikken, of de ogen / huid. Spoel de getroffen gebieden met water gedurende 30 minuten, en te voorkomen dat het slachtoffer van wrijven of krassen op de getroffen gebieden.
2. Aan elk monster, voeg 475 ul van de 10 g / l _NaBH4 in 1 M _NH4OH. Mix monsters grondig om eventuele resten te ontbinden. Cap reageerbuizen enkan de reductiereactie nog voor 1 uur.
3. Gedurende de 1-uur wachten, stelt het verwarmde verdampingsoppervlak verdeelstuk 75 ° C. Gebruik een verwarmings-blok met geschikte putjes voor de glazen buizen (zie 3.4 hieronder).
4. Als de 1-uur reactieperiode is voltooid, voeg 63 ul methanol (MeOH) aan elk monster. Deze stap en de volgende stap Resten boor of trimethylboraat - een relatief vluchtige vloeistof die kookt bij 68 ° C.
5. Droge monsters (in de voorverwarmde verdeelstuk) bij 75 ° C onder een voorzichtige stroom stikstofgas gedurende ~ 15 minuten. Controleer regelmatig monsters en ze niet onbeheerd achter. Kleine vloeistofdruppels op de bodem van de glazen buizen is het monster nog niet droog.
   Opmerking: Om luchtbellen te onderscheiden van vloeibare druppeltjes, kantelt de reageerbuis. Alleen vloeibare druppels zal bewegen na het kantelen, maar het omgekeerde is niet altijd waar: als een luchtbel niet beweegt, kan het nog steeds een (heel klein) vloeistofdruppel zijn.
6. Zodra samples helemaal droog zijn, voor te bereiden een 9: 1 (v / v) oplossing van methanol (MeOH) en azijnzuur (AcOH). Voeg 125 ul van deze MeOH: AcOH oplossing aan elk monster.
7. Droge monsters (in een voorverwarmde verdeelstuk) bij 75 ° C onder een voorzichtige stroom stikstofgas.
8. Wanneer monsters helemaal droog zijn, vacuüm-drogen van de monsters gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur: Leg monsters in een plastic vacuum bad (zoals die verkocht door FoodSaver), sluit het vacuüm deksel, zet het vacuüm draaiknop om "vacuüm", sluit de zuigslang, en zet het vacuüm. Om het vacuüm te demonteren in omgekeerde volgorde te werk gaan. Wacht totdat het systeem volledig decomprimeren alvorens het vacuüm deksel te openen.
9. Pauzeren procedure hier als er onvoldoende resterende tijd op de dag om de reductiestap voltooien. Tijdelijk (dat wil zeggen, 's nachts) op te slaan monsters bij -80 ° C. Om de procedure voort te zetten na opslag, verwijder de monsters uit de -80 ° C vriezer, en laat ze volledig opwarmen voordat uncapping.
10. In afwachting van monsters aan vacuüm drogen (of warm, na opslag), bereid de reagentia voor de volgende stap. Het verkrijgen en het nummer van een gesilaniseerd conische bodem autosampler (AS) flacon (met dop) voor elk monster. Bovendien voorverwarmen zowel ondiepe putjes AS-flacon verwarmingsblok en een diepe putjes glazen buis blokkeren zodat de inhoud glasbuis een temperatuur van 50 ° C bereikt.

4. Acetylation (Uitgevoerd in een zuurkast)

1. Voeg 18 ul gedemineraliseerd water aan elk monster. Cap en grondig vortex alle buizen om eventuele neerslag volledig op te lossen.
2. Voeg 250 ul azijnzuuranhydride aan elk glazen buis. Cap grondig vortex en ultrasone trillingen in een waterbad gedurende 2 min tot volledige oplossing van residuen en precipitaten te waarborgen.
3. Dekglas buizen met aluminiumfolie en incubeer bij een inwendige temperatuur van 50 ° C gedurende 10 minuten.
4. Voeg 230 ul geconcentreerd trifluorazijnzuur (TFA) aan elk monster. Onmiddellijk cap eend meng de monsters. Dan, incubeer de monsters bedekt met aluminiumfolie gedurende 10 min bij een inwendige temperatuur van 50 ° C.
5. Na incubatie, voeg 1,8 ml dichloormethaan (CH _{2Cl 2)} aan elk monster. Cap en meng goed.
6. Voeg 2,0 ml gedemineraliseerd water aan elk monster. Cap en mix monsters ook. Centrifuge van 0 tot 3000 xg om de lagen te scheiden. Gebruik een niet-gesilaniseerd Pasteur pipet vloeistof / vloeistof extractie uit te voeren zoals beschreven in stap 1.4.6, het vermijden van waterverontreiniging.
7. Herhaal de extractie nog een keer, voor een totaal van twee extracties. Gebruik gesilaniseerd Pasteur pipetten om de organische laag in gelabelde gesilaniseerd AS flesjes (stevig vastgehouden in een AS rack) over te dragen. Vul het AS flesjes tot net onder de rand.
8. Gebruik een voorverwarmde, ondiepe putjes verwarmingsblok op droge monsters (in AS flesjes) gedurende 15 minuten bij 40 ° C onder stikstofgas. Niet te drogen. Final producten staan ​​bekend als gedeeltelijk gemethyleerd alditol acetaten (PMAAs).

5. gaschromatografie - massaspectrometrie (GC-MS)

1. Reconstitueer elk monster in 100 ul van aceton en meng goed. Gebruik een autosampler tot 1 pl van elk monster in split-modus te injecteren in de GC split-modus liner (gehandhaafd op 280 ° C en met een kleine prop gesilaniseerde glaswol). Gebruik een splitsingsverhouding van 40. Gebruik helium als draaggas bij constante stroom modus bij 0,8 ml / min door een 30-m DB-5ms GC kolom met een 0,25 mm ID en 0,25 micron filmdikte.
2. Houd de aanvangstemperatuur GC oven bij 165 ° C gedurende 0,5 min. Na de eerste wachttijd, het programma van de oven om de temperatuur oprit, voor elke run, van 165 ° C tot 265 ° C met een snelheid van 10 ° C / min (waarvan 10 minuten duurt) en vervolgens onmiddellijk opvoeren van de temperatuur 265 ° C tot 325 ° C met een snelheid van 30 ° C / min (waarvan 2 min draait) en de temperatuur op 325 ° C gedurende 3 minuten handhaven. De totale looptijd per monster is 15,5 min.
3. Gebruik een proPerly afgestemd en gekalibreerd massaspectrometer de monstercomponenten elueren van de GC-kolom onderwerpen aan elektronen ionisatie (EI, 70 eV bij 250 ° C). Voor een TOF massa-analysator, analyseren fragmenten van m / z 40 m / z 800 met een 0,1-sec puls sommatie tarief. Stel een EI-filament oplosmiddel vertragingstijd van 2,5 min.

6. Data Analysis

1. Bij gebruik van een TOF massa-analysator, tel de meest voorkomende en / of diagnostisch fragment ionen per PMAA door een massa raam van 0,15 Da een geëxtraheerde ionenchromatogram verkrijgen. Target-ionen voor elke PMAA zijn elders gepubliceerd, ³³ maar de volgende wijzigingen aangebracht: t-Glc ionen zijn nu 145,1 + 205,1; 2-Man ionen 161,1 + 189,1; 3-Gal ionen 161,1 + 233,1, 6-Gal ionen 161,1 + 189,1 + 233,1; 2,6-Man ion 189,1; 3,6-Man ionen 189,1 + 233,1.
2. Gebruik QuanLynx of andere software om automatisch te integreren piekoppervlakken voor elk opgeteld gewonnen ion chromatogram.
3. Handmatig controleren of de integratie van resultaten door het bekijken van elk geïntegreerd gewonnen ion chromatogram. Vervolgens voeren de piekintegratie data naar een spreadsheet voor verdere analyse en gegevensnormalisatie, waaraan bij de oppervlakte van elke individuele hexose XIC door de som van hexose XIC gebieden verdelen; evenzo is het oppervlak van elke individuele HexNAc XIC gedeeld door de som van alle HexNAc XIC gebieden. Deze procedure produceert genormaliseerd abundances voor elk hexose en HexNAc.

Resultaten

Een totale ionenstroom chromatogram (TIC) weergegeven succesvol permethylation, hydrolyse, reductie en acetylering van humaan bloedplasma monsters ten opzichte van gevallen waarin twee belangrijke stappen permethylation correct zijn uitgevoerd zijn getoond in figuur 3.

Absolute Opbrengst van HexNAcs Ten opzichte van hexosen:

N -ace...

Discussie

In het algemeen is de succesvolle productie van partieel gemethyleerde alditol acetaten (PMAAs) vanaf hexosen is beladen met minder problemen en is robuuster dan de succesvolle productie van N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. Het exacte mechanisme achter dit fenomeen speelt in elke stap van deze procedure is niet bekend, maar moet betrekking hebben op de unieke chemie van de N-acetyl groep (in plaats hydroxylgroep) die uniek is HexNAcs opzichte van hexosen. Het mechanisme achter dit verschijnsel betre...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Sodium hydroxide beads	367176	Sigma-Aldrich	20-40 mesh, reagent grade 97%
0.9 ml Spin column	69705	Pierce division of ThermoFisher Scientific	Inclusief  pluggen en polyethyleen frits
GC-MS autosampler vial (silanized)*	C4000-9	ThermoFisher Scientific	Target DP High Recovery Vial, 1.5 ml, 12 mm x 32 mm, inclusief Teflon-gecoate prikdoppen
1.5 ml polypropyleen testbuisjes	05-402-25	ThermoFisher Scientific	Snap-cap deksel
2 ml polypropyleen testbuisjes	05-408-138	ThermoFisher Scientific	Snap-cap deksel
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	D8418	Sigma-Aldrich	BioReagent voor moleculaire biologie, reagent grade >99.0%
Iodomethane	I8507	Sigma-Aldrich	Bevat koper als stabilisator, ReagentPlus 99%
Acetonitrile	A955-4	ThermoFisher Scientific	Optima LC/MS
Microcentrifuge	75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge	ThermoFisher Scientific	24 x 1.5/2.0 rotor met ClickSeal biocontainment deksel. Rotor catalogusnummer: 75003424
13 x 100 glazen testbuis (silanized)*	53283-800	VWR	13 mm x 100 mm borosilicaat glazen testbuisjes met schroefdop
Doppen voor glazen testbuisjes	14-930-15D	ThermoFisher Scientific	Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13 mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner.
Natriumchloride	S7653	Sigma-Aldrich	>99.5% zuiver
Chloroform	4440-08	Macron Fine Chemicals
Trifluorazijnzuur	299537	Sigma-Aldrich	99% gezuiverd door herdistillatie voor eiwitsequentiebepaling
Natriumborohydride	71321	Fluka Analytical	99%
Ammoniumhydroxide oplossing	320145	Sigma-Aldrich	NH3 inhoud: 28.0-30.0%
Methanol	AH230-4	Honeywell Burdick & Jackson	HPLC-kwaliteit
Azijnzuur	320099	Sigma-Aldrich	99.70%
Kunststof vacuüm exsiccator	Een model van voldoende grootte	FoodSaver
Azijnzuuranhydride	539996	Sigma-Aldrich	99.50%
Dichloormethaan	D143SK-4	ThermoFisher Scientific	Gestabiliseerde HPLC-kwaliteit
Aceton	9006-03	J.T.Baker	Baker Analyzed
Verwarmde verdampingsverdeler (hoofdunit)	pi18823	ThermoFisher Scientific	Thermo Scientific* Reacti-Therm* Verwarmings- en roermodule; Drievoudig blokmodel met verwarmings- en roerfunctie
Verwarmde verdampingsverdeler (bovenste verdamper)	pi18826	ThermoFisher Scientific	ThermoScientific* Reacti-Vap Verdamper, 27-poort; Voor gebruik met drievoudig blok Reacti-Therm verwarmingsmodule
Aluminium monsterhouderblokken voor verdampingsverdeler	pi18816	ThermoFisher Scientific	Blok, aluminium, Reacti-Block S-1, houdt 13 mm dia testbuisjes, 13 gaten (14 mm dia. x 45 mm diep)
Gaschromatograaf	Model A7890	Agilent	Uitgerust met CTC PAL autosampler
Massaspectrometer	GCT Premier (Time-of-Flight)	Waters
Split-mode liner (gedeactiveerd / silanized)	5183-4647	Agilent	Bevat een kleine plug van silanized glaswol
DB-5ms GC-kolom	122-5532	Agilent	30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron filmdikte
Chloortrimethylsilaan	95541	Sigma-Aldrich
Glazen vacuüm exsiccator (voor silanisering van glaswerk)	EW-06536-30	Cole-Parmer	12" breed; 230 mm plaatmaat
*Silanisering van glaswerk wordt in huis uitgevoerd, overnacht met chlorotrimethylsilaan damp in een grote glazen vacuüm exsiccator.