Method Article

Multicolor Fluorescentie detectie voor Droplet Microfluidics Met behulp van optische vezels

DOI:

10.3791/54010

⸱

May 5th, 2016

 ,  , 
1Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California, San Francisco, 2Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meerkleurige fluorescentiedetectie in druppelmicrofluidica omvat doorgaans omvangrijke en complexe detectiesystemen op basis van epifluorescentiemicroscopen. Hier beschrijven we een compact en modulair meerkleurig detectieschema dat gebruikmaakt van een reeks optische vezels om meerkleurige gegevens die door een enkele fotodetector worden verzameld, tijdelijk te coderen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescentiemetingen zijn de meest gebruikte meetmethoden in druppelmicrofluidica vanwege hun heldere signalen en snelle tijdsrespons. Toepassingen zoals multiplex-metingen, enzym-evolutie en moleculair biologische celsortering vereisen de detectie van twee of meer kleuren fluorescentie. Standaard meerkleurdetectiesystemen die vrije ruimtelasers koppelen aan epifluorescentiemicroscopen zijn omvangrijk, duur en moeilijk te onderhouden. In dit artikel beschrijven we een schema om meerkleurdetectie uit te voeren door discrete gebieden van een microfluïdische kanaal te exciteren met lasers gekoppeld aan optische vezels. Uitgezonden licht wordt verzameld door een optische vezel gekoppeld aan een enkele fotodetector. Omdat de excitatie op verschillende ruimtelijke locaties plaatsvindt, kan de identiteit van het uitgezonden licht worden gecodeerd als een temporele verschuiving, waardoor de noodzaak voor meer gecompliceerde lichtfilteringsschema's wordt geëlimineerd. Het systeem is gebruikt om druppelpopulaties met vier unieke combinaties van kleurstoffen te detecteren en om sub-nanomolare concentraties van fluoresceïne te detecteren.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Droplet microfluidics een platform voor high throughput biologie door compartimentering van experimenten in een groot aantal van de waterige druppeltjes gesuspendeerd in een drager olie 1. Druppeltjes zijn gebruikt voor toepassingen die variëren van eencellige analyse 2, digitale polymerasekettingreactie (PCR) 3, en enzym evolutie 4. Fluorescerende assays zijn de standaard manier van detectie voor druppel microfluidics, als hun heldere signalen en een snelle time respons verenigbaar is met het opsporen van sub-nanoliter druppel volumes bij kilohertz tarieven zijn. Veel toepassingen vereisen fluorescentiedetectie ten minste twee kleuren simultaan. Zo ons lab voert gewoonlijk PCR-geactiveerde sortering druppel experimenten die detectiekanaal gebruiken voor het resultaat van een test, en gebruikt een secundaire achtergrond kleurstof assay-negatieve druppeltje telbare 5 maken.

Typische detectie stations voor druppel microfluidics zijn based op epifluorescentie microscopen, en vereisen ingewikkelde licht manipulaties's om excitatielicht introduceren van vrije ruimte lasers in microscoop te worden gericht op het monster. Nadat fluorescentie wordt uitgezonden van een druppel, wordt het uitgezonden fluoresceerden licht gefilterd zodat elk detectie-kanaal maakt gebruik van een fotomultiplicatorbuis (PMT) gecentreerd op een golflengte band. Epifluorescentie-microscoop gebaseerde optische detectie systemen een toetredingsdrempel als gevolg van hun kosten, complexiteit en benodigde onderhoud. Optische vezels zorgen voor de middelen om een ​​vereenvoudigde en robuuste detectie systeem te bouwen, omdat vezels handmatig in microfluïdische apparaten kunnen worden geplaatst, waardoor de noodzaak voor-spiegel op basis van licht routing, en waardoor het licht paden te worden gekoppeld met behulp van optische vezel connectoren.

In dit artikel beschrijven we de assemblage en validatie van een compact en modulair systeem ter multicolor fluorescentiedetectie te voeren door gebruik te maken van een reeks van optische vezels eenda enkele fotodetector 6. Optische vezels zijn gekoppeld met individuele lasers en worden normaal opgenomen om een ​​L vormig stroomkanaal regelmatige ruimtelijke offsets. Een fluorescentie verzameling vezel wordt evenwijdig aan de excitatie regio en is verbonden met een PMT. Omdat een druppel passeert de laserstralen op verschillende tijdstippen, gegevens die door de PMT toont een tijdelijke offset waarmee de gebruiker onderscheid te maken tussen de uitgezonden nadat de druppel wordt opgewekt door elke afzonderlijke laserbundel fluorescentie. Deze tijdelijke verschuiving elimineert de noodzaak om uitgezonden licht te scheiden om afzonderlijke PMT's met behulp van een reeks dichroïsche spiegels en banddoorlaatfilters. Om de effectiviteit van de detector te valideren, kwantificeren we fluorescentie druppeltjes populaties inkapselen van kleurstoffen van verschillende kleuren en concentratie. De gevoeligheid van het systeem werd onderzocht voor een kleur fluoresceïne detectie en geeft de mogelijkheid tot druppeltjes met concentraties beneden detecteren 0,1 nM, een 200x gevoeligheid vertovement vergeleken met recente vezel gebaseerde benaderingen in de literatuur 7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. SU8 Master Fabrication

  1. Ontwerp de microfluïdische structuren voor drie lagen fabricage met behulp van design software en hebben de ontwerpen gedrukt door een verkoper aan printplaat film met 10 micrometer resolutie. De details van apparaatontwerp worden gegeven in een aangrenzende referentie 6 en het kanaal geometrieën zijn weergegeven in figuur 1. De lagen moeten omvatten uitlijnmerktekens om legeren features uit elke fabricage laag 8.
  2. Plaats een pre-gereinigde 3 inch diameter silicium wafer op een spin coater en zet de stofzuiger om het aan te brengen op de boorkop. Breng 1 ml SU8-3050 in het midden van de wafel en centrifugeren gedurende 20 sec bij 500 tpm, vervolgens 30 sec bij 1750 rpm, die een laagdikte van 80 pm.
  3. Verwijder de wafer en bakken op 135 ° C verwarmingsplaat gedurende 30 min. Laat de wafer afkoelen tot kamertemperatuur alvorens naar de volgende stap.
  4. Expose de gecoate wafer aan de 1 ste laag masker onder een gecollimeerde 190 mW, 365 nm LED voor 3 minuten. Na de belichting, plaatst u de wafer op een 135 ° C kookplaat gedurende 1 minuut, daarna afkoelen tot kamertemperatuur voordat u verder gaat met de volgende stap.
  5. Plaats de wafer op de spin coater en zet de stofzuiger om het aan te brengen op de boorkop. Breng 1 ml SU8-3050 in het midden van de wafel en centrifugeren gedurende 20 sec bij 500 tpm, vervolgens 30 sec bij 5000 rpm, wat resulteert in een laag die een extra dikte van 40 urn verschaft.
  6. Verwijder de wafer en bakken op een 135 ° C kookplaat gedurende 30 minuten, daarna afkoelen tot kamertemperatuur voordat u naar de volgende stap.
  7. Lijn de 2 e laagmasker op de geometrie patroon in 1.3 en bloot de gecoate wafer aan een gecollimeerde 190 mW, 365 nm LED voor 3 min. Na blootstelling, te plaatsen op een 135 ° C kookplaat gedurende 4 min 30 sec, daarna afkoelen tot kamertemperatuur voordat u verder gaat met de volgende stap.
  8. Plaats de wafer op de spin coater en zet de stofzuiger om het aan te brengen op de boorkop. Breng 1 ml SU8-3050 in het midden van de wafel en centrifugeren gedurende 20 sec bij 500 tpm, vervolgens 30sec bij 1000 rpm, wat resulteert in een laag die een extra dikte van 100 urn verschaft.
  9. Verwijder de wafer en bakken op een 135 ° C kookplaat gedurende 30 minuten, daarna afkoelen tot kamertemperatuur voordat u naar de volgende stap.
  10. Lijn de 3 e laagmasker op de geometrie patroon in 1.3 en bloot de gecoate wafer aan een gecollimeerde 190 mW, 365 nm LED voor 3 min. Na blootstelling, te plaatsen op een 135 ° C kookplaat 9 min, daarna afkoelen tot kamertemperatuur voordat u verder gaat met de volgende stap.
  11. Ontwikkeling van de maskers door onderdompeling in een geroerd bad van propyleenglycolmonomethyletheracetaat gedurende 30 min. Was de wafer in isopropanol en bakken op 135 ° C gedurende 1 min kookplaat. Plaats de ontwikkelde meester in een 100 mm petrischaal voor polydimethylsiloxaan (PDMS) gieten.

2. PDMS Device Fabrication

  1. Bereid 10: 1 PDMS door het combineren van 50 g siliconen basis met 5 g hardingsmiddel in een plastic beker. De inhoud met een draaiend gereedschap uitgerust met een roerstokje. degterwijl het mengsel in een exsiccator gedurende 30 minuten of totdat alle luchtbellen worden verwijderd.
  2. Giet de PDMS tot een dikte van 3 mm over de master te geven en plaats terug in de exsiccator voor verdere ontgassen. Zodra alle luchtbellen worden verwijderd bak de inrichting bij 80 ° C gedurende 80 min.
  3. Snijd het apparaat uit de mal met behulp van een scalpel en leg ze op een schone ondergrond met de patroon naar boven en pons de vloeibare in- en uitlaten met een 0,75 mm biopsie punch. Het apparaat moet worden gesneden zodat de 120 urn en 220 urn lang geometrieën zijn vanaf de zijkant van het apparaat.
  4. Plasma behandelen apparaat, met kenmerk naar boven, samen met een voorgereinigde 2 inch bij 3 inch glasplaatje bij 1 mbar O2 plasma gedurende 20 seconden in een 300 W plasma cleaner. Bond de PDMS inrichting door het plaatsen van het patroon van het PDMS apparaat op de met plasma behandelde zijde van het glaasje. Plaats het apparaat in een 80 ° C oven en bak de samengestelde inrichting voor 40 min.
  5. Render de kanalenhydrofobe via een injectiespuit aan het apparaat met een gefluoreerde oppervlakte behandelingsvloeistof spoelen. Onmiddellijk bak de inrichting bij 80 ° C gedurende 10 minuten om het oplosmiddel te verdampen.

3. Voorbereiding van optische componenten

  1. Bereid de laser excitatie vezel door het verwijderen van de isolatie van de laatste 5 mm van een 105 micrometer kern, 125 urn bekleding, NA = 0,22 optische vezel.
  2. Bereid de 2 e kleuren laser excitatie vezel door het herhalen van 3.1 voor een 2e identieke vezels.
  3. Bereid de vezel voor het verzamelen van de fluorescentie-signaal door het herhalen van 3.1 voor een 200 urn kern, 225 urn bekleding, NA = 0,39 optische vezel.
  4. Inspecteer de uiteinden van de vezels - als de tips niet eindigen in een plat vlak, re-klieven de uiteinden met een vezel schrijver.
  5. Bevestig een laser vezel koppelaar een 50 mW, 405 nm laser en bevestig één van de 105 urn kernvezels de laser. Richt de gestripte uiteinde op de sensor van het laservermogenmeter, en gebruik maken van de fijnafstelling van de laser koppeling naar het laservermogen te maximaliseren.
  6. Herhaal 3,5 voor een 50 mW, 473 nm laser.
  7. Monteer een 446/510/581/703 nm quad banddoorlaatfilters op de PMT gebruik lens buizen laserlicht te blokkeren en te verzenden uitgezonden fluorescentie. Bevestig fiber koppeling zodat het licht reist door de filters alvorens naar de PMT.
  8. Bevestig de vezel van 3,3 tot het apparaat geassembleerd in 3.7.

4. Offline Mixed Emulsion Generation

  1. Het verkrijgen van een stroom aandacht microfluidics dropmaker apparaat met een 60 micrometer x 60 micrometer opening.
  2. Vul een 1 ml spuit met HFE 7500 olie met 2% ionische fluorsurfactans 9.
  3. Vul een reeks van 1 ml injectiespuiten met de volgende combinaties van fluoresceïne (FITC) en dextran-geconjugeerde blauwe kleurstoffen (CB) in PBS: 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nM CB en 10 nM FITC / 100 nM CB.
  4. Monteer de dropmaker apparaat op het podium van een omgekeerde micro'sgaan en de waterige en olie spuiten op spuitpompen. Stel de spuiten om de apparaten met PE-2 buizen.
  5. Running spuitpompen 500 ul / uur voor de olie- en 250 ul / uur voor het waterige oplossingen, creëren een mengsel van 80 urn druppeltjes met de oplossingen van 4,3. Voor elk type waterige monster, gebruik dan een frisse dropmaker apparaat om kruisbesmetting te voorkomen. Verzamel ~ 200 ul emulsie van elke kleurstofcombinatie in een lege injectiespuit.
  6. Na de 4 druppels types zijn verzameld in een enkele verzameling spuit, meng de emulsie door herhaaldelijk draaien van de spuit.
  7. Herhaal stap 4,2-4,6 met waterige oplossingen die 0,1, 1, 10 en 100 nM FITC in PBS.

5. Optical Fiber Insertion

  1. Plaats de microfluïdische chip vervaardigd in stap 2 op het podium van een omgekeerde microscoop gekoppeld aan een digitale camera die in staat <100 psec sluitersnelheden.
  2. aandachtig werken vanaf de zijkant, insert de vezel gekoppeld aan de 473 nm laser in de verste stroomopwaartse 120 um kanaal, zorg niet om door te prikken aan de hoofdstroom kanaal.
  3. Steek de vezel gekoppeld aan de 405 nm laser in de verste stroomafwaartse 120 micrometer hoog zijkanaal, waardoor vezels tussenruimte van 300 micrometer.
  4. Plaats de PMT-gekoppelde vezel in de 220 urn lang kanaal loodrecht op de twee laser excitatie vezels.

6. Fluorescentie Detectie van Mixed emulsies

  1. Monteer een 5 ml injectiespuit gevuld met HFE 7500 met 2% ionische fluorsurfactant de afstandhouder olie inlaat van de detectie-inrichting met PE-2 buizen.
  2. Monteer de spuit met de gemengde FITC / CB-emulsie op een verticaal georiënteerd spuit pomp en koppel om het apparaat druppel herinjectie inlaat met behulp van PE-2 buizen. Sluit een lengte van PE-2 buizen van de afrit apparaat naar een afvalcontainer.
  3. Vul het apparaat door het uitvoeren van elk van de pompen bij 1000 ul / uur totdat beideolie druppeltjes worden gezien regelmatig worden gecombineerd in de inrichting en stroomt stroomafwaarts.
  4. Regel het debiet zodanig dat de afstandhouder olie draait op 6000 pl / uur en de druppels bij 100 pl / uur, wat een aanzienlijke afstand tussen druppeltjes reizen door de detectie regio.
  5. Zet de lasers, start het data-acquisitie programma, en pas de PMT winst voor signalen die meer dan 100x de basislijn lawaai verdieping zijn voorzien. Stel het laservermogen zodat alle doublet pieken zijn duidelijk zichtbaar op één lineair geschaald timetrace.
  6. Verwerven van 60 sec van het PMT voltage timetrace op tenminste 20 kHz. Importeer de gegevens in de computer programma zoals Matlab en meet de hoogtes van de pieken van de opgenomen doubletten met behulp van het programma aangepast computergebruik script.
    LET OP: Deze wordt verstrekt als aanvullende informatie.
  7. Herhaal stap 6,2-6,7 met behulp van de FITC-only gemengde emulsie gemaakt in 4.7, met de 405 nm laser uitgeschakeld.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vervaardiging van een PDMS apparaat waarmee het inbrengen van optische vezels vereist een meerstaps fotolithografie procedure kanalen van variërende lengte (figuur 1) te maken. Eerst wordt een 80 urn groot laag van SU-8 gesponnen op een siliciumwafel gevormd en met behulp van een masker om de fluïdumverwerking geometrie. Vervolgens wordt een additionele 40 um laag van SU-8 gesponnen op de wafel en gevormd met behulp van een tweede masker om functies 120 urn lang laserfib...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glasvezel detectie vereist de aanpassing van de optische vezels met betrekking tot vloeistof kanalen. Omdat onze apparaat maakt gebruik van gidskanalen gefabriceerd met multilayer fotolithografie, plaatsing van maskers met ten opzichte van elkaar is van groot belang. Indien de vezel geleidingskanalen te dicht bij het vloeistofkanaal, is er een risico van lekkage; als de gids kanalen bevinden zich te ver weg of niet goed uitgelijnd, kan de fluorescentie signaal verzameld door de detectie vezel aanzienlijk worden verminde...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door DARPA-subsidienummer 84389.01.44908, een NSF CAREER-prijs (DBI-1253293), een NIH verkennend/ontwikkelingsonderzoekssubsidie (CA195709) en NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01), en een New Directions-subsidie van het UCSF-middelenallocatieprogramma.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PhotomasksCadArt Servcies
3" silicon wafers, P type, virgin test gradeUniversity Wafers447
SU-8 3035MicrochemY311074
SU-8 2050MicrochemY111072
Sylgard 184 silicone elastomer kitKrayden4019862
1 ml syringesBD309628
10 ml syringesBD309604
27 gaugue needlesBD305109
PE 2 polyethylene tubingScientific Commodities, Inc.B31695-PE/2
Novec 7500Fisher Scientific98-0212-2928-5Commonly knowns as HFE 7500
Ionic Krytox SurfactantSynthesis instructions in ref #10
Dextran-conjugated cascade blue dyeLife TechnologiesD-1976
Fluorescein sodium saltSigma28803
Quad bandpass filterSemrockFF01-446/510/581/703-25
PMTThorlabsPMM02
Fiber portThorlabsPAFA-X-4-A
lens tubeThorlabsSM1L05
Patch cable with 200 μm core / 225 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connectorThorlabsCustom
Patch cable with 105 μm core / 125 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connectorThorlabsCustom
125 μm fiber stripping toolThorlabsT08S13
225 μm fiber stripping toolThorlabsT10S13
laser fiber adapterOptoEngineFC/PC Adapter
405 nm CW laser at 50 mWOptoEngineMDL-III-405Distributor for CNI lasers
473 nm CW laser at 50 mWOptoEngineMLL-FN-473-50

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
  2. Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).
  3. Hindson, B. J., Ness, K. D. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).
  4. Agresti, J. J., Antipov, E. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (14), 4004(2010).
  5. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR. PLOS ONE. 8 (4), (2013).
  6. Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics. Lab Chip. 15 (13), 2754-2758 (2015).
  7. Guo, F., Lapsley, M. I. A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis. Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).
  8. Lithography. , Available from: https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html (2015).
  9. DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants. Anal Chem. 85 (21), (2013).
  10. Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab Chip. 12, 882(2012).
  11. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops. Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).
  12. Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer. Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).
  13. Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis. Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).
  14. Martinez Vazquez, R., Osellame, R. Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides. Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).
  15. Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching. Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Droplet MicrofluidicsFluorescence DetectionOptical FibersMulticolor DetectionLaser ExcitationPhotodetector SystemMicrofluidic ChipFiber CouplingFluorescein DetectionHydrophobic Channels

Related Articles