Voorspelling en Validatie van Gene Regulatory Elements geactiveerd tijdens retinoïnezuur Induced embryonale stamcellen Differentiatie

Summary

In dit werk bieden we een experimentele workflow van hoe actieve enhancers kunnen worden geïdentificeerd en experimenteel gevalideerd.

Abstract

Embryonale ontwikkeling is een meerstaps proces waarbij activering en onderdrukking van vele genen. Enhancer elementen in het genoom is gekend dat ze weefsel en celtype-specifieke regulatie van genexpressie tijdens de celdifferentiatie. Dus, de identificatie en verder onderzoek is belangrijk om te begrijpen hoe lot van de cel wordt bepaald. Integratie van genexpressie data (bijvoorbeeld microarray of RNA-volgende) en de resultaten van chromatine immunoprecipitatie (ChIP) gebaseerde genoomwijde studies (ChIP-seq) maakt het mogelijk op grote schaal identificatie van deze regulerende gebieden. Functionele validatie van celtype enhancers vereist verdere in vitro en in vivo experimentele procedures. Hier beschrijven we hoe actief enhancers kunnen worden geïdentificeerd en experimenteel gevalideerd. Dit protocol voorziet in een stap-voor-stap workflow die bestaat uit: 1) de identificatie van regulerende gebieden van Chip-seq data-analyse, 2) het klonen en experimental validatie van putatieve regulerende potentieel van de geïdentificeerde genomische sequenties in een reporter assay, en 3) bepaling van enhancer activiteit in vivo door het meten enhancer RNA transcript niveau. De gepresenteerde protocol is gedetailleerd genoeg om iedereen te helpen bij het opzetten van deze workflow in het lab. Belangrijk, kan het protocol eenvoudig aangepast worden aan en gebruikt in een cellulair modelsysteem.

Introduction

De ontwikkeling van een meercellig organisme vereist een nauwkeurig gereguleerde expressie van duizenden genen in ontwikkelende weefsels. Regulatie van genexpressie wordt grotendeels bereikt door enhancers. Enhancers zijn korte niet-coderende DNA-elementen die kunnen worden gebonden met transcriptiefactoren (TF's) en op afstand kunnen werken om de transcriptie van een doelgen te activeren¹. Enhancers zijn over het algemeen cis-werkend en worden het meest frequent gevonden net stroomopwaarts van de transcriptiestartplaats (TSS), maar recente studies beschreven ook voorbeelden waarbij enhancers veel verder stroomopwaarts werden gevonden, op de 3' van het gen of zelfs binnen de introns en exons².

Er zijn honderdduizenden potentiële enhancers in de genomen van gewervelde dieren¹. Recente methoden gebaseerd op chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) leveren high-throughput data van het hele genoom die kunnen worden gebruikt voor enhanceranalyse^3-9. Hoewel gegevens verkregen door ChIP-seq-experimenten de kans om cel- en weefselspecifieke enhancers te identificeren aanzienlijk verhogen, is het belangrijk om in gedachten te houden dat gedetecteerde bindingsplaatsen niet noodzakelijk directe DNA-binding en/of functionele enhancers identificeren. Daarom is verdere functionele analyse van nieuw geïdentificeerde enhancers onmisbaar. In dit werk presenteren we een eenvoudig drie-stappen proces voor identificatie en validatie van putatieve actieve enhancers. Dit omvat: 1) selectie van putatieve transcriptiefactor-bindingsplaatsen door bioinformatica-analyse van ChIP-seq-gegevens, 2) klonen en validatie van deze regulatorische sequenties in reporter-constructen, en 3) meting van enhancer RNA (eRNA).

Blootstelling van embryonale stamcellen (ES) aan retinoïnezuur (RA) wordt vaak gebruikt om neurale differentiatie van de pluripotente cellen te bevorderen ¹⁰. RA oefent zijn effecten uit door te binden aan RA-receptoren (RARα, β, γ) en retinoïde X-receptoren (RXRα, β, γ). RAR's en RXR's in de vorm van een heterodimeer binden aan DNA-motieven die RA-responselementen worden genoemd, die doorgaans zijn gerangschikt als directe herhalingen van de AGGTCA-sequentie (genoemd als halfsite) en reguleren transcriptie. Ligand-behandelingsexperimenten maakten de identificatie mogelijk van verschillende door retinoïnezuur gereguleerde genen in ES-cellen ^11,12. Echter, enhancer-elementen voor veel van deze genen zijn nog niet beschreven. Om te demonstreren hoe het hier beschreven workflow kan worden gebruikt voor enhancer-identificatie en -validatie, laten we stap-voor-stap de selectie en karakterisering zien van twee retinoïnezuur-afhankelijke enhancers in embryonale stamcellen.

Protocol

1. Enhancer selectie op basis van Chip-seq Analyse

1. Download de RXR ChIP-seq ruwe data fastq file (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) van http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
2. Download en pak het vereiste BWA-index bestand voor de uitlijning (in ons geval: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
   OPMERKING: Bezoek aan https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts voor meer informatie over de stappen van bio-informatica-analyse en de scripts hieronder gebruikte downloaden.
3. Lijn het voorbeeld fastq bestand naar MM10 genoom (gebruik het script: perform_alignment.sh). Dit zal een map met een .bam file en statistieken van de uitlijning te creëren. Aligned RXR ChIP-seq data (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam), en de bijbehorende index-bestand (.bai) zijn hier beschikbaar:
   http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
   LET OP: BWA is een softwarepakket dat Rela uitgelijndtief korte sequenties (bijvoorbeeld ChIP-seq resultaten) een sequentie databank, zoals de muis referentie genoom (bijvoorbeeld, MM10) ^13.
4. Voer het script (callpeaks.sh) voor de piek bellen en de novo motief analyse. Gebruik de .bam bestand als de input. Het script is gebaseerd op Homerus findPeaks ^14.
   NB: De output file ons informatie over het totale aantal pieken, verrijking van de motieven, het percentage van de achtergrond en de doelsequenties met motieven, enzovoort. (Figuur 1). Typisch verschillende motieven zijn vermeld in volgorde van hun betekenis.
5. Remap de # 1 gerangschikt motief (NR half `AGGTCA`) (gebruik het script: remap_motif.sh)
   LET OP: Als resultaat, het script genereert een .bed bestand dat zal laten zien welke chip-pieken die genomische regio's die de canonieke bindingsplaats van de transcriptiefactor van belang bevatten.
6. Download en visualiseren van de resultaten van de uitgelijnde RXR ChIP-seq leest (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam (ook .bai downloaden)) en de AGGTCA motief occurrences (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) van Integrative Genomics Viewer (belastingen) aan ¹⁵ vermeende identificeren RAR / RXR bindingsplaatsen (Figuur 2 en Figuur 3).
   LET OP: integratie van verschillende ChIP-seq data zal helpen om meer precies te voorspellen goede kandidaat enhancers ^16,17. Recente studies toonden aan dat actieve enhancers gewoonlijk verrijkt zijn P300 en correleren met H3K4me1 en H3K27ac, en bevinden zich in de open chromatine gebieden, waardoor DNase-I overgevoeligheid afbeelden aanbevolen ^18-21.
7. Gebruik de "een van belang definiëren" in IGV ^15-200 verkrijgen - 400 bp sequentie van het geselecteerde genomische regio en gebruikt deze sequenties voor volgende primer design.

2. Reporter Assay

LET OP: De luciferine / luciferase systeem wordt gebruiktals een zeer gevoelig reporter assay voor transcriptionele regulering. Afhankelijk van de transcriptieverhogeractiviteit luciferase enzym geproduceerd dat de oxidatie van luciferine zal katalyseren oxyluciferine gevolg bioluminescense die gedetecteerd kan. Als eerste stap moet geïdentificeerde vermoedelijke enhancer sequenties gesubkloneerd in een reporter vector (bv TK-Luciferase ^22, of pGL3 NanoLuc).

1. primer Ontwerp
   1. Ontwerp PCR-primers voor amplificatie van 200-400 bp van vermoedelijke enhancer regios op Primer3 (hier beschikbaar: http://bioinfo.ut.ee/primer3/) ²³
   2. Copy-paste de genoomsequentie van IGV dat de vermoedelijke bindingsplaats in Primer3 bevat (zie stap 1.7). Set product grootte bereik 250-300 bp in Primer3.
   3. Valideren van de PCR-primers met behulp van de UCSC Genome Browser is In silico PCR gereedschap (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) ²⁴
      LET OP: Dit protocol in een latere stap gebruikt HindIII en BamHI restrictie-enzymen voor het kloneren. Controleer of de PCR geamplificeerde sequentie zoals voorspeld door de UCSC In-silico PCR tool zal AAGCTT of GGATCC restrictieplaatsen bevatten (bijv http://nc2.neb.com/NEBcutter2/).
   4. Verkrijgen van de gewenste primers van een commerciële leverancier.
2. PCR-amplificatie van Enhancer Sequence van Genomic DNA
   1. Zuiver template genoom DNA van primaire cellen (bijvoorbeeld primaire embryonale fibroblasten). Gebruik commerciële kit voor gDNA isolatie en volg de instructies van de fabrikant.
      LET OP: Hoge kwaliteit van gDNA is essentieel voor een succesvolle PCR-amplificatie. Geschikte BAC klonen kunnen worden gebruikt als PCR niet gemakkelijk vanaf gDNA.
   2. Bereid 50 gl PCR reactie bevattende 100 ng gDNA, 5 ui 10 x buffer, 3 pl MgSO ₄ (25 mM), 5 pl dNTP (2 mM elk), 1,5 gl Fwd primer (10 uM), 1,5 ui Rev primer (10 uM) , 1 pl DNA polymerase
      OPMERKING: Gebruik high-fidelity DNA polymerase met een lage foutenpercentage voor de PCR-reacties.
   3. Stel de PCR-cyclus (2 min 95 ° C, (20 sec 95 ° C, 10 sec 58-65 ° C, 18 sec 70 ° C) x25 repeat, 2 min 70 ° C, voor altijd 4 ° C). Stel hybridisatietemperatuur met de overweging van de primer voorspelde Tm-waarden.
   4. Zuiver het PCR product met een commerciële PCR zuiveringssamenstel en de instructies van de fabrikant.
   5. Voeren de restrictieplaatsen voor klonering door herhaaldelijk PCR met primers zoals hierboven toegepast, maar het toevoegen overhangen op hun 5 'einden (bijv Fwd: 5'-atat AAGCTT xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3' (HindIII), Rev: 5'-TATA GGATCC xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx -3 '(BamHI)).
   6. Run 5 ui van het PCR-product op agarose gel om te controleren op niet-specifieke PCR-producten.
      NB: Als er meer bands worden gedetecteerd, voert u het volledige PCR-product en zuiveren de juiste band door een commerciële gel extractie kit.
3. Beperking
   OPMERKING: insert klonen stroomopwaarts van TK promoter ²² het gezuiverde PCR-product en de vector (bijv TK-Luc) worden gedigereerd met HindIII en BamHI.
   1. Bereid een 50 gl reactiemengsel dat 1 ug gezuiverd PCR product, 1 ui HindlII (20 U / ul), 1 ui BamHI (20 U / pl) en 5 gl 10x buffer.
   2. Bereid een 250 ul reactiemengsel dat 5 ug vector (TK Luc of andere reporter vector), 5 gl HindlII (20 U / pl), 5 ui BamHI (20 U / pl), 5 gl warmtegevoelige alkaline fosfatase (1 U / pl) en 25 gl 10x buffer.
      OPMERKING: AP behandeling van de vector vermindert sterk de zelf-ligatie van één-gedigereerde vector en zo de achtergrond.
   3. Incubeer de reactiemengsels gedurende 4 uur bij 37 ° C, daarna zuiveren van de gedigereerde PCR-producten en de vector met een commerciële PCR zuivering kit.
4. Ligation
   1. Stel de reactie voor ligatie in PCR buizen inclusief 2 gl 10 x T4 DNA ligase buffer, 10 ng TK-Luc vector, 50 ng insert (gedigesteerd PCR product), 1 pl T4 DNA ligase (400 U / pl) en nuclease-vrij water tot 20 pl.
      OPMERKING: Bereid een negatieve controle waar de reactie niet insert bevat.
   2. Meng de reactie door en neer te pipetteren, het afsluiten kort de PCR buisjes u mini-centrifuge en vervolgens incuberen bij kamertemperatuur 10 min.
   3. Warmte geïnactiveerd bij 65 ° C gedurende 10 min vervolgens koelen op ijs en gebruik 5 ul van het product voor omzetting in 50 pi competente cellen (bijvoorbeeld DH5a).
   4. Gebruik standaard heat shock procedure om bacteriën te transformeren, pick-up koloniën en isoleren van plasmide-DNA met een commerciële kit. Valideer alle constructen door sequencing voor de volgende stappen.
5. Transfectie van ES cellen
   1. Met 48-well platen. Voeg 200 ul 0,1% gelatine solution / putje 30 min voor cel plating.
   2. Plaat embryonale stam (ES) cellen een dag voor transfectie. Gebruik voedingsvrije ES-cellen en plaat bij een dichtheid van 3 x 10 ⁴ cellen per putje in 250 ul ES medium / putje.
   3. Bereid het plasmide mixen (elke mix wordt berekend voor 8 putten, 4 onbehandelde en 4 retinoïnezuur-zuur behandelde) Meng 1:. 1250 ng TK-Luc Empty (negatieve controle), 950 ng β-galactosidase coderende vector (PGal), Mix 2 : 1250 ng TK-Luc Hoxa1 enhancer (positieve controle), 950 ng pGal, Mix 3: 1250 ng TK-Luc PRMT8 enhancer (region of interest), 950 ng pGal.
      LET OP: ES-cellen drukken de gewenste transcriptiefactoren (RAR / RXR). Laat putten ongetransfecteerde om basiswaarden later vast te stellen tijdens de luciferase en β-galactosidase metingen.
   4. Voeg transfectie kwaliteit gereduceerd serum media om elk plasmide te mengen tot 106 ui totaal volume (genoeg voor 8 putten).
   5. Voeg 4,5 ul ES kwaliteit transfecterenion reagens vervolgens zorgvuldig meng door pipetteren 15 keer op en neer. Incubeer de transfectie mix gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
   6. Voeg 13 ul van de transfectie mix aan de cellen per well, meng door pipetteren. Plaats de cellen terug in de incubator (37 ° C) O / N ligand voor behandeling.
   7. Verwijder media zorgvuldig door aspiratie uit cellen en voeg 250 ul vers medium / putje met 0,01-1 uM all-trans retinoïnezuur (RA) als uiteindelijke concentratie of DMSO als vehikel. Incubeer cellen voor 24 - 48 uur.
      OPMERKING: Retinoïnezuur is lichtgevoelig.
6. Bereiding van cellysaten
   1. Verdun 5x Lysis Buffer (1,25 ml 0,5 M Tris pH = 7,8, 1 ml 1 M dithiothreitol (DTT) (in H ₂ O), 10 ml 0,1 M EDTA pH 8,0, 50 ml glycerol, 5 ml Triton X-100, steriel water tot 100 ml) tot 1x gebruik steriel water, voeg 20 pl 1 M DTT / 10 ml en equilibreren tot kamertemperatuur vóór gebruik. Bereid 10 ml van een 48-well plaat op de dag van de assay.
   2. Verwijder media zorgvuldig door aspiratie uit cellen. Spoel cellen eenmaal met 1x PBS. Voeg 200 ul lysisbuffer 1x / putje direct aan de cellen.
   3. Schud gedurende 2 uur bij KT (chemische lysis). Bevries de cellysaten op de plaat bij -80 ° C (mechanische lysis). Lysaten kunnen enkele dagen bewaard bij -80 ° C.
   4. Ontdooi de lysaten. Na volledige ontdooiing overdracht cellysaten een 96-wells plaat met een elektronische multichannel pipet. Overdracht 80 ul van het cellysaat met 96 putjes duidelijke dienblad β-galactosidase assay en 40 pl van het cellysaat een witte plaat op luciferase meting. Vermijd de vorming van eventuele luchtbellen.
7. β-galactosidase Assay
   OPMERKING: beta galactosidase of alternatieve tweede reporters worden gebruikt als een interne controle om rekening niet-specifieke experimentele variaties.
   1. Bereid β-galactosidase substraat buffer: 80,0 g Na ₂ HPO ₄ • 7H ₂ O,3,8 g NaH ₂ PO ₄ • H ₂ O, 30,0 g KCI, 1,0 g _MgSO4 • 7H ₂ O, vul aan tot 1000 ml met steriel water. Pas de pH tot 7,4. Filter Sterilize (0,2 micron) en bewaar bij 4 ° C
   2. Meng 1 ml β-galactosidase substraat buffer met 4 mg ONPG (o-nitrofenyl-β-D-galactosidase). Voeg 3,5 gl 2-Mercaptoethanol (pME) per 1 ml buffer vlak voor gebruik. Voeg 100 ul β-galactosidase substraat buffer 80 pi cellysaat.
   3. Incubeer de reacties bij 37 ° C totdat een lichtgele kleur ontwikkeld. Lees de absorptie bij OD 420 nm op een bord lezer en export van gegevens.
      Opmerking: Het is afhankelijk van de transfectie-efficiëntie, meestal niet langer dan 30 min.
8. luciferase Assay
   1. Bereid 50 ml luciferine substraat reagens: 15,1 mg D-luciferine zout, 82,7 mg ATP zout, 185 mg _MgSO4 • 7H ₂ O, toe te voegen aan 50 ml polypropyleen buis,voeg vervolgens 1,5 ml 1 M HEPES buffer, 48,5 ml ATP gratis water, draaikolk, zorg ervoor dat alle verbindingen op te lossen volledig. Houd 5-10 ml porties bij -80 ° C.
   2. Warm 5 ml luciferine substraat reagens RT alvorens te beginnen. Pipetteer 100 ul substraat-reagens aan elk putje van de witte plaat met 40 pi van het cellysaat en meet de signaal onmiddellijk met een luminescerende teller machine.
   3. Verkrijgen activiteiten uit ten minste drie onafhankelijke experimenten in triplo transfecties.
   4. Bereken eerst de basis genormaliseerde luciferaseactiviteit en base genormaliseerd β-galactosidase waarden voor elk putje door de gemiddelde gemeten waarden voor ongetransfecteerde cellen van elke gemeten waarde. Bereken vervolgens de verhouding van luciferase / β-galactosidase-activiteit.

3. Karakterisering van Enhancer RNA

LET OP: Een meer directe indicator van de versterker activiteit is ontstaan ​​uit de recente genoom-wide studies die veel korte niet-coderende RNA's geïdentificeerd, variërend in grootte van 50 tot 2000 nt, die worden getranscribeerd vanaf versterkers en zogenaamde enhancer RNAs (Ernas) ^16,25,26 (figuur 4). Erna inductie sterk correleert met de inductie van aangrenzende exon coderende genen. Aldus kan signaalafhankelijke enhancer-activiteit in vivo worden gekwantificeerd door vergelijking Erna productie tussen verschillende omstandigheden door RT-qPCR.

1. Richtlijnen voor Primer Design for Erna detectie door RT-qPCR
   1. Selecteer genomische regio's voor Erna metingen die op zijn minst 1,5-2 kb afstand van geannoteerde transcriptie start sites.
      OPMERKING: Belangrijk is, een hoog niveau van mRNA-transcriptie over intragene enhancers voorkomen accurate kwantificering van Erna in de sense oriëntatie, antisense Ernas op intragene enhancers zijn detecteerbaar en zijn vergelijkbaar niveau Ernas bij extragene enhancers.
   2. Als algemene regel, gebruik regio 200 - 1000 bp weerm het midden van de transcriptiefactor bindingsplaats plaats voor primerontwerp hetzij de sense of anti-sense streng (figuur 4 en figuur 6).
      LET OP: Als GRO-seq, DNase-seq, H3K4me1, H3K4me3 of H3K27ac ChIP-seq gegevens beschikbaar zijn van de gewenste soorten en voorwaarden cel kan worden gebruikt voor meer accurate primer design. Ernas getranscribeerd van vermoedelijke enhancer regio's worden gekenmerkt door een hoge mate van H3K4me1 en ME3. Expressie van Ernas positief correleert met de verrijking van actieve versterker histon mark H3K27ac.
   3. Ontwerp PCR primers voor fluorescente kleurstof gebaseerde RT-qPCR meting van Ernas door Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) ²³ Genereer anti-sense sequentie (reverse complement van de sense streng) voor primer design als per: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. Steek 200-300 bp van sense of anti-sense sequentie voor primer design.
2. Meting van Erna transcriptie
   1. Isoleer totaal RNA uit behandelde cellen met commerciële zure fenol / chloroform-extractie gebaseerde Reagens volgens aanbevelingen van de fabrikant.
   2. Gebruik DNaseI geïsoleerde RNA behandelen vóór gebruik ervan in reverse transcriptiereactie. DNase inactiveren volgens de aanbevelingen van de fabrikant voorafgaand aan omgekeerde transcriptie.
   3. Meet RNA-concentratie na DNase I behandeling en gebruik 1000 ng per RT-reactie. Gebruik van hoge kwaliteit reverse transcriptase.
      OPMERKING: talrijke Ernas niet worden gepolyadenyleerde, reverse transcriptie vereist het gebruik van willekeurige primers.
   4. Detecteren reverse getranscribeerd Erna door RT-qPCR met behulp van standaard procedure. Meet een niet-behandeling-afhankelijke mRNA voor normalisatie (bijv, 36B4, PPIA, GAPDH, ACTB).

Results

We gebruikten een pan-specifieke RXR antilichaam om na te gaan genoombrede waarin RA-gereguleerde genen receptor verrijking in hun nabijheid. Bioinformatica analyse van RXR ChIP-seq gegevens van ES-cellen behandeld met retinoïnezuur onthulde verrijking van de nucleaire receptor halve plaats (AGGTCA) onder de RXR bezette plaatsen (Figuur 1). Met behulp van een bio algoritme brachten we weer het motief zoekresultaten helft site om de RXR ChIP-seq data (figuur 2).

Discussion

In de afgelopen jaren hebben vorderingen in de sequencingtechnologie het mogelijk gemaakt om grootschalige voorspellingen van enhancers in vele celtypen en weefsels te doen ^7-9. De hierboven beschreven workflow stelt iemand in staat om een primaire karakterisering uit te voeren van kandidaat-enhancers die zijn gekozen op basis van ChIP-seq-gegevens. De gedetailleerde stappen en opmerkingen zullen iedereen helpen om een routinematige enhancervalidatie in het laboratorium op te zetten.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD DNA polymerase	Merck Millipore	71085-3	voor PCR-amplificatie van enhancer uit gDNA
DNeasy Blood & Tissue kit	Qiagen	69504	voor isolatie van genomisch DNA
QIAquick PCR Purification kit	Qiagen	28106	voor zuivering van PCR-product
Gel extraction kit	Qiagen	28706	voor gelextractie als er meer PCR-producten zijn
HindIII	NEB	R3104L	restrictie-enzym
BamHI	NEB	R3136L	restrictie-enzym
FastAP	Thermo Scientific	EF0651	vrijlating van 5'- en 3'-fosfaatgroepen van DNA
T4 DNA ligase	NEB	M0202	voor ligatie
QIAprep Spin Miniprep kit	Qiagen	27106	voor plasmide-isolatie
DMEM	Gibco	31966-021	ES-medium
FBS	Hyclone	SH30070.03	ES-medium
MEM Non-Essential Amino Acid	Sigma	M7145	ES-medium
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333	ES-medium
Beta Mercaptoethanol	Sigma	M6250	ES-medium
FuGENE HD	Promega	E2311	transfectie reagens
Opti-MEM® I Reduced Serum Medium	Life Technologies	31985-062	voor transfectie
All-trans retinoic acid	Sigma	R2625	ligand, voor activering van RAR/RXR
96-well clear plate	Greiner	655101	voor Beta galactosidase assay
96-well white plate	Greiner	655075	voor Luciferase assay
D-luciferin, potassium salt	Goldbio.com	115144-35-9	voor Luciferase assay
ATP salt	Sigma	A7699-1G	voor Luciferase assay
MgSO4•7H2O	Sigma	230391-25G	voor Luciferase assay
HEPES	Sigma	H3375-25G	voor Luciferase assay
Na2HPO4 •7H2O	Sigma	431478-50G	voor Beta galactosidase assay
NaH2PO4 •H2O	Sigma	S9638-25G	voor Beta galactosidase assay
MgSO4•7H2O	Sigma	230391-25G	voor Beta galactosidase assay
KCl	Sigma	P9541-500G	voor Beta galactosidase assay
ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactosidase)	Sigma	N1127-1G	voor Beta galactosidase assay
TRIzol®	Life Technologies	15596-026	RNA-isolatie
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Life Technologies	4368814	omkering van eRNA
Rnase-free Dnase	Promega	M6101	Dnase-behandeling
SsoFast Eva Green	BioRad	750000105	RT-qPCR mastermix
CFX384 Touch™ Real-Time PCR Detection System	BioRad		qPCR-machine
BioTek Synergy 4 microplate reader	BioTek		luminescentieteller