Methodenartikel

Onderzoek naar de functie van Coronin A in de vroege honger Reactie Dictyosteliumcellen discoideum Door Aggregation Assays

DOI:

10.3791/53972

⸱

18 juni 2016

 ,  ,  , 
1Biozentrum, University of Basel

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De sociale amoebe Dictyostelium discoideum ondergaat een ontwikkelingsovergang naar een meercellig organisme wanneer het verhongert. Het evolutionair geconserveerde eiwit coronine A speelt een cruciale rol bij het initiëren van de ontwikkeling. Met behulp van aggregatie-assays als onze belangrijkste methode, streven we ernaar de rol van coronine A in de vroege ontwikkeling te verduidelijken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dictyostelium discoideum amoebe zijn te vinden in de bodem en voeden zich met bacteriën. Toen voedselbronnen schaars geworden, ze scheiden factoren een meercellige ontwikkelingsprogramma, waarin enkele cellen chemotax richting aggregatie centra 1-4 te starten. Dit proces is afhankelijk van de afgifte van cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP) 5. cAMP wordt in golven door de gecoördineerde werking van adenylaatcyclase en fosfodiësterasen en bindt aan G-eiwit gekoppelde receptoren cAMP 6,7. Een veel gebruikte bepaling voor de bij de ontwikkelingscyclus van de lagere eukaryote Dictyostelium discoideum mechanismen is gebaseerd op de waarneming van celaggregatie in ondergedompelde omstandigheden 8,9 analyseren. Dit protocol beschrijft de analyse van de rol van coronin A in de ontwikkelingscyclus door verhongering in weefselkweek platen ondergedompeld in gebalanceerde zoutoplossing (BSS) 10. Coronin A is een lid van de zeer geconserveerde protein familie van coronins die zijn betrokken bij een breed scala aan activiteiten 11,12. Dictyostelium cellen die coronin A zijn niet multicellulaire aggregaten, en dit gebrek kan worden gered door pulsen toevoeren van cAMP, wat suggereert dat coronin Een handelingen stroomopwaarts van de cAMP cascade 10. De in deze studies beschreven technieken krachtige hulpmiddelen om de functies van eiwitten te onderzoeken in de beginfase van de ontwikkelingscyclus van Dictyostelium discoideum stroomopwaarts van de cAMP cascade. Daarom is het gebruik van deze samenvoeging test kan de verdere studie van coronin Een functie mogelijk te maken en ons begrip van coronin biologie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De coronin familie van eiwitten is sterk geconserveerd hele eukaryoten. Deze eiwitten worden gekenmerkt door de aanwezigheid van een amino-eindstandige tryptofaan-aspartaat (WD) herhaling-bevattend gebied, gevolgd door een unieke regio verbonden met een carboxy-eindstandig coiled-coil domein 13,14 (Figuur 1). Coronins zijn betrokken bij diverse celfuncties, waaronder cytoskelet regulatie en signaaltransductie 12. In zoogdieren, tot zes korte coronin moleculen (coronin 1-6) en een "tandem" coronin 7, samen worden uitgedrukt 12,15. Coronin 1 is de meest uitgebreid onderzochte familielid, en bleek betrokken te zijn bij de vernietiging pathogene T celoverleving en neuronale signalering. Hoe precies, coronin 1 voert deze werkzaamheden blijft onduidelijk. Terwijl coronin 1 werd aangetoond dat Ca2 + en cAMP-afhankelijke signalering en F-actine cytoskelet modulatie 16-18, de eventuele co reguleren-expressie tot 7 familieleden in zoogdieren heeft het een uitdaging om de moleculaire functie van coronins bestuderen deze systemen, vanwege mogelijke ontslagen. In tegenstelling tot zoogdieren organismen, hoe lager eukaryoot Dictyosteliumcellen discoideum uitdrukt slechts twee coronin familieleden (coronin A, de ortholoog van zoogdier coronin 1 en coronin B, de ortholoog van zoogdier coronin 7) met schijnbaar niet-redundante functies 15,19,20. Dit feit maakt Dictyostelium discoideum een krachtig model om de functie van coronins bestuderen.

Om de rol van coronin A in Dictyostelium discoideum bestuderen, geïnduceerd we de ontwikkelingscyclus door verhongering in weefselkweek platen met gebalanceerde zoutoplossing (BSS) buffer met behulp van wildtype cellen of cellen zonder coronin A 10. We vonden dat cellen zonder coronin A waren niet in staat om meercellige aggregaten op hongerdood te vormen. Voor een nauwkeurige kwantitatieve beoordeling van dit fenotype hetgeautomatiseerde live cell imaging beschreven in dit protocol is een essentieel instrument. Het defect in de inleiding van het begin van de hongerdood reactie in cellen zonder coronin A kan worden gered door het leveren van pulsen van cAMP, wat suggereert dat coronin Een handelingen stroomopwaarts van de cAMP cascade. De exogene toepassing van cAMP pulsen op de inleiding van de ontwikkeling van de simulatie is gebruikt door verschillende laboratoria in het verleden 8,9. Maar deze procedure ook bekend sterk afhankelijk celdichtheden en timing zijn. Daarom is het protocol hier beschreven beoogd deze variabiliteit om een ​​hoge mate van reproduceerbaarheid te garanderen verminderen. Samengevat, de technieken toegepast in deze studies krachtige hulpmiddelen om de functies van eiwitten onderzocht tijdens de vroege stadia van de ontwikkelingscyclus van Dictyostelium discoideum en hebben het potentieel om up- identificeren en effectoren van coronin Een functie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Let op de vroege hongerdood reactie van Dictyostelium discoideum door time-lapse microscopie.
    1. Groeien DH1.10 cellen of corA deficiënte cellen in een conische kolf die HL-5 medium (voor 1 L: 5 g proteosepepton, 5 g thiotone E pepton, 10 g glucose, 5 g gistextract, 0,35 g Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, 0,35 g KH 2PO 4, 0,05 g dihydrostreptomycine sulfaat, pH 6,6) bij 22 ° C in een schudincubator met een rotatie van 160 opm. Houd cellen met een dichtheid tussen 0,01 x 10 6 cellen / ml en 2 x 10 6 cellen / ml.
    2. Onderzoek cel aggregatie, door het oogsten log-fase groeiende DH1.10 cellen 21 of corA deficiënte cellen 10 gegenereerd in de DH1.10 achtergrond, geteeld in schudden cultuur met HL-5 medium bij 22 ° C. Hiervoor passende hoeveelheid cellen (meestal tussen 10 en 50 ml), centrifugeer gedurende 3 min bij 400 xg en was de cellen tweemaal BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, pH 6,5).
    3. Aantal cellen met een hemocytometer. Vervolgens plaat cellen bij een dichtheid van (5, 10, 20 of 40) x 10 4 cellen / cm2 in een 24-wells plaat. Laat ze hechten gedurende 1 uur bij 22 ° C in BSS.
    4. Visualiseer aggregatie door time-lapse microscopie, zoals beschreven voor 10, het nemen van beelden elke 135 sec. met een live cell imaging opgezet met 5x objectief en een elektronen vermenigvuldigen ladingsgekoppelde inrichting camera automatisch de juiste software (zie Materialen tabel).
  2. cAMP pulserende van Dictyostelium discoideum cellen tijdens de hongerdood.
    1. Onderzoekt het effect van extern aangelegde cAMP pulsen op de ontwikkeling van DH1.10 cellen 21 of DH1.10 corA deficiënte cellen 10, door het oogsten van cellen. Hiervoor passende hoeveelheid cellen (meestal tussen 10 en 50 ml), centrifugeer gedurende 3 min bij 400 x g en tweemaal wassen BSS.
    2. Count cellen met een hemocytometer en resuspendeer de cellen tot een dichtheid van 1 x 10 7 cellen / ml in BSS. Schud de cultures (160 rpm) bij 22 ° C gedurende 2 uur voordat pulsen. Voeg cAMP pulsen met behulp van een timer gestuurde peristaltische pomp. Programmeer de pomp op een 5 sec puls te leveren elke 6,5 min van 15 ul van 50 nM cAMP (uiteindelijke concentratie) over een periode van 5 uur.
    3. Aantal cellen met een hemocytometer. Vervolgens plaat de cellen bij een dichtheid van (5, 10, 20 of 40) x 10 4 cellen / cm2 in een 24-wells plaat. Laat zich te houden gedurende 1 uur in BSS.
    4. Visualiseren aggregatie na 16 uur bij 22 ° C met helderveld microscopie met een 5X doel.
  3. Inductie van Dictyostelium discoideum ontwikkeling door middel van blootstelling aan geconditioneerd medium.
    1. Bereid verse geconditioneerd medium zoals beschreven 22. Verzamel log-fase DH1.10 cellen 21 of DH1.10 corA deficiënte cellen 10, van het schudden cultgelen met HL-5 medium bij 22 ° C met een pipet, centrifugeer gedurende 3 min bij 400 xg en wassen cellen drie keer in PBM (0,02 M kaliumfosfaat, 10 pM CaCl2 en 1 mM MgCl2, pH 6,1).
    2. Aantal cellen met een hemocytometer, resuspendeer in deze PBM bij een dichtheid van 1 x 10 7 cellen / ml en schud gedurende 20 uur bij 110 rpm / 22 ° C.
    3. Verzamelen geconditioneerd medium na centrifugatie bij 400 xg gedurende 3 min en verhelderen door centrifugeren bij 8000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
    4. Filter geconditioneerd medium door een 0,45 pm filter (zie Materialen Table) en verdun drievoudige in PBM.
    5. Aantal cellen met een hemocytometer en plaat bij een dichtheid van (5, 10, 20 of 40) x 10 4 cellen / cm2 in een 24-wells plaat. Laat ze hechten gedurende 1 uur bij 22 ° C.
    6. Uitwisseling supernatant van de cellen met de eerder bereide geconditioneerde medium.
    7. Visualiseer een aggregatieN a 16 uur door heldere-microscopie met behulp van een 5X doelstelling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellen deficiënt coronin A tonen een defect in de vroege ontwikkeling (figuur 2). Aangezien coronin A cellen niet in staat om multicellulaire aggregaten, die de eerste stap in de ontwikkelingscyclus van Dictyostelium discoideum vormen. Daarom coronin A lijkt een rol te spelen tijdens de vroege respons hongerdood en / of cAMP-signalering. Inderdaad is het ontbreken van meercellige aggregaatvorming in afwezigheid van coronin A gepaard met verlaagde cAMP signalerin...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De coronin eiwitten worden gevonden in de meeste taxa van de eukaryote clade. Dictyostelium discoideum coronin A, het homoloog van zoogdier coronin 1, is betrokken bij de vroege hongerdood reactie, aangezien coronin A-deficiënte cellen zijn niet in staat om aggregatie maken samen tijdens de vroege ontwikkeling cyclus 10. In staat zijn om de vertraging in ontwikkeling tussen de stammen kwantitatief en nauwkeurig te beoordelen, een microscoop live cell imaging set-up met de geautomatiseerde podium cont...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten zijn verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken het Dictyostelium Stock Center voor stammen en reagentia. Dit onderzoek werd gefinancierd door subsidies van de Swiss National Science Foundation en het kanton Bazel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
HL-5 media (voor 1 L: 5 g proteose pepton, 5 g thiotone E pepton, 10 g glucose, 5 g gistextract, 0,35 g Na2HPO4*2H2O, 0,35 g KH2PO4, 0,05 g dihydrostreptomycin-sulfaat, pH 6,6)
Proteose peptonBD Bioscience211693
Thiotone E peptonBD Bioscience211684
GistextractBD Bioscience212750
GlucoseAppliChemA3666
Na2HPO4*2H2OFluka71643
KH2PO4AppliChemA1043
dihydrostreptomycin-sulfaatSigma-AldrichD1954000
PBM (0,02 M kaliumfosfaat, 10 μM CaCl2 en 1 mM MgCl2, pH 6,1)zelf gemaakt
BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, pH 6,5)zelf gemaakt
0,45-μm Filtropure S-filterSarstedt83.1826
Falcon 24-wells weefselkweekplaatFisher Scientific08-772-1H
Cellobserver microscoopZeissop maat gemaakt
AxioVision softwareZeiss
IPC Microprocessor–gestuurde doseerpompISMATECISM 931
Axiovert 135M microscoopZeiss491237-0001-000
IncubatieschuddelInforst HT Minitron

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weijer, C. J. Morphogenetic cell movement in Dictyostelium. Semin Cell Dev Biol. 10, 609-619 (1999).
  2. Devreotes, P. Dictyostelium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development. Science. 245, 1054-1058 (1989).
  3. Kimmel, A. R., Firtel, R. A. cAMP signal transduction pathways regulating development of Dictyostelium discoideum. Curr Opin Genet Dev. 1, 383-390 (1991).
  4. Clarke, M., Gomer, R. H. PSF and CMF, autocrine factors that regulate gene expression during growth and early development of Dictyostelium. Experientia. 51, 1124-1134 (1995).
  5. Robertson, A., Drage, D. J., Cohen, M. H. Control of Aggregation in Dictyostelium discoideum by an External Periodic Pulse of Cyclic Adenosine Monophosphate. Science. 175, 333-335 (1972).
  6. Konijn, T. M., Chang, Y. Y., Bonner, J. T. Synthesis of cyclic AMP in Dictyostelium discoideum and Polysphondylium pallidum. Nature. 224, 1211-1212 (1969).
  7. Iranfar, N., Fuller, D., Loomis, W. F. Genome-wide expression analyses of gene regulation during early development of Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 2, 664-670 (2003).
  8. Darmon, M., Brachet, P., Da Silva, L. H. Chemotactic signals induce cell differentiation in Dictyostelium discoideum. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 3163-3166 (1975).
  9. Mann, S. K., Firtel, R. A. Cyclic AMP regulation of early gene expression in Dictyostelium discoideum: mediation via the cell surface cyclic AMP receptor. Mol Cell Biol. 7, 458-469 (1987).
  10. Vinet, A. F., et al. Initiation of multicellular differentiation in Dictyostelium discoideum is regulated by coronin A. Mol Biol Cell. 25, 688-701 (2014).
  11. Eckert, C., Hammesfahr, B., Kollmar, M. A holistic phylogeny of the coronin gene family reveals an ancient origin of the tandem-coronin, defines a new subfamily, and predicts protein function. BMC Evol Biol. 11, 268(2011).
  12. Pieters, J., Muller, P., Jayachandran, R. On guard: coronin proteins in innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 13, 510-518 (2013).
  13. Gatfield, J., Albrecht, I., Zanolari, B., Steinmetz, M. O., Pieters, J. Association of the Leukocyte Plasma Membrane with the Actin Cytoskeleton through Coiled Coil-mediated Trimeric Coronin 1 Molecules. Mol Biol Cell. 16, 2786-2798 (2005).
  14. Kammerer, R. A., et al. A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13891-13896 (2005).
  15. Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Coronins: the return of the crown. Trends Cell Biol. 16, 421-426 (2006).
  16. Jayachandran, R., et al. Coronin 1 Regulates Cognition and Behavior through Modulation of cAMP/Protein Kinase A Signaling. PLoS Biol. 12, e1001820(2014).
  17. Suo, D., et al. Coronin-1 is a neurotrophin endosomal effector that is required for developmental competition for survival. Nat Neurosci. 17, 36-45 (2014).
  18. Mueller, P., et al. Regulation of T cell survival through coronin-1-mediated generation of inositol-1,4,5-trisphosphate and calcium mobilization after T cell receptor triggering. Nat Immunol. 9, 424-431 (2008).
  19. de Hostos, E. L., Bradtke, B., Lottspeich, F., Guggenheim, R., Gerisch, G. Coronin, an actin binding protein of Dictyostelium discoideum localized to cell surface projections, has sequence similarities to G protein beta subunits. EMBO J. 10, 4097-4104 (1991).
  20. Shina, M. C., et al. Redundant and unique roles of coronin proteins in Dictyostelium. Cell Mol Life Sci. 68, 303-313 (2011).
  21. Cornillon, S., et al. Phg1p is a nine-transmembrane protein superfamily member involved in dictyostelium adhesion and phagocytosis. J Biol Chem. 275, 34287-34292 (2000).
  22. Gomer, R. H., Yuen, I. S., Firtel, R. A. A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium. Development. (112), 269-278 (1991).
  23. Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation. Zoological science. 12, 61-69 (1995).
  24. Mehdy, M. C., Firtel, R. A. A secreted factor and cyclic AMP jointly regulate cell-type-specific gene expression in Dictyostelium discoideum. Mol Cell Biol. 5, 705-713 (1985).
  25. Jain, R., Yuen, I. S., Taphouse, C. R., Gomer, R. H. A density-sensing factor controls development in Dictyostelium. Genes Dev. 6, 390-400 (1992).
  26. Loomis, W. F. Cell signaling during development of Dictyostelium. Dev Biol. 391, 1-16 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Aggregation AssayCyclic AMP PulsesCell AggregationTime lapse MicroscopyHemocytometer CountingConditioned MediumDevelopmental Biology

Gerelateerde artikelen