Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Ontwikkeling van een

12.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53974

⸱

10 juni 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Laboratory, The University of Tokyo Hospital, 2Department of Respiratory Medicine, The University of Tokyo Hospital

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we de ontwikkeling en toepassing van een gelcontractie-assay voor het evalueren van contractiele functie in mesenchymale cellen die een epitheel-mesenchymale overgang hebben ondergaan.

Samenvatting

Fibrose is vaak betrokken bij de pathogenese van verschillende chronische progressieve ziekten, zoals interstitiële longziekte. Een pathologisch kenmerk is de vorming van fibroblastische foci, wat geassocieerd is met de ernst van de ziekte. Er wordt voorgesteld dat mesenchymale cellen die bestaan uit de fibroblastische foci afkomstig zijn van verschillende celbronnen, waaronder oorspronkelijk residente intrapulmonale fibroblasten en circulerende fibrocyten uit het beenmerg. Recentelijk is ook aangenomen dat mesenchymale cellen die een epitheel-mesenchymale overgang (EMT) hebben ondergaan, bijdragen aan de pathogenese van fibrose. Bovendien kan EMT worden geïnduceerd door transformatiegroeifactor β, en kan EMT worden versterkt door pro-inflammatoire cytokinen zoals tumornecrosefactor α. De gelcontractie-assay is een ideaal in vitro model voor de evaluatie van contractiliteit, wat een van de karakteristieke functies van fibroblasten is en bijdraagt aan wondherstel en fibrose. Hier wordt de ontwikkeling van een gelcontractie-assay gedemonstreerd voor het evalueren van de contractiele capaciteit van mesenchymale cellen die een EMT hebben ondergaan.

Inleiding

Fibrose is betrokken bij de pathogenese van verschillende chronische progressieve ziekten zoals interstitiële longziekte, cardiale fibrose, levercirrose, terminale nierinsufficiëntie, systemische sclerose en auto-immuunziekte 1. Onder interstitiële longziekten, idiopathische longfibrose (IPF) is een chronische progressieve ziekte en geeft een slechte prognose. Pathologische kenmerk van IPF is de ontwikkeling van fibroblastische foci bestaande uit geactiveerde fibroblasten en myofibroblasten die worden geassocieerd met de prognose. De oorsprong van deze pulmonaire fibroblasten voorgesteld kunnen worden uit verschillende mesenchymale cellen, zoals oorspronkelijk resident pulmonaire fibroblasten en circuleert fibrocytes uit beenmerg. Recentelijk heeft epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) voorgesteld worden geassocieerd met de vorming van mesenchymale cellen 2, en bijdragen aan de pathogenese van fibrotische aandoeningen.

Er wordt gedacht dat EMT speelt een belangrijke rol in het proces van foetale ontwikkeling, wondgenezing en progressie van kanker, waaronder tumorinvasie en metastase 3. Na het proces van EMT, epitheelcellen verkrijgen het vermogen van mesenchymale cellen door verlies van epitheliale merkers, zoals E-cadherine, en expressie van mesenchymale merkers zoals vimentine en α-gladde spier actine (SMA) 4,5. Eerdere studies toonden het bewijs dat EMT proces is geassocieerd met de ontwikkeling van weefsel fibrose in de nier en de longen 6 7. Bovendien, chronische ontsteking bevordert fibrotische ziekte 8; Bovendien, zoals inflammatoire cytokinen zoals tumornecrosefactor superfamilieelement 14 (TNFSF14, LIGHT), tumornecrosefactor (TNF) -α, en interleukine-1β, is aangetoond EMT 9-12 verbeteren.

Collageengel contractie assay, een collageen gebaseerde celcontractie assay waarin fibroblasten zijn ingebed in type Icollageengel driedimensionaal, ideaal in vitro model voor de evaluatie van de contractiliteit. Contractiliteit is een van de karakteristieke functies van fibroblasten en draagt ​​bij normale wondgenezing en fibrose 13. Bij deze test wordt aangenomen dat de hechting van fibroblasten aan type I collageen door middel van integrine-afhankelijke mechanismen zou moeten mechanische spanning produceren onder bepaalde omstandigheden, en derhalve leiden tot weefselsamentrekking.

Hier wordt de ontwikkeling van de gel contractie assay gemeld worden aangepast aan de verwerving van contractiele functie uitwerkt in de cellen die EMT ondergingen. Dit rapport toont aan dat dit gewijzigde test is geschikt voor het evalueren van de contractiliteit in mesenchymale cellen die EMT ondergingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Voorbereiding en Cultuur van longepitheelcellen

  1. Cultuur A549 humane long epitheelcellen (hechtende cellijn) in Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 IE / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine.
  2. Verwijder de celkweekmedia van kweekschaal en was eenmaal met 5-10 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Na wassen onmiddellijk zuig het PBS.
  3. Voeg 2 ml trypsine / ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) (0,05%) en incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 3 minuten.
  4. Verzamelen van de losgemaakte cellen in centrifugebuizen met celcultuurmedium Centrifugeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende 4 min bij 150 xg.
  5. Resuspendeer pellet de cellen in 2 ml celkweekmedium en verwijderen van een monster voor celtelling. Tel het aantal cellen met een hemocytometer met trypan blauwe vlek cellevensvatbaarheid controleren.
  6. Zaad A549 cellen op10 cm polystyreen platen bij een dichtheid van 0,5-1,0 x 10 6 cellen / schaal met 10 ml medium voor contractie gel assay. Zaad de cellen op platen met 6 putjes van polystyreen met een dichtheid van 0,5-1,0 x 10 5 cellen / putje met 2 ml medium voor EMT bevestiging. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur.

2. EMT Procedure

  1. Voeg 10 ul van TGF-β1 (5 ug / ml) en 10 pl TNF-α (10 ug / ml) aan het dienblad gel krimp test gezaaid in stap 1,6. Voeg 2 ul van TGF-β1 (5 ug / ml) en 2 pl TNF-α (10 ug / ml) aan het dienblad EMT bevestiging gezaaid in stap 1,6. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 48 uur.

3. Bevestiging van EMT Procedure met behulp van PCR en Western Blotting

  1. Bevestig verandering in morfologie (van geplaveide-achtige vorm te spindel) van de behandelde cellen met behulp van fase-contrast microscopie.
    Opmerking: Normal A549 cellen geplaveide-achtige en driehoekig uiterlijk dat karakteristiek is voor epitheelcellen, maar na stimulatie met TGF-β1 en TNF-α, de cellen lijken lange spoelvormige die vergelijkbaar is met mesenchymale cellen 14,15.
  2. Evalueer de expressie van epitheliale merker, zoals E-cadherine en mesenchymale markers zoals N-cadherine, vimentine en α-gladde spier actine middels PCR of Western blotting.
    1. Extract totaal RNA uit de cellen gebruikmakend van RNA extractiekit 16 en het synthetiseren van cDNA met behulp van reverse transcriptase 17 volgens het protocol van de fabrikant.
    2. Meet expressie van mRNA niveaus met behulp van real time PCR systeem 18 en monomere cyanine kleurstof PCR kit volgens instructies van de fabrikant. De specifieke primers voor GAPDH (glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase), ACTA2 (alfa-actine-2), CDH1 (cadherine-1, E-cadherine) en VIM (vimentine) getoond in Tabel 1 .
    3. Lyseren van de cellen met een lysis buffer (tabel 2) oplossing met 1% proteaseremmer cocktail. Meet de monstereiwit door gebruikmaking van een proteïne testkit 19,20 en dezelfde hoeveelheden eiwit toepassen op een polyacrylamidegel.
      1. Uitvoeren SDS gel-elektroforese en semi-droge overdracht van de eiwitten op PVDF-membraan 21. Incubeer het membraan met primaire antilichamen in blokkeerbuffer gedurende 1 - 2 uur. Na incubatie, was twee keer het membraan met wasbuffer en incubeer het membraan 1 uur met tweede antilichamen.
        Opmerking: zie de materialen / Apparatuur Tafel voor antilichamen en verdunningen gebruikt in deze studies. Zie tabel 2 voor de componenten van blokkerende buffer.
      2. Was het membraan met wasbuffer tweemaal. Neem foto's van het membraan met de Western blotting detectie kit 22 met behulp van een koude CCD-camera 11,23.

4. Gel Contractie Assay voor het evalueren van EMT

  1. Zuig het geconditioneerde media uit de celkweek vat, en goed wassen met 5-10 ml PBS om de dode cellen te verwijderen. Na wassen onmiddellijk zuig het PBS.
  2. Voeg 2 ml van 0,05% trypsine / EDTA en incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 3 minuten.
  3. Verzamelen van de losgemaakte cellen in centrifugebuizen met DMEM aangevuld met trypsineremmer (1 mg / ml) Centrifugeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende 4 min bij 150 xg.
  4. Meng Type 1 collageengel met gedestilleerd water, en 4 × geconcentreerd DMEM de volumes passen aan een collageen concentratie van 1,75 mg / ml te bereiken, en 1 x DMEM concentratie. Zorg ervoor dat de gel medium op ijs tijdens deze stap te houden.
    Opmerking: Uit 6 ml gel medium maken, meng goed 3,5 ml van type 1 collageen gel (3 mg / ml), 1,5 ml van 4 x geconcentreerde DMEM en 1 ml gedestilleerd water.
  5. Resuspendeer de celpellet in 500 pl PBS en verwijderen van een monster voor celtelling. tellenhet aantal cellen met een hemocytometer met trypan blauwe vlek cellevensvatbaarheid controleren.
  6. Voeg de gel medium aan de hoeveelheid aan te passen tot een celdichtheid van 3,0 x 10 5 cellen / putje (6,0 x 10 5 cellen / ml) en voorzichtig bereiken maar snel mengen door pipetteren zonder gelering.
  7. Verdeel 0,5 ml van het mengsel in elk putje van een 24-well niet-behandelde plaat snel en nauwkeurig nette cilindervorm maken. Wees voorzichtig niet toe te staan ​​eventuele luchtbellen naar de gels (Figuur 1A) besmetten.
    Opmerking: De gel medium dat de cellen viskeus en kan gemakkelijk geleren en vorm toenemende vorm in de put.
  8. Incubeer de plaat gedurende 15 min in een cel incubator bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid volledig geleren.
  9. Gels los van de plaat zonder dat door verplaatsing van het gesteriliseerde spatel op een wijze die een omtrek trekken in een richting. Met een spatel voorzichtig de gels 60 mm weefselkweekschalen overdragenbevattende 5 ml van DMEM / 1% FBS met of zonder TGF-β1 (5 ng / ml) en TNF-α (10 ng / ml).
  10. Schud de gerechten om ervoor te zorgen gels drijven op het medium. Incubeer in een cel incubator bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid.

5. Meting van Gel Grootte

  1. Meet de collageengel grootte na 0, 24, 48 en 72 uur met een beeldanalysesysteem.
    1. Schakel de gel documentatiesysteem (Figuur 2A), en zet gerechten in het licht afschermende kast. Vervolgens neemt u het deksel van de gerechten in de kast.
    2. Open de bijbehorende gel analysesoftware. Klik op de "image overname knop" in de menu-balk om het imago van de gels in de kast te laten zien. Klik vervolgens op "verkrijgen" in de menubalk om foto's van de gels (Figuur 2B) te nemen.
    3. Klik op de "opsporing knop" in de menubalk (figuur 2C) en stel het meetgebied (gele cirkel in figuur 2C) door de muis te slepen. Klik vervolgens op de "auto-detect knop" in de menubalk (zie de knop in figuur 2D). De software detecteert automatisch de gels met een heatmap (figuur 2D).
    4. Klik op "OK" om de omtrek van de gels door beeldverwerking te halen en naar gebieden, omringd door de omtrek (Figuur 2E) te berekenen. Nadat het gebied wordt berekend, wordt het berekende gebied weergegeven in een aparte pop-up venster.
      Let op: Als de gelen elkaar overlappen tijdens de beeldvorming, bewegen gels voorzichtig met behulp van een steriele pipet tip.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Tijdens EMT, epitheelcellen verliezen epitheliale merkers, zoals E-cadherine, en krijgen de expressie van mesenchymale markers, zoals vimentine en α-gladde spier actine 4,5. Incubatie van A549 humane long epitheelcellen met TGF-β1 en TNF-α induceert EMT. Het uiterlijk van normale A549 cellen zijn geplaveide achtige vorm en driehoekig dat karakteristiek is voor epitheliale cellen (Figuur 3A), maar na gestimuleerd met TGF-β1 en TNF-α, het uiterlijk veranderde vo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De in deze onderzoeksprotocol omvat twee stappen. De eerste stap wordt uitgevoerd om EMT induceren, terwijl de tweede stap is de gel samentrekking assay. Aangezien het belangrijk te bevestigen dat cellen ondergingen EMT, stap 2 een uitstekende aanvulling op de morfologische veranderingen en gen expressie. Eerdere studies toonden aan dat EMT van A549-cellen werd geïnduceerd met slechts 24 TGF-β1; echter, zoals we eerder hebben gemeld 10, TNF-α behandeling verbetert EMT en de overname van mesenchymal...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken Dr. Tadashi Koyama voor technische hulp. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door JSPS KAKENHI Grant Nummers 23249045, 15K09211, 15K19172; een subsidie aan de Respiratory Failure Research Group van het Ministerie van Volksgezondheid, Arbeid en Welzijn, Japan; een subsidie voor onderzoek naar allergische ziekten en immunologie, Japan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DMEMsigma aldrich11965-092Voor A549 medium
FBSGIBCO10437
Transforming Growth Factor-β1, Human, recombinantWako Laboratory chemicals209-16544
Recombinant Human TNF-αR&D systems210-TA/CF
E-Cadherin (24E10) Rabbit mAbCell Signaling Technology#31951:3.000 verdunning
Vimentin (D21H3) Rabbit mAbCell Signaling Technology#57411:3.000 verdunning
Anti-α-Tubulin antibodysigma aldrichT90261:10.000 verdunning
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody sigma aldrichA52281:10.000 verdunning
Anti-N-cadherin antibodyBD Transduction Laboratories#6109201:1.000 verdunning
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (secondary antibody)GE HealthcareNA931-100UL1:20.000 verdunning
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey (secondary antibody)GE HealthcareNA934-100UL1:20.000 verdunning
Blocking reagentGE HealthcareRPN4182% in TBS-T
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lidcorning#353046
100 mm Cell culture dishTPP#93100
DMEM, powderlife technologies12100-046Voor 4× DMEM
Type 1 collagen gelNitta gelatinCellmatrix type I-A
24 Well cell culture plateAGC TECHNO GLASS1820-024
Gel Documentation System ATTOAE-6911FXNGel imager
Gel analyzing softwareATTODensitograph, ver. 3.00analysesoftware gebundeld met AE-6911FXN
Trypsin-EDTA (0,05%), phenol redlife technologies25300054
24 Well Plates, Non-TreatedIWAKI1820-024
Trypan Blue Solution, 0,4%life technologies15250-061
RNA extraction kitQiagen74106
Reverse transcriptaselife technologies18080044
Real time PCR systemStratageneMx-3000P
SYBR green PCR kitQiagen204145
Protease Inhibitor Cocktail (100x)life technologies78429
PVDF membraneATTO2392390
Protein assay kitbio-rad5000006JA 
Polyacrylamide gelATTO2331810
Western blotting detection reagentGE HealthcareRPN2232
Cold CCD cameraATTOEz-Capture MG/ST
Trypsin inhibitorsigma aldrichT9003-100MG
Polyoxyethylene (20)Sorbitan MonolaurateWako Laboratory chemicals163-11512
Polyoxyethylene (9) octyiphenyl etherWako Laboratory chemicals141-08321

Referenties

  1. Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-214 (2008).
  2. Hardie, W. D., Glasser, S. W., Hagood, J. S. Emerging concepts in the pathogenesis of lung fibrosis. The American journal of pathology. 175, 3-16 (2009).
  3. Kovacic, J. C., Mercader, N., Torres, M., Boehm, M., Fuster, V. Epithelial-to-mesenchymal and endothelial-to-mesenchymal transition: from cardiovascular development to disease. Circulation. 125, 1795-1808 (2012).
  4. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
  5. Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. The Journal of clinical investigation. 119, 1420-1428 (2009).
  6. Forino, M., et al. TGFbeta1 induces epithelial-mesenchymal transition, but not myofibroblast transdifferentiation of human kidney tubular epithelial cells in primary culture. International journal of experimental pathology. 87, 197-208 (2006).
  7. Yang, S., et al. Participation of miR-200 in pulmonary fibrosis. The American journal of pathology. 180, 484-493 (2012).
  8. Reynolds, H. Y. Lung inflammation and fibrosis: an alveolar macrophage-centered perspective from the 1970s to 1980s. American journal of respiratory and critical care medicine. 171, 98-102 (2005).
  9. Camara, J., Jarai, G. Epithelial-mesenchymal transition in primary human bronchial epithelial cells is Smad-dependent and enhanced by fibronectin and TNF-alpha. Fibrogenesis & tissue repair. 3, 2(2010).
  10. Kamitani, S., et al. Simultaneous stimulation with TGF-beta1 and TNF-alpha induces epithelial mesenchymal transition in bronchial epithelial cells. International archives of allergy and immunology. 155, 119-128 (2011).
  11. Mikami, Y., et al. Lymphotoxin beta receptor signaling induces IL-8 production in human bronchial epithelial cells. PloS one. 9, e114791(2014).
  12. Yamauchi, Y., et al. Tumor necrosis factor-alpha enhances both epithelial-mesenchymal transition and cell contraction induced in A549 human alveolar epithelial cells by transforming growth factor-beta1. Experimental lung research. 36, 12-24 (2010).
  13. Grinnell, F. Fibroblasts, myofibroblasts, and wound contraction. The Journal of cell biology. 124, 401-404 (1994).
  14. Ramos, C., et al. FGF-1 reverts epithelial-mesenchymal transition induced by TGF-{beta}1 through MAPK/ERK kinase pathway . American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 299, L222-L231 (2010).
  15. Ren, Z. X., Yu, H. B., Li, J. S., Shen, J. L., Du, W. S. Suitable parameter choice on quantitative morphology of A549 cell in epithelial-mesenchymal transition. Bioscience reports. 35, (2015).
  16. Brinkmann, V., Kinzel, B., Kristofic, C. TCR-independent activation of human CD4+ 45RO- T cells by anti-CD28 plus IL-2: Induction of clonal expansion and priming for a Th2 phenotype. Journal of immunology. 156, 4100-4106 (1996).
  17. Krug, M. S., Berger, S. L. First-strand cDNA synthesis primed with oligo(dT). Methods in enzymology. 152, 316-325 (1987).
  18. Morozumi, M., et al. Simultaneous detection of pathogens in clinical samples from patients with community-acquired pneumonia by real-time PCR with pathogen-specific molecular beacon probes. Journal of clinical microbiology. 44, 1440-1446 (2006).
  19. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  20. Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation. Analytical biochemistry. 175, 231-237 (1988).
  21. Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W., et al. Electroblotting from polyacrylamide gels. Current protocols in protein science. Chapter 10, Unit 10.7(2001).
  22. Kricka, L. J., Voyta, J. C., Bronstein, I. Chemiluminescent methods for detecting and quantitating enzyme activity. Methods in enzymology. 305, 370-390 (2000).
  23. Noguchi, S., et al. An integrative analysis of the tumorigenic role of TAZ in human non-small cell lung cancer. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 20, 4660-4672 (2014).
  24. Kasai, H., Allen, J. T., Mason, R. M., Kamimura, T., Zhang, Z. TGF-beta1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition (EMT). Respiratory research. 6, 56(2005).
  25. Chen, X., et al. Integrin-mediated type II TGF-beta receptor tyrosine dephosphorylation controls SMAD-dependent profibrotic signaling. The Journal of clinical investigation. 124, 3295-3310 (2014).
  26. Saito, A., et al. An integrated expression profiling reveals target genes of TGF-beta and TNF-alpha possibly mediated by microRNAs in lung cancer cells. PloS one. 8, e56587(2013).
  27. Dvashi, Z., et al. Protein phosphatase magnesium dependent 1A governs the wound healing-inflammation-angiogenesis cross talk on injury. The American journal of pathology. 184, 2936-2950 (2014).
  28. Hallgren, O., et al. Enhanced ROCK1 dependent contractility in fibroblast from chronic obstructive pulmonary disease patients. Journal of translational medicine. 10, 171(2012).
  29. Kobayashi, T., et al. Matrix metalloproteinase-9 activates TGF-beta and stimulates fibroblast contraction of collagen gels. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 306, L1006-L1015 (2014).
  30. Horie, M., et al. Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor. Experimental lung research. 40, 222-236 (2014).
  31. Kohyama, T., et al. PGD(2) modulates fibroblast-mediated native collagen gel contraction. American journal of respiratory cell and molecular biology. 27, 375-381 (2002).
  32. Muir, A. B., et al. Esophageal epithelial cells acquire functional characteristics of activated myofibroblasts after undergoing an epithelial to mesenchymal transition. Experimental cell research. 330, 102-110 (2015).
  33. Zhong, Q., et al. Role of endoplasmic reticulum stress in epithelial-mesenchymal transition of alveolar epithelial cells: effects of misfolded surfactant protein. American journal of respiratory cell and molecular biology. 45, 498-509 (2011).
  34. Liu, X. Inflammatory cytokines augments TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in A549 cells by up-regulating TbetaR-I. Cell motility and the cytoskeleton. 65, 935-944 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Gelcontractie-assayTGF bèta 1TNF alfaA549-cellencelcontractiliteitWestern blot-analyseimmunofluorescentiekleuringcelkweekincubator
Ontwikkeling van een
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.