Scanning Electron Microscopy van Gemacereerde Tissue te visualiseren de extracellulaire matrix

Summary

Hier wordt een methode getoond voor het visualiseren van de ultrastructuur van de extracellulaire matrix in gedecellulariseerde hartweefsels.

Abstract

Fibrose is een onderdeel van alle vormen van hartaandoeningen, ongeacht de etiologie, en hoewel er veel vooruitgang is geboekt op het gebied van cardiale matrixbiologie, zijn er nog steeds grote lacunes met betrekking tot hoe de matrix wordt gevormd, hoe fysiologisch en pathologisch hermodellering verschillen, en het belangrijkste hoe matrixdynamica kan worden gemanipuleerd om genezing te bevorderen en fibrose te remmen. Er is momenteel geen behandelingsoptie voor het beheersen, voorkomen of omkeren van cardiale fibrose. Een deel van de reden is waarschijnlijk de pure complexiteit van de vorming van cardiale littekens, zoals die optreedt na een hartinfarct om dode of stervende cardiomyocyten onmiddellijk te vervangen. De extracellulaire matrix zelf neemt deel aan hermodellering door residente cellen te activeren en ook door infiltrating cellen naar de niet-functionele laesie te leiden. De matrix is ook een soort opslagruimte voor matricellulare eiwitten die cruciaal zijn voor normale matrixomzet, evenals voor fibrotische signalering. De matrix heeft bovendien een elektromechanische rol gespeeld in cardiaal weefsel. De meeste technieken voor het beoordelen van fibrose zijn niet kwalitatief van aard, maar geven eerder kwantitatieve resultaten die nuttig zijn voor het vergelijken van twee groepen, maar die geen informatie geven over de onderliggende matrixstructuur. Hier wordt een techniek belicht voor het visualiseren van de ultrastructuur van de cardiale matrix. Rasterelektronenmicroscopie van decellulair hartweefsel onthult opvallende verschillen in structuur die anders gemist zouden kunnen worden met behulp van traditionele kwantitatieve onderzoeksmethoden.

Introduction

Fibrose verstoort het normale myocardium collageennetwerk, wat cruciaal is voor normale mechanistische functies van cardiomyocyten ^1,2 en ook voor intercellulaire communicatie, intracellulair signaalgedrag en celoverleving ³. De ontwikkeling van fibrose is een belangrijke bepalende factor voor de hartfunctie, en fibrotisch remodelleren van het cardiale interstitium dat voortkomt uit verschillende etiologieën leidt tot verhoogde linksventriculaire stijfheid en diastolische disfunctie ⁴. Myocardfibrose kan ook leiden tot aritmieën, en of de progressie van fibrotisch remodelleren een algemeen of lokaal fenomeen is, het is sterk geassocieerd met een slechte prognose bij patiënten met ischemische en niet-ischemische cardiomyopathie ⁵. Evenzo is de afwezigheid van myocardfibrose een sterke voorspeller van ventrikelfunctionele herstel en langetermijnoverleving ⁶.

Het kenmerk van fibrose is de afzetting van overtollig collageen, dat de treksterkte van staal heeft ⁷ en de cardiomyocytefunctie op meerdere niveaus nadelig kan beïnvloeden. Mechanische krachten die voortkomen uit een overmatig collageenmatrix kunnen leiden tot cardiomyocyteatrofie ^8,9, passieve weefselstijfheid ¹⁰, tonische contractie-geïnduceerde myocardiumstijfheid ^11-13, en verminderde zuurstoftoevoer naar de resterende populatie cardiomyocyten. Gap junction koppeling van cardiomyocyten en myoFbs kan ook de elektrische eigenschappen van het hart beïnvloeden, waardoor een groter risico ontstaat voor de ontwikkeling van aritmieën ^14-16. Perivasculaire fibrose verandert de vasomotorische reactiviteit van intramural coronaire arteriën en arteriolen ¹⁷ en draagt bij aan luminale vernauwing die de zuurstoftoevoer vermindert en dus de overleving van cardiomyocyten ^17-22. Pathogene fibrotische en elektrische remodellering, afkomstig van een initiële site van ischemische schade of energieonbalans, vordert onvermijdelijk naar hartfalen.

Cardiomyocytnecrose initieert het fibrotische antwoord, en daaropvolgende nadelige fibrotische remodellering kan optreden ongeacht de etiologie. Een manier vinden om cardiale fibrose te beheersen zou klinisch gunstig zijn voor de behandeling van ischemische en idiopathische cardiomyopathieën, hypertensieve hartziekte, hypertrofische cardiomyopathie, klephartziekte en dystrofopathieën ^23-42. Ongeacht hoe het fibrotische ziekteproces begint, kunnen oplosbare, profbrotische factoren de interstitiële ruimte passeren en activering van interstitiële en adventitiële fibroblasten op locaties verwijderd van de initiële fibrotische litteken veroorzaken, waardoor een cascade-effect ontstaat dat uiteindelijk tot hartfalen leidt. Het optimale scenario zou zijn om het fibrillogene proces te benutten met behulp van een gerichte therapie die kan worden toegepast tijdens de compensatoire hypertrofische fase van cardiomyopathie voordat deze zich ontwikkelt tot systolisch pompfalen, diastolisch hartfalen of andere eindstadiums. Het uiteindelijke doel zou zijn om fibrose om te keren zodat dode cardiomyocyten kunnen worden vervangen en de hartfunctie volledig kan worden hersteld.

De belangrijkheid van de matrix wordt algemeen begrepen, maar methoden om de matrix te bestuderen zijn voornamelijk beperkt tot kwantitatieve metingen van belangrijke structurele componenten, met name collageen, en relatieve niveaus van verschillende matrix- en matricellulaire eiwitten. Dit protocol benadrukt een zelden gebruikte techniek die nuttig is voor het beoordelen van kwalitatieve verschillen in de cardiale matrix. Deze techniek is onlangs gebruikt om fundamentele verschillen in hartmatrices van verschillende etiologieën van hartziekte (in menselijke explantaten) te vergelijken en te contrasteren, om harten van post-infarct varkens behandeld met de gliale groeifactor (GGF) isofom van neuregulin-1β te onderzoeken, in vergelijking met niet-behandelde dieren ⁴³, en om verschillen in de matrices van cardiale weefsels van mdx muizen (een veel gebruikt dierenmodel van Duchenne Spierdystrofie) op verschillende leeftijden te onderzoeken en te vergelijken met wildtype controles. Deze techniek werd voor het eerst geïntroduceerd door Drs. Caulfield en Borg in 1979 ⁴⁴, maar weinig studies hebben deze krachtige techniek sindsdien toegepast ^45-47, re-geïntroduceerd hier met slechts kleine aanpassingen. Deze methodologie is een waardevol onderzoeksinstrument, omdat het kwalitatieve informatie biedt over ultrastructuur van extracellulair matrix die anders over het hoofd zou kunnen worden gezien wanneer men simpelweg het matrixcomponentgehalte en/of niveau van fibrose meet.

Protocol

Ethiek Verklaring: De protocollen voor de behandeling van dieren werden goedgekeurd door de Vanderbilt Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC, protocollen nummer M / 10/117 (varkens) en M / 10/219 (muizen) en uitgevoerd volgens AAALAC-Internationale normen. het gebruik van opgespaarde menselijk hartweefsel werd goedgekeurd door de Vanderbilt University Medical Center IRB (protocol nummer 100887).

1. Monsterneming en opslag

1. Voeg vers 4% glutaaraldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (PB) oplossing.
   LET OP: Glutaaraldehyde is giftig, draag handschoenen en werken in een zuurkast.
   1. Maak een 0,2 M voorraad oplossing van PB, pH 7,4 met behulp van 21,8 g Na ₂ HPO ₄ en 6,4 g NaH ₂ PO _4. Quantum satis (Qs) tot 1000 ml dH ₂ O.
   2. Voeg 400 ul van 50% glutaaraldehyde tot 2,5 ml PB voorraadoplossing en 2,1 ml dH ₂ O.
2. Dompel een stuk (niet groter dan 2 cm ²⁾ van weefsel in de 4% glutaaraldehyde oplossing. Opmerking: kleinere stukken kunnen ook worden gebruikt, maar van voldoende omvang (niet kleiner dan 5 mm ²⁾ gemakkelijk worden gevisualiseerd door het oog om latere stappen van het protocol te vergemakkelijken moet worden.
3. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, bewaar oneindig bij 4 ° C.

2. Decellularisatie van hartweefsel

1. Voeg verse 10% NaOH waterige oplossing met 10 g NaOH pellets / 100 ml dH ₂ O.
   LET OP: NaOH oplossingen zijn bijtend en kan alkali-brandwonden veroorzaken, draag handschoenen.
2. Spoel weefsel in dH ₂ O.
3. Incubeer in 10% NaOH-oplossing bij kamertemperatuur gedurende 6-10 dagen (tot weefselveranderingen van roodbruine tot gebroken wit of wit).
4. Spoel in dH ₂ O tot weefsel transparant wordt.
5. Dompel weefsel in 1% looizuur gedurende 4 uur bij kamertemperatuur geroerd. Gebruik 1 ml 5% stamoplossing per 4 ml dH ₂ O.
   LET OP: Looizuuris een sterk irriterend, handschoenen dragen.
6. Spoel in dH ₂ O 's nachts.

3. Osmication en uitdroging van hartweefsel (in de zuurkast voor de veiligheid)

1. Voeg een 0,2 M voorraadoplossing van natrium cacodylaatbuffer middels 21,4 g natriumcacodylaat, 10,0 g calciumchloride en 450 ml dH ₂ O. Mix, voeg zoutzuur als nodig om de pH op 7,4. Q tot 500 ml met dH ₂ O.
   LET OP: natriumcacodylaat en zoutzuur zijn giftig, draag handschoenen en werken in een zuurkast.
2. Maak 2% waterige voorraad oplossing van osmiumtetroxide in zuurkast voor de veiligheid door het oplossen van 1 g osmiumtetroxide kristallen in 50 ml dH ₂ O.
   LET OP: osmiumtetroxide is een ernstig gevaar bij inademing; damp fixatie van slijmvliezen of oogbollen mogelijk is, vandaar behandelen alleen in de zuurkast met handschoenen. Een spatscherm wordt aanbevolen.
3. Spoel weefsel in 0,1 M natriumcacodylaat buffer (mix voorraad oplossing 1: 1 met dH _{2 O) gedurende 5 minuten op rotator (of zacht schudden).}
4. Herhaal vorige stap tweemaal voor een totaal van drie spoelingen buffer.
5. Dompel weefsel in 1% osmiumtetroxide in 0,1 M natriumcacodylaat buffer (mix stock natriumcacodylaat en stock osmiumtetroxide 1: 1) op rotator gedurende 1 uur.
6. Spoel weefsel in 0,1 M natriumcacodylaat buffer 3 keer per rotator op 5 min.
7. Spoel weefsel met behulp van toenemende concentraties aan ethanol (30%, 50%, 75%, 85%, 95%, en tenslotte 100%) gedurende 15 min op elke rotator.

4. Dwarsdoorsnede Oppervlaktebehandeling voor SEM

1. Transfer weefsel in 100% ethanol tot een ondiepe petrischaal ook met 100% ethanol.
2. Houd twee scherpe scheermesjes zodat de vlakke zijden van de zijden in contact met elkaar en de snijranden kruis twee zijden van een gelijkzijdige driehoek boven het monster te vormen. Om dit te bereiken, gebruiken de linkerhand een mes te plaatsen aan de rechterkant van het monster encut naar links. Op hetzelfde moment, met de rechterhand op het tweede mes te plaatsen op de uiterst links van het monster en slice naar rechts. Zo zal de lamellen worden geschoven tegen elkaar uit tegengestelde richting een gladde snede te maken.
3. Schuif de platte zijkanten tegen elkaar om een ​​zeer zuivere snede van het monster met minimale vervorming of scheuren kracht te maken, bij voorkeur zo groot mogelijk oppervlak bloot mogelijk zonder beschadiging van het monster.
4. Herhaal dit voor elk monster aan de schoonst mogelijke dwarsdoorsnede oppervlakken bloot te leggen voor het onderzoek in de SEM.

5. Critical Point Drogen (CPD) van hartweefsel

1. Gebruik een spatel of pincet om weefsel te dragen aan de monsterhouder van het kritische punt droger (CPD), zodat weefsel blijft 100% ethanol te allen tijde. Opdat de houder wordt ondergedompeld in ethanol en dat de overdracht voltooid met het weefsel blootgesteld aan lucht niet langer dan enkele seconden.
2. Bedien CPD per onshandleiding er zo op 3 purge-and-fill volledige cycli om ethanol te vervangen door vloeibare kooldioxide.
3. Bedien CPD per gebruikershandleiding om kritisch punt drogen van de monsters te bereiken en breng ze terug naar de atmosferische druk met gecontroleerde ontluchting van CO _2.

6. Montage van het Hart van weefselmonsters voor SEM

1. Bereid een SEM monster stub voor elk monster, door het hechten van een tab koolstofkleefband op het bovenoppervlak van de aluminium strook.
2. Met behulp van een stereomicroscoop, zorgvuldig houden het monster dat u de sticker met de doorsnede oppervlak van belang naar boven (weg van het tabblad, zichtbaar), en zo dicht mogelijk bij de parallel met het vlak van het monster stomp oppervlak. Niet sonde en raak het oppervlak van belang.
3. Breek een houten applicator stok om een ​​taps toelopende borstel, ideaal voor het aanbrengen van verf te bereiken. Solliciteer zilver of carbon verf op de bodem en zijkanten van het monster, om de naleving van de stomp te verbeteren.
4. Breiden een zeer dunne lijn van zilver of koolstof verf tot een rand van het oppervlak plaats, een lading weg van het oppervlak van belang aarding.
5. Toepassen 2 of 3 kleine dabs zilver of koolstof verf rond de omtrek van de lip koolstof, een geleidend pad van de tab kooloppervlak de metalen strook en aldus naar aarde.
6. Met geleidende verf drogen gedurende twee uur.
7. Bedien sputter coater per gebruikershandleiding om een ​​relatief zware coating (doelbereik van 30 - 40 nm) van toepassing zijn van goud-palladium legering of goud. Pomp specimen kamer tot ongeveer 0,1 mbar; Timer instellen op 40 sec. Open Set klep op de 8:00 positie (matig Argon gas flow). Druk op Start om sputter coating starten bij 30 mA. Paarse gloed lozing moet zichtbaar zijn in het monster kamer zijn.

7. SEM onderzoek van Hart weefselmonsters

1. Voer aftastelektronenmicroscopie bij relatief lage versnellingsspanning beeldvormende p minimaliserenroblemen geassocieerd met een slechte lading dissipatie in de steekproef (opladen). Suggereerde aanvankelijk imaging aandoening zijn: 5 kV versnellende voltage, 10 mm werkafstand.
2. Met de hulp van een ervaren operator, in dienst verhoogd werkafstand om de scherptediepte te breiden in de beeldvorming als voorwaarde stellen dat de focus van de vezels in meerdere focale vliegtuigen, of vezels die zich uitstrekt voor aanzienlijke lengte in de z-dimensie.
   1. Voor de microscoop die hier gebruikt (zie tabel of Materials), bij de toegang gebruikersinterface de tab-navigatie rechtsboven.
   2. Open het tabblad Coördinaten uit het werkgebied menu. Om werkafstand te verhogen, voert u een grotere waarde in millimeters voor de Z-coördinaat dan klikt u op Ga naar het tabblad om het monster etappe naar de ingevoerde werkafstand.
3. Met behulp van een ervaren operator, gebruik model draaipunt en het oppervlak van belang orthogonaal positioneren de elektronenbundel. Extra helling van 10 tot 30 grees vanuit deze positie kunnen observatie en documentatie van de matrix structuur te verbeteren.
   1. Voor de microscoop die hier gebruikt (zie tabel of Materials), in de gebruikersinterface, klik en houd de rechter muisknop en schuif naar links of rechts om het monster in de buurt van de periferie van het voorbereide oppervlak vlak van belang richten, wijzend op de gerichte werkafstand .
   2. Navigeren met de Manual User Interface joystick om te bewegen in de buurt van de tegenoverliggende rand van het oppervlak en herhaal focus. Als werkafstand is ongeveer gelijk aan de eerste positie, tilt specimen bij benadering akkoord op beide locaties via het tabblad Coördinaten van het werkgebied menu (zie 7.2) en voer een tilt waarde in de T-coördinaat te bereiken.
   3. Draai specimen negentig graden (in te voeren waarde in R Coördineren veld) en herhaal het proces totdat alle posities zijn gericht op ongeveer dezelfde werkafstand.
      Opmerking: Variabele druk SEM kunnen worden toegepast om lading dissipatie verbeterenindien beschikbaar. Hoog vacuüm is de standaard modus voor het scannen elektronenmicroscopie.

Results

De gemarkeerde techniek werd toegepast op hartweefsel van een ongebruikte menselijk hart transplantatie donor (figuur 1), geëxplanteerde weefsels transplantatie ontvangers, harten van wildtype en dystrofische muizen (figuur 3), en in post-myocardiaal infarct hart monsters van een varkens model van het hart schade (figuur 2). Zoals getoond in figuur 1, de menselijke cardiale matrix een ingewikkelde weefsel verknoopt eiwit...

Discussion

Dwarsdoorsnede voorbereiding van het oppervlak is de meest kritische fase in het protocol. Om fijne structuur te behouden, moeten gedroogde exemplaren in 100% ethanol blijven te allen tijde tot ingevoerd om het kritische punt droogproces. Daarom is het snijden van de monsters te bereiken oppervlakken voor EM-onderzoek moet worden gedaan, terwijl monsters worden ondergedompeld in ethanol in een ondiepe schaal. Het is ook belangrijk dat het blootgestelde oppervlak niet wordt aangeraakt of geprobed tijdens daaropvolgende b...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium Chloride	Electron Microscopy Sciences	12340	100 g
Carbon Adhesive	Electron Microscopy Sciences	12664	30 g
Carbon Adhesive Tabs	Electron Microscopy Sciences	77825	order to fit stubs
Double Edge Razor Blades Stainless Steel	Ted Pella, Inc	121-6	250/pkg
Ethanol	Electron Microscopy Sciences	15055	450 ml
Gluteraldehyde, 50% Solution	Electron Microscopy Sciences	16310	EM grade, distillation purified
Hydrochloric Acid	Electron Microscopy Sciences	16760 of 16770	100 ml
Monosodium Phosphate NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9251-250G	250 g
Osmium Tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19100	1 g
Silver Conductive Adhesive	Electron Microscopy Sciences	12686-15	15 g
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045-1KG	1 kg
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S3264-500G	500 g
Tannic Acid, 5% Aqueous	Electron Microscopy Sciences	21702-5	500 ml
Trihydrate Sodium Cacodylate	Electron Microscopy Sciences	12300	100 g
Gold-palladium Alloy or Gold	Refining Systems, Inc.	varies	specific to the sputter coater make and model
Critical Point Dryer	Electron Microscopy Sciences	850
Plain Wooden Applicators	Fisher Scientific	23-400-102
Quanta 250 Environmental SEM	FEI	Q250 SEM
Sputter Coater	Cressington Scientific Instruments Ltd.	Model 108
Alluminum SEM Sample Stubs	Electron Microscopy Sciences	75220-12	specific to the miscroscope