Hier beschrijven we de ontwikkeling en toepassing van een gelcontractie-assay voor het evalueren van contractiele functie in mesenchymale cellen die een epitheel-mesenchymale overgang hebben ondergaan.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Fibrose is vaak betrokken bij de pathogenese van verschillende chronische progressieve ziekten, zoals interstitiële longziekte. Een pathologisch kenmerk is de vorming van fibroblastische foci, wat geassocieerd is met de ernst van de ziekte. Er wordt voorgesteld dat mesenchymale cellen die bestaan uit de fibroblastische foci afkomstig zijn van verschillende celbronnen, waaronder oorspronkelijk residente intrapulmonale fibroblasten en circulerende fibrocyten uit het beenmerg. Recentelijk is ook aangenomen dat mesenchymale cellen die een epitheel-mesenchymale overgang (EMT) hebben ondergaan, bijdragen aan de pathogenese van fibrose. Bovendien kan EMT worden geïnduceerd door transformatiegroeifactor β, en kan EMT worden versterkt door pro-inflammatoire cytokinen zoals tumornecrosefactor α. De gelcontractie-assay is een ideaal in vitro model voor de evaluatie van contractiliteit, wat een van de karakteristieke functies van fibroblasten is en bijdraagt aan wondherstel en fibrose. Hier wordt de ontwikkeling van een gelcontractie-assay gedemonstreerd voor het evalueren van de contractiele capaciteit van mesenchymale cellen die een EMT hebben ondergaan.
Inleiding
Fibrose is betrokken bij de pathogenese van verschillende chronische progressieve ziekten zoals interstitiële longziekte, cardiale fibrose, levercirrose, terminale nierinsufficiëntie, systemische sclerose en auto-immuunziekte 1. Onder interstitiële longziekten, idiopathische longfibrose (IPF) is een chronische progressieve ziekte en geeft een slechte prognose. Pathologische kenmerk van IPF is de ontwikkeling van fibroblastische foci bestaande uit geactiveerde fibroblasten en myofibroblasten die worden geassocieerd met de prognose. De oorsprong van deze pulmonaire fibroblasten voorgesteld kunnen worden uit verschillende mesenchymale cellen, zoals oorspronke....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding en Cultuur van longepitheelcellen
- Cultuur A549 humane long epitheelcellen (hechtende cellijn) in Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 IE / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine.
- Verwijder de celkweekmedia van kweekschaal en was eenmaal met 5-10 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Na wassen onmiddellijk zuig het PBS.
- Voeg 2 ml trypsine / ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) (0,05%) en incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 3 minuten.
- Verzamelen van de losgemaakte cellen in centrifugebuizen met celcultuurmedium Centrifugeer de....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Tijdens EMT, epitheelcellen verliezen epitheliale merkers, zoals E-cadherine, en krijgen de expressie van mesenchymale markers, zoals vimentine en α-gladde spier actine 4,5. Incubatie van A549 humane long epitheelcellen met TGF-β1 en TNF-α induceert EMT. Het uiterlijk van normale A549 cellen zijn geplaveide achtige vorm en driehoekig dat karakteristiek is voor epitheliale cellen (Figuur 3A), maar na gestimuleerd met TGF-β1 en TNF-α, het uiterlijk veranderde vo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De in deze onderzoeksprotocol omvat twee stappen. De eerste stap wordt uitgevoerd om EMT induceren, terwijl de tweede stap is de gel samentrekking assay. Aangezien het belangrijk te bevestigen dat cellen ondergingen EMT, stap 2 een uitstekende aanvulling op de morfologische veranderingen en gen expressie. Eerdere studies toonden aan dat EMT van A549-cellen werd geïnduceerd met slechts 24 TGF-β1; echter, zoals we eerder hebben gemeld 10, TNF-α behandeling verbetert EMT en de overname van mesenchymal.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
We danken Dr. Tadashi Koyama voor technische hulp. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door JSPS KAKENHI Grant Nummers 23249045, 15K09211, 15K19172; een subsidie aan de Respiratory Failure Research Group van het Ministerie van Volksgezondheid, Arbeid en Welzijn, Japan; een subsidie voor onderzoek naar allergische ziekten en immunologie, Japan.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM | sigma aldrich | 11965-092 | Voor A549 medium |
| FBS | GIBCO | 10437 | |
| Transforming Growth Factor-β1, Human, recombinant | Wako Laboratory chemicals | 209-16544 | |
| Recombinant Human TNF-α | R&D systems | 210-TA/CF | |
| E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #3195 | 1:3.000 verdunning |
| Vimentin (D21H3) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #5741 | 1:3.000 verdunning |
| Anti-α-Tubulin antibody | sigma aldrich | T9026 | 1:10.000 verdunning |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody | sigma aldrich | A5228 | 1:10.000 verdunning |
| Anti-N-cadherin antibody | BD Transduction Laboratories | #610920 | 1:1.000 verdunning |
| Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (secondary antibody) | GE Healthcare | NA931-100UL | 1:20.000 verdunning |
| Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey (secondary antibody) | GE Healthcare | NA934-100UL | 1:20.000 verdunning |
| Blocking reagent | GE Healthcare | RPN418 | 2% in TBS-T |
| 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid | corning | #353046 | |
| 100 mm Cell culture dish | TPP | #93100 | |
| DMEM, powder | life technologies | 12100-046 | Voor 4× DMEM |
| Type 1 collagen gel | Nitta gelatin | Cellmatrix type I-A | |
| 24 Well cell culture plate | AGC TECHNO GLASS | 1820-024 | |
| Gel Documentation System | ATTO | AE-6911FXN | Gel imager |
| Gel analyzing software | ATTO | Densitograph, ver. 3.00 | analysesoftware gebundeld met AE-6911FXN |
| Trypsin-EDTA (0,05%), phenol red | life technologies | 25300054 | |
| 24 Well Plates, Non-Treated | IWAKI | 1820-024 | |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | life technologies | 15250-061 | |
| RNA extraction kit | Qiagen | 74106 | |
| Reverse transcriptase | life technologies | 18080044 | |
| Real time PCR system | Stratagene | Mx-3000P | |
| SYBR green PCR kit | Qiagen | 204145 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (100x) | life technologies | 78429 | |
| PVDF membrane | ATTO | 2392390 | |
| Protein assay kit | bio-rad | 5000006JA | |
| Polyacrylamide gel | ATTO | 2331810 | |
| Western blotting detection reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
| Cold CCD camera | ATTO | Ez-Capture MG/ST | |
| Trypsin inhibitor | sigma aldrich | T9003-100MG | |
| Polyoxyethylene (20)Sorbitan Monolaurate | Wako Laboratory chemicals | 163-11512 | |
| Polyoxyethylene (9) octyiphenyl ether | Wako Laboratory chemicals | 141-08321 |
Referenties
- Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-214 (2008).
- Hardie, W. D., Glasser, S. W., Hagood, J. S. Emerging concepts in the pathogenesis of lung fibrosis. The American journal of pathology. 175, 3-16 (20....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
