Hier wordt een protocol te oogsten, te onderhouden en te behandelen muis dunne darm organoids met pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) en Listeria monocytogenes beschreven, alsmede nadruk op genexpressie en correcte normalisatie technieken voor eiwit.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Primaire intestinale organoids zijn een waardevol modelsysteem dat het potentieel heeft om een aanzienlijke invloed op het gebied van mucosale immunologie heeft. Echter, de complexiteit van de organoïde groei kenmerken dragen belangrijke kanttekeningen voor de onderzoeker. Met name de groeipatronen van elke afzonderlijke organoïde zijn zeer variabel en een heterogene populatie van epitheliale cellen in kweek. Met dergelijke restricties gemeenschappelijke weefselkweek praktijk niet zonder meer toegepast op de organoïde systeem vanwege de complexiteit van de celstructuur. Tellen en plating uitsluitend op basis van aantal cellen, hetgeen normaal is voor individueel gescheiden cellen, zoals cellijnen, geen betrouwbare methode om organoids tenzij een normalisering techniek toegepast. Normaliseren van het totale eiwitgehalte is complexer geworden als gevolg van de bewoner eiwit matrix. Deze kenmerken in termen van het aantal cellen, vorm en celtype moet rekening worden gehouden bij de evaluatie van uitgescheiden contenten uit de organoïde massa. Dit protocol is gegenereerd om een eenvoudige procedure te schetsen om de cultuur en de behandeling van de dunne darm organoids met microbiële pathogenen en pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs). Het benadrukt ook de normalisatie technieken die moeten worden toegepast bij eiwitanalyse worden uitgevoerd na een dergelijke uitdaging.
Inleiding
Het vermogen om te oogsten en cultuur primaire organoids zijn beschreven voor dunne darm, colon, pancreas, lever en hersenen en zijn spannende ontwikkelingen relevant voor het begrip van een fysiologisch representatieve verschijnselen weefselbiologie 1-5. De eerste methode beschrijft de cultuur en het onderhoud van de dunne darm organoids werd gemeld door Sato et al. Uit het lab van Hans Clevers 1. Voorafgaand aan deze methode, oogsten en kweek van primaire darmepitheelcellen bleek beperkt en ineffectief ondersteunen epitheliale celgroei. Werkwijzen onder dissociatie van weefsel via incubatie met enzymen, zoals collagenase en dispase, d....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Al het onderzoek werd goedgekeurd en uitgevoerd onder Virginia Tech IACUC richtlijnen
1. Bereid R-Spondin1 geconditioneerde media Van HEK293T-Rspo1 Cell Line
- HEK293T-productie van Rspondin1 cellen is eerder beschreven 10. Zaad HEK293T-Rspondin1 uitscheidende cellen 5-10% confluentie van ongeveer 8 x 10 5 -1,7 x 10 6 cellen in een T-175 kolf met 40 ml 1 x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% foetaal runderserum ( FBS) als groeimedia, en incuberen bij 37 ° C + 5% CO2.
LET OP: De groei media voor de HEK293T-Rspondin1 afscheidende cellen zullen als R-spondin1 geconditioneerde media dienen.....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Wanneer na dit protocol om intestinale organoids te cultiveren, zal karakteristieke bolvormige organoids aanwezig na het oogsten zijn. De toevoeging van R-spondin1 geconditioneerde media dag wordt de groei en ontluiken van de organoids initiëren. De groei van organoids wordt getoond in Figuur 1A - F en representeert intestinale organoids op dagen 1, 2, 4, 5, 6 en dag 14. Figuur 1F geeft de niet-homogene groeikenmerken va.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De cultuur en onderhoud van intestinale organoids is een procedure die kan worden beheerst door een persoon met voldoende weefselkweek. Er zijn nuances in passages in vergelijking met groeiende cellen in een meer conventionele monolaag, maar deze subtiele niet moeilijk te overwinnen. De kritische stappen van deze werkwijze omvatten de mogelijkheid om de organoids groeien tot een voldoende hoge dichtheid voor optimale zaaien. Experimenten Er moet worden opgeschaald organoids zo groot seeding dichtheden die vaak kan worde.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Dr. Sheryl Coutermarsh-Ott, Dylan McDaniel en Bettina Heid bedanken voor technische discussies. De auteurs danken Dr. Nanda Nanthakumar voor het verstrekken van de Caco-2 cellen. De auteurs danken ook het Multicultural Academic Opportunities Program (MAOP) aan Virginia Tech. Dit werk werd ondersteund door de National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Award K01DK092355 (aan I.C.A.). De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11050 | (Section 1,3,6) Of equivalente merk |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo | (Section 1,3) | |
| DMEM | GE Healthcare | Sh30243.01 | (Section 1,6) Voor Caco-2 en HEK293 Rspondin1 cellen |
| HEK293T-Rspondin1 secreting cell line | (Section 1) Beschreven en gemodificeerd van Kim, K.A. et al. Lentivirale deeltjes bevatten RSPO1(NM_138683) ORF cDNA gekloond in een pReceiver-Lv105 backbone op maat besteld en gekocht bij GeneCopoeia. | ||
| 50 ml conische buis | Falcon | 352070 | (Section 1) Of equivalente merk |
| T-175 Flessen | Corning | 431079 | (Section 1) Of equivalente merk |
| Protein Matrix | Corning | 356231 | (Section 2,3,4,5,6) Matrigel Growth Factor Reduced |
| HyClone Dulbecco's (DPBS) | GE Healthcare | SH30264.01 | (Section 2,3) |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | (Section 2,3) Advanced DMEM/F12 |
| Corning 24 Well TC Plates | Corning | 3524 | (Section 2) |
| N2 Supplement 100x | Life Technologies | 17502-048 | (Section 2) |
| B27 without vitamin A 50x | Life Technologies | 12587-010 | (Section 2) |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | (Section 2) |
| Glutamine Supplement (Glutamax) | Life Technologies | 35050-061 | (Section 2) Kan combineren met Advanced DMEM/ F12 |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-080 | (Section 2) Kan combineren met Advanced DMEM/ F12 |
| 10ml Serologische Pipet | Falcon | 357551 | (Section 2) Of equivalente merk |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | (Section 2) Stock = 100 mg/ml |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | (Section 2) Stock = 1M |
| Recombinant Mouse EGF | Biolegend | 585608 | (Section 2) Stock = 500 mg/ml |
| Rocker Variable | Bioexpres | (Section 3) | |
| dissectie schaar | (Section 3) | ||
| pincet | (Section 3) | ||
| glasplaatjes | (Section 3) | ||
| dissectie pincet | (Section 3) | ||
| 25 ml Serologische Pipet | Falcon | (Section 3) | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | SLBB9821 | (Section 3) 0.5M of alternatieve TC grade EDTA |
| Steriele Petri Schaal 100mm x 15mm | Fisher | FB0875712 | (Section 3) Of gelijke grootte TC schaal |
| 1ml Spuit | Becton Dickinson | 309659 | (Section 4) |
| Precision Glide Naald | Becton Dickinson | 305120 | (Section 4) 23G x 1 1/4 (0.6mm x 30mm) |
| Flagellin van Bacillus subtilis | Invivogen | tlrl-bsfla | (Section 5,6) |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 19115 | (Section 5,6) (Murray et al.) |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | (Section 5,6)Of equivalente merk |
| BBL Brain Heart Infusion Agar | Becton Dickinson | 211065 | (Section 5) |
| Bacto Brain Heart Infusion | Becton Dickinson | 237500 | (Section 5) |
| Caco-2 | ATCC | HTB-37 | (Section 6) |
| Trypsin | gibco | 25200056 | (section 6) |
| Methanol | Fisher | A412-4 | (Section 6) |
| SpectraMax M5 | Molecuar Devices | (Section 6) | |
| 96 Well Assay Plate | Corning | 3603 | (Section 6) Zwarte Plaat, Heldere Bodem TC behandeld |
| Nuclear Staining Dye | Life Technologies | H1399 | (section 6) Hoechst 33342 |
| T-75 Flessen | Corning | 430641 | (Section 6) Of equivalente merk |
| 15 ml conische buis | Falcon | 352096 | (Section1,3) Of equivalente merk |
| 1.7 ml polypropyleen buis | Bioexpress | C-3262-1 | Of equivalente merk |
| Quick-RNA MiniPrep | Zymo Research | R1054 | Of equivalente merk |
| TNF-alpha | Applied Biosystems | Mm 00443260_g1 | Taqman gene expressie assay kit |
| IL-6 | Applied Biosystems | (Mm 00446190_m1 | Taqman gene expressie assay kit |
| IL-1beta | Applied Biosystems | Mm 00434228_m1 | Taqman gene expressie assay kit |
| IL-18 | Applied Biosystems | Mm 00434225_m1 | Taqman gene expressie assay kit |
| 18s | Applied Biosystems | Hs 99999901_s1 | Taqman gene expressie assay kit |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| Nexus gradient Mastercycler | Eppendorf | ||
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4352042 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies/Applied Biosystems | 4368814 | |
| Fast Optical 96-Well Reactieplaat, 0.1 mL | Life Technologies/Applied Biosystems | 4346907 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 Proteïne | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/ml |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C7559 |
Referenties
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelia....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
