Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Genereren van Organ-geconditioneerde media en toepassingen voor het bestuderen van Organ-specifieke invloeden op Borstkanker Gemetastaseerde Behavior

8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54037

⸱

13 juni 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1London Regional Cancer Program, London Health Sciences Centre, 2Department of Anatomy & Cell Biology, Schulich School of Medicine & Dentistry, Western University, 3Department of Biochemistry, Schulich School of Medicine & Dentistry, Western University, 4Department of Oncology, Schulich School of Medicine & Dentistry, Western University, 5Lawson Health Research Institute

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft een ex vivo modelsysteem bestaande uit orgaan-geconditioneerde media, afgeleid van de lymfknoop, bot, long en hersenen van muizen. Dit modelsysteem kan worden gebruikt om op orgaan afgeleidde oplosbare factoren te identificeren en te bestuderen en hun effecten op de orgaantropisme en metastatisch gedrag van kankercellen.

Samenvatting

Borstkanker geeft bij voorkeur uitzaaiingen naar de lymfklier, botten, longen, hersenen en lever bij borstkankerpatiënten. Eerdere onderzoeksinspanningen waren gericht op het identificeren van factoren die inherent zijn aan borstkankercellen die verantwoordelijk zijn voor dit waargenomen uitzaaiingspatroon (genaamd orgaantropisme), maar er is veel minder bekend over factoren die aanwezig zijn in specifieke organen die bijdragen aan dit proces. Dit komt deels door een gebrek aan in vitro modelsystemen die de orgaanmicro-omgeving nauwkeurig nabootsen. Om dit aan te pakken, is een ex vivo modelsysteem opgezet dat de studie van oplosbare factoren die aanwezig zijn in verschillende orgaanmicro-omgevingen mogelijk maakt. Dit model bestaat uit het genereren van geconditioneerde media uit organen (lymfklier, botten, longen en hersenen) geïsoleerd van normale athymische naakte muizen. Het modelsysteem is gevalideerd door aan te tonen dat verschillende borstkankercellijnen cel-lijnspecifiek en orgaanspecifiek kwaadaardig gedrag vertonen in reactie op orgaangeconditioneerd medium dat overeenkomt met hun in vivo uitzaaiingspotentieel. Dit modelsysteem kan worden gebruikt om specifieke orgaan-afgeleide oplosbare factoren te identificeren en evalueren die een rol kunnen spelen in het uitzaaiingsgedrag van borst- en andere soorten kankercellen, inclusief invloeden op groei, migratie, stamcel-achtig gedrag en genexpressie, evenals de identificatie van potentiële nieuwe therapeutische doelen voor kanker. Dit is het eerste ex vivo modelsysteem dat kan worden gebruikt om orgaanspecifiek uitzaaiingsgedrag in detail te bestuderen en de rol van specifieke orgaan-afgeleide oplosbare factoren te evalueren bij het aansturen van het proces van kankermetastase.

Inleiding

Borstkanker is de meest gediagnosticeerde kanker bij vrouwen en de tweede belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen 1. Borstkanker hoge sterftecijfer is vooral te wijten aan het falen van conventionele therapie te verminderen en te elimineren gemetastaseerde ziekte; ongeveer 90% van kanker-gerelateerde sterfgevallen te wijten metastase 2. Het begrijpen van de onderliggende moleculaire mechanismen van de metastatische cascade grootste belang voor de ontwikkeling van therapeutische effectief zowel vroege als late stadium van borstkanker.

Verleden onderzoek heeft geholpen verhelderen de meerdere stappen aard van de uitzaaiing van borstkanker en het wordt verondersteld dat het resultaat van zowel de progressie van kanker en metastase is grotendeels afhankelijk van interacties tussen kankercellen en de nieuwe omgeving 3. Klinische observaties tonen aan dat veel kankers tonen orgaan tropisme, dwz., De neiging om bij voorkeur metastaseren specifieke organs.In case borstkanker, ziekte van een patiënt typisch verspreidt of uitzaaiing 5 belangrijkste plaatsen, zoals het been, longen, lymfeknopen, lever en hersenen 4-6. Veel theorieën zijn ontwikkeld om dit proces uit te leggen, maar slechts een paar hebben de tand des tijds doorstaan. Ewing's theorie van metastase, in de jaren 1920 voorgesteld, de hypothese datde verdeling van metastase was strikt door mechanische factoren; waarbij tumorcellen in het lichaam via de normale fysiologische gedefinieerd bloedstroom patronen worden uitgevoerd en eenvoudig te arresteren in het eerste capillaire bed die ze tegenkomen 7. Daarentegen Stephen Paget 1889 "zaad en aarde" hypothese geopperd dat bijkomende moleculaire interacties verantwoordelijk waren voor overleving en groei van metastasen, waarbij kankercellen ( "seeds") zich alleen kunnen oprichten en proliferatein orgaan microenvironments passende moleculaire factoren produceren ( "bodem ") 8. Bijna een eeuw later, Leonard Weiss ondernam een ​​meta-analyse van eerder gepubliceerde data autopsie bevestigd Ewing voorspelling dat vele uitgezaaide tumoren waargenomen bij de autopsie werden gevonden in de verwachte verhoudingen die zou worden verwacht wanneer orgaan met metastasen tropisme alleen bepaald door de bloedstroom patronen. In manyinstances waren er minder of meer metastasen gevormd op bepaalde plaatsen dan zou Ewing voorgestelde mechanische factoren 9 verwachten. Deze rekeningen en theorieën suggereren dat specifiek orgaan microenvironments een cruciale rol in de verspreiding patronen en de daaropvolgende groei en overleving van vele vormen van kanker, zoals borstkanker spelen.

Eerder onderzoek inspanningen zijn voornamelijk gericht op tumor- cellen afgeleide factoren en hun bijdrage aan het orgaan tropisme waargenomen bij borstkanker metastase 10-12, maar weinig onderzoek is onderzocht factoren afgeleid van het micro orgaan dat kan gunstig niche in de vaststellingborstkanker metastasen. Dit is grotendeels te danken aan de technische uitdagingen van het bestuderen componenten van het orgel in vitro micro-omgeving.

De huidige artikel beschrijft een gedetailleerd ex vivo model voor het bestuderen van de invloed van de oplosbare bestanddelen van de lymfeknoop, bot, long en hersenen op het metastatisch gedrag van humane borstkankercellen. Eerdere studies hebben dit modelsysteem bevestigd door aan te tonen dat verschillende borstkankercellijnen tonen cellijn specifieke en orgaanspecifieke maligne gedrag in reactie op geconditioneerde media-orgaan dat overeenkomt met de in vivo metastatisch potentieel 13. Dit model kan worden gebruikt voor het identificeren en specifieke organen afgeleide oplosbare factoren die een rol spelen bij het metastatische gedrag van borstkanker en andere soorten kankercellen, met inbegrip invloeden op de groei, migratie evalueren, stam-achtig gedrag en genexpressie en de identificatie vanpotentiële nieuwe therapeutische doelwitten voor kanker. Dit is de eerste ex vivo model dat kan worden gebruikt om orgaanspecifieke metastatisch gedrag in detail te onderzoeken en de rol van organen afgeleide oplosbare factoren voor het proces van metastase te beoordelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierlijke studies werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de Canadese Raad over Animal Care, in het kader van protocollen door de Western University Animal Gebruik Subcommissie goedgekeurd.

1. Organ Isolation (Lung, hersenen, botten, lymfkliertest)

  1. Neem vier steriele 50 ml conische buizen (een voor elk orgaan te isoleren) die ongeveer 30 ml steriel fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Pre-wegen elk buisje PBS met behulp van een elektronische weegschaal.
  2. Euthanaseren 6-12 week oude muis door CO 2 inhalatie. Muizen moet worden overgelaten in de CO 2 kamer voor ongeveer 1-2 min of tot de muis niet meer beweegt en ademhaling. Succesvol euthanasie kan verder worden bevestigd door het ontbreken van hartslag bij het handmatig gecontroleerd met een vinger. Voorkomen cervicale dislocatie omdat deze methode bloedvaten van de nek leidt tot problemen verwijderen axillaire lymfeklieren kunnen scheuren.
    Let op: Eerder werk heeft specifiek gebruiktgezond vrouwelijk naakt muizen, Hsd: Athymische nude- Foxn1 nu 13.
  3. In een steriele weefselkweek kap, plaatst u de muis op zijn rug op een piepschuim pad, verspreid de ledematen en gebruiken pinnen om ze op hun plaats te houden.
  4. Met behulp van een steriel pincet en een schaar, knip de abdominale huid op de middenlijn aan de genitaliën en snijd omhoog naar de mond. Trek de rug van de buikhuid van de buikspieren en speld op zijn plaats op het piepschuim pad.
  5. Zoek de oksel, arm en lies lymfeklieren.
    Opmerking: lymfeklieren zijn meestal omringd door vetweefsel. De inguinale lymfeknopen zijn het makkelijkst te lokaliseren omdat ze oppervlakkig op de kruising van twee bloedvaten op de teruggetrokken buikhuid gevonden. Oksel en arm lymfeklieren bevinden zich dieper in het weefsel en vereisen zachte manoeuvreren van weefsel.
    1. Nadat u de lymfeklieren hebben gelegen, gebruik dan de schaar om zachtjes en voorzichtig snijd de lymfe geendes ze weg van de huid, vet en vaten en uit de muis. Om een ​​goede dissectie te bevestigen, rol de tang op het verwijderde weefsel. Als een harde knobbel bestaat wanneer het rollen van de tang over het weefsel, dan is een lymfeklier is waarschijnlijk met succes verwijderd.
    2. Bewaar verwijderde lymfeklieren in ijskoude PBS.
  6. Behulp van de tang en schaar, open de buikholte door snijden door de blootgestelde buikwand boven te bewegen naar de borst. Knip voorzichtig door het borstbeen, het blootstellen van de borstholte.
  7. Zoek het middenrif onder de longen en snijd het middenrif. Het moet trekken aan de ribben door spanning.
  8. Til de longen van onderaf en snijd het onderliggende weefsel in de richting van de luchtpijp. Hierdoor kan de longen vrij van de borstholte verwijderd. Verwijder het hart en de longen en bloc en plaats in ijskoud PBS. Het hart kan uit de longen hier of vlak voor het wegen in stap 2 worden verwijderd.
  9. Verwijder depennen, waarbij de muis op zijn plaats op het polystyreenschuim pad. Draai de muis over en snijd de huid van de onderrug helemaal over van flank naar flank.
  10. Met behulp van een steriel gaasje op de romp van de muis te houden, schil de rug huid van de muis over de benen en voeten van de muis.
  11. Het gebruik van hetzelfde stuk steriel gaasje, houdt het onderbeen in plaats zorgvuldig te breken het enkelgewricht van de muis voet en schil de huid over het gewricht proximaal in de richting van het kniegewricht.
  12. Met een schaar, verwijder de tibia vrij van het kniegewricht en plaats in ijskoud PBS.
  13. Herhaal stap 1.11) tot 1.12) met tegengestelde ledematen.
  14. Met behulp van een tang, houdt het dijbeen op zijn plaats, weggesneden omliggende spierweefsel met behulp van de schaar en verwijder het dijbeen, waardoor het in ijskoud PBS.
  15. Herhaal stap 1.14) met tegengestelde ledematen.
  16. Met behulp van een nieuw stuk van steriel gaas, houdt het hoofd van de muis op zijn plaats. Met behulp van een tang en schaar, verwijder voorzichtig de huid aan de s blootKull. Met een schaar, knip voorzichtig het achterhoofd schedel uit de top midden in een rechte lijn naar beneden en naar de achterste hersenen bloot te leggen.
  17. Met behulp van een tang, schep onder de hersenen in de richting van de voorste en verwijder de gehele hersenen. Plaats de hersenen in ijskoud PBS.
  18. Herhaal 1,1) tot 1,17) stappen gedurende ten minste vier muizen.

2. Organ Weighing

  1. Na orgel isolatie, wegen elk PBS buis met long- en hersenweefsel met behulp van een elektronische weegschaal.
  2. Bereken het gewichtsverschil door het aftrekken van de pre-isolatie gewicht (alleen PBS) van het gewicht van de buis PBS + organen (longen en hersenen).
  3. Bepaal de hoeveelheid media nodig weefselfragmenten resuspenderen van de berekende gewichtsverschil.
    Opmerking: Lung en hersenweefsel gewichtspercentages genormaliseerd door resuspensie in een 4: 1 media: weefsel verhouding (vol / gew).

3. Productie van long- en hersen- geconditioneerde media

  1. Steriel tkwestie cultuur kap, omkeren PBS buizen die de longen of de hersenen drie keer om de resterende bloed uit de organen en zuig PBS met bloed te verwijderen. Herhaal dit met verse koude PBS tot oplossing helder met geen bewijs van bloed verschijnt.
  2. Plaats de longen en hersenen in afzonderlijke 60 mm 2 glazen petrischaaltjes. Met behulp van twee steriele scalpel bladen, gehakt longen of hersenen door herhaaldelijk heen en weer te snijden tot weefsel fragmenten zijn ongeveer ~ 1 mm 3 in grootte.
  3. Resuspendeer weefsel fragmenten in geschikte volume (eerder bepaald in stap 2,3) of Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM): F12 medium aangevuld met 1 x geconcentreerde mitogeen vullen en penicilline (50 gg / ml) / streptomycine (50 gg / ml).
  4. Voeg geresuspendeerde longen of hersenweefsel fragmenten één putje van een 6-wells plaat.
  5. Incubeer weefselfragmenten in media gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2. Na de incubatie, verzamel geconditioneerde media voor elk weefsel en ferdere verdunnen door toevoeging van drie gelijke hoeveelheden vers medium in een 50 ml conische buis.
  6. Centrifugeer bij 1000 xg in verdunde geconditioneerde media voor elk orgaan bij 4 ° C gedurende 15 min om grote weefselafval te verwijderen. Verzamel media supernatant en te filteren door middel van een 0,22 pm spuitfilter.
  7. Pool geconditioneerde media uit elk orgaan (bijv., Long met long en hersenen met de hersenen) van meerdere muizen vertegenwoordigen muis tot muis variabiliteit. Aliquot en bewaar geconditioneerde medium bij -80 ° C tot gebruik.

4. Genereren van Bone Marrow-conditioning Media

  1. In een steriele weefselkweek kap, trimmen overtollige weefsel uit het bot en verwijder epifysen (eindstukken) uit de botten met een schaar.
  2. Met behulp van een 27 G naald ½ spoelen mergholte van beenderen door op 1 ml PBS door het midden van elk been. Dit zal u toelaten om stromale beenmergcellen (BMSC) verzamelen in een nieuwe buis met PBS.
  3. Centrifugeer bij 1,000 g gedurende 5 min bij 4 ° C en wassen BMSC tweemaal met PBS. Resuspendeer beenmerg stromale cellen in 20 ml bot stromale cel kweekmedium (DMEM: F12 medium aangevuld met 1 x geconcentreerde mitogeen supplement, penicilline (50 gg / ml) / streptomycine (50 ug / ml) en 10% foetaal boven serum (FBS) ).
  4. Plaat 10 ml geresuspendeerd beenmerg stromale cellen in een T75 fles.
    Opmerking: Combineer en plaat cellen van elk 2 muizen in elke T75 kolf; vier muizen zijn twee T75 kolven nodig (ca. 1 x 10 7 cellen / fles).
  5. Incubeer beenmerg stromale cellen in bot stromale celgroei media gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2. Na de incubatie, verwijder media uit zowel T75 kolven en in gebruik genomen nieuwe T75 fles, etiket deze kolf als "Floater Fles". Voeg frisse bot stromale celgroei media vorige 2 kolven en incubeer alle 3 kolven bij 37 ° C en 5% CO2.
  6. Na de cellen te bereiken ongeveer 70% samenvloeiing (ongeveer 5-7dagen) passage cellen. Om dit te doen, verwijder medium en was de cellen tweemaal met PBS (3 ml per wasbeurt). Verwijderen PBS en voeg 3 ml trypsine / EDTA-oplossing, zodat trypsine bedekt het gehele oppervlak van de kolf. Na de cellen til de kolf (~ 2 - 3 min), halte trypsine reactie door toevoeging van 3 ml bot stromale celgroei media). Centrifuge 900 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C, verwijderen media en resuspendeer cellen in 10 ml vers bot stromale celgroei media.
  7. Pool cellen van alle kolven en passage 1: 5 in drie nieuwe T75 flessen en incubeer bij 37 ° C en 5% CO2. Na de cellen nogmaals 70% te bereiken, herhaalt u stap 4.6 en zwembad en de passage van alle aanhangend cellen een tweede keer. Opnieuw plate alle cellen vier T75 flessen en incubeer 37 ° C en 5% CO2. Bot stromale cel groeimedia worden gebruikt voor alle stappen.
  8. Laat cellen om samenvloeiing bereiken, wassen cellen drie keer met PBS en voeg bot stromale cellen verzameling media (DMEM: F12 media + 1x geconcentreerd mitogeen supplement + penicilline (50 gg / ml) / streptomycine (50 gg / ml); 10 ml / T75), om ervoor te zorgen dat deze media vrij is van FBS. Verzamel beenmerg geconditioneerde medium 72 uur later, gefiltreerd door een 0,22 urn filter, pool, hoeveelheid en bewaar bij -80 ° C tot gebruik.
  9. Desgewenst bevestigen fenotype van de geïsoleerde beenmerg-stromacellen (BMSC) met behulp van antilichamen tegen muizen Sca-1, CD105, CD29, en CD73, CD44, onder toepassing van standaard technieken flowcytometrie zoals eerder 13 beschreven.

5. Het genereren van lymfkliertest airconditioning Media

  1. In een steriele weefselkweek kap, omkeren PBS buis met lymfeklieren drie keer om de resterende bloed uit de lymfeklieren en zuig bloedige PBS te verwijderen. Herhaal dit met verse koude PBS tot oplossing helder met geen bewijs van bloed verschijnt.
  2. Plaats lymfeklieren in 60 mm 2 glazen petrischaaltjes. Met behulp van twee steriele scalpel bladen, gehakt lymfeklieren door herhaaldelijk heen en weer te snijden tot tissuE-fragmenten zijn ongeveer 1 mm3 groot.
  3. In een conische buis, resuspendeer weefselfragmenten in 10 ml Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI1640) medium aangevuld met penicilline (50 gg / ml) / streptomycine (50 gg / ml), 5 x 10 -5 M steriele β-mercaptoethanol ( 1,75 pl / 500 ml media) en 10% FBS.
  4. Centrifugeer bij 900 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en resuspendeer alle cellen in 30 ml media. Voeg 5 ml medium / putje in een 6-wells plaat en incubeer gedurende 7 dagen bij 37 ° C en 5% CO2.
  5. Na 7 dagen incubatie media verwijderen, wassen hechtende cellen met 5 ml warm PBS en voeg 5 ml vers medium aan elk putje. Een cel in staat om te groeien tot confluentie (ongeveer 5-7 dagen), trypsinize, zwembad alle cellen en passage zoals beschreven in stap 4.6. Opnieuw plate cellen 6-wells plaat. Herhaal deze stap drie keer.
  6. Na drie passages, zodat de cellen groeien tot samenvloeiing, wassen putjes driemaal met PBS en voeg 2 ml / putje van DMEM: F12 + 1xgeconcentreerd mitogeen supplement en penicilline (50 gg / ml) / streptomycine (50 gg / ml), zodat de folie vrij van FBS. Verzamel lymfe-node geconditioneerde media na 72 uur, zwembad, hoeveelheid, en bewaar bij -80 ° C tot gebruik.
  7. Desgewenst bevestigen fenotype van de geïsoleerde lymfeknopen stromale cellen (LNSC) met behulp van antilichamen tegen muizen CD45 en gp38, onder toepassing van standaard technieken flowcytometrie zoals eerder 13 beschreven.

6. Gebruik van Organ-geconditioneerde media betreffende Downstream Testen om metastatische gedrag van kankercellen Verwante

  1. Zodra het orgaan geconditioneerde medium werd gegenereerd zoals beschreven in stappen 1-5, gebruiken verschillende benedenstroomse cel en moleculaire biologie assays uit te voeren om de invloed van oplosbare orgaan afgeleide factoren op de metastatische gedrag van kankercellen te bepalen. Voorbeelden van standaard assays (elders in de literatuur beschreven) omvatten eiwitarrays 13, cellulaire groei assays 13, celmigratie assays 13, tumorsphere formatie 14 en RT-PCR 15. De originele basismedium gebruikt om het orgel geconditioneerde medium genereren (dwz ongeconditioneerde DMEM. F12 medium aangevuld met 1 x geconcentreerde mitogeen vullen en penicilline (50 gg / ml) / streptomycine (50 ug / ml) worden gebruikt als een negatieve controle .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Generatie van Organ geconditioneerde Media

Overzichtsdiagrammen / schema van het proces van orgaan isolatie en productie van geconditioneerd medium wordt getoond in Figuur 1, met representatieve fotografische beelden van de in figuur 2 procedure. Opgemerkt wordt dat bij dit protocol werd voor het eerst in ontwikkeling is lever inbegrepen in onze analyse omdat het een gemeensch...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Metastase is een complex proces waarbij een reeks cellulaire gebeurtenissen uiteindelijk veroorzaken weefselinvasie en verre tumor inrichting 4,30,31. De ex vivo modelsysteem gepresenteerde kunnen worden gebruikt om twee belangrijke aspecten van metastatische progressie studeren: kankercel homing of migratie naar een specifiek orgaan ( "daarheen") en groei van dat orgaan ( "daar groeien"). Vele studies hebben eerder gericht op het identificeren van mol specifieke eigenschappen van...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Canadian Breast Cancer Foundation-Ontario Region, de Canada Foundation for Innovation (nr. 13199) en donaties van John en Donna Bristol via de London Health Sciences Foundation (aan A.L.A.). Beurzen en fellowships werden verstrekt door het Ontario Graduate Scholarship-programma (Provincie van Ontario, aan G.M.P. en J.E.C.), het Canada Graduate Scholarship-Master's programma (aan M.M.P), de Canadian Institutes of Health Research (CIHR)-Strategic Training Program (aan M.M.P., G.M.P. en J.E.C.) en de Pamela Greenaway-Kohlmeier Translational Breast Cancer Research Unit bij het London Regional Cancer Program (aan M.M.P., G.M.P., J.E.C. en Y.X.). A.L.A. wordt ondersteund door een CIHR New Investigator Award en een Early Researcher Award van het Ontario Ministry of Research and Innovation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
50 ml conische buizenThermo Scientific (Nunc)339652Steril bewaren
1x Fosfaat-gebufferde zoutoplossingThermoFisher Scientific10010-023Steril bewaren
Nude muizenHarlan LaboratoriesHsd:Athymic Nude-Foxn1nuGebruik bij 6 - 12 weken oud
Polystyreen schuimpadN/AN/ADe weggegooide deksel (~ 4 x 8 inch of groter) van een polystyreen schuimverpakking kan voor dit doel worden gebruikt. Steriliseer door met ethanol af te vegen.
PincetFine Science Tools11050-10Steril bewaren
SchaarFine Science Tools14058-11Steril bewaren
GaasjesFisher Scientific22-246069Steril bewaren
60 mm2 glazen petrischalenSigma-AldrichCLS7016560Steril bewaren
ScalpelmesjesFisher ScientificS95937ASteril bewaren
DMEM:F12Life Technologies21331-020Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik, steriel bewaren 
1x Mito + Serum ExtenderBD Biosciences355006Aangeduid als "geconcentreerde mitogeen aanvulling" in het manuscript. Steril bewaren
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/ml)Life Technologies15140-122Steril bewaren
Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)Life Technologies11875-093Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik, steriel bewaren 
Fetaal bovien serumSigma-AldrichF1051-500MLSteril bewaren
Trypsine/EDTA oplossingThermoFisher ScientificR-001-100Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik, steriel bewaren 
6-well tissuecultuur platenThermo Scientific (Nunc)140675Steril bewaren
0,22 μm spuitfiltersSigma-AldrichZ359904Steril bewaren
T75 tissuecultuur flaskenThermo Scientific (Nunc)178905Steril bewaren
TranswellsSigma-AldrichCLS3464Steril bewaren, gebruiken voor migratie-assays
Anti-muis Sca-1R&D SystemsFAB1226Pgebruiken bij 10 µl/106 cellen
Anti-muis CD105R&D SystemsFAB1320Pgebruiken bij 10 µl/106 cellen
Anti-muis CD29R&D SystemsFAB2405P-025gebruiken bij 10 µl/106 cellen
Anti-muis CD73R&D SystemsFAB4488Pgebruiken bij 10 µl/106 cellen
Anti-muis CD44R&D SystemsMAB6127-SPgebruiken bij 0,25 µg/106 cellen
Anti-muis CD45eBioscience11-0451-81gebruiken bij 5 µl/106 cellen
Anti-muis gp38eBioscience12-5381-80gebruiken bij 10 µl/106 cellen
β-mercaptoethanol Sigma-AldrichM6250 Steril bewaren
Proteïne arraysRayBiotech Inc.AAM-BLM-1-2Gebruik 1 array per mediaconditie (inclusief negatieve controle), in drievoudige

Referenties

  1. Canadian Cancer Statistics. Canadian Cancer Society. , Toronto, ON. Available from: www.cancer.ca (2014).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
  3. Fidler, I. J. The organ microenvironment and cancer metastasis. Differentiation. 70 (9-10), 498-505 (2002).
  4. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
  5. Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. J Clin Oncol. 28 (20), 3271-3277 (2010).
  6. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  7. Ewing, J. Neoplastic Diseases: A Treatise on Tumors. Am J Med Sci. 176 (2), 278(1928).
  8. Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. 1889. Cancer Metastasis Rev. 8 (2), 98-101 (1989).
  9. Weiss, L. Comments on hematogenous metastatic patterns in humans as revealed by autopsy. Clin Exp Metastasis. 10 (3), 191-199 (1992).
  10. Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
  11. Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
  12. Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
  13. Chu, J. E., et al. Lung-Derived Factors Mediate Breast Cancer Cell Migration through CD44 Receptor-Ligand Interactions in a Novel Ex Vivo System for Analysis of Organ-Specific Soluble Proteins. Neoplasia. 16 (2), 180-IN127 (2014).
  14. Pio, G., Piaseczny, M., Allan, A. The Role of Bone-Derived Osteopontin in the Migration and Stem-Like Behavior of Breast Cancer Cells. AACR. , 2015 (2015).
  15. Deepak, S., et al. Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes. Curr Genomics. 8 (4), 234-251 (2007).
  16. Hammerschmidt, S. I., et al. Stromal mesenteric lymph node cells are essential for the generation of gut-homing T cells in vivo. J Exp Med. 205 (11), 2483-2490 (2008).
  17. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  18. Baddoo, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection. J Cell Biochem. 89 (6), 1235-1249 (2003).
  19. Furger, K. A., Menon, R. K., Tuck, A. B., Bramwell, V. H., Chambers, A. F. The functional and clinical roles of osteopontin in cancer and metastasis. Curr Mol Med. 1 (5), 621-632 (2001).
  20. Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinases as breast cancer drivers and therapeutic targets. Front Biosci (Landmark Ed). 20, 1144-1163 (2015).
  21. Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinase-induced epithelial-mesenchymal transition in breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (2), 201-212 (2010).
  22. Radisky, E. S., Radisky, D. C. Stromal induction of breast cancer: inflammation and invasion. Rev Endocr Metab Disord. 8 (3), 279-287 (2007).
  23. Kakinuma, T., Hwang, S. T. Chemokines, chemokine receptors, and cancer metastasis. J Leukoc Biol. 79 (4), 639-651 (2006).
  24. Zlotnik, A. Chemokines and cancer. Int J Cancer. 119 (9), 2026-2029 (2006).
  25. Schlesinger, M., Bendas, G. Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)--an increasing insight into its role in tumorigenicity and metastasis. Int J Cancer. 136 (11), 2504-2514 (2015).
  26. Cook, K. L., Shajahan, A. N., Clarke, R. Autophagy and endocrine resistance in breast cancer. Expert Rev Anticancer Ther. 11 (8), 1283-1294 (2011).
  27. Singh, P., Alex, J. M., Bast, F. Insulin receptor (IR) and insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R) signaling systems: novel treatment strategies for cancer. Med Oncol. 31 (1), 805(2014).
  28. Lee, S. H., Jeong, D., Han, Y. S., Baek, M. J. Pivotal role of vascular endothelial growth factor pathway in tumor angiogenesis. Ann Surg Treat Res. 89 (1), 1-8 (2015).
  29. Erdmann, R. B., Gartner, J. G., Leonard, W. J., Ellison, C. A. Lack of functional TSLP receptors mitigates Th2 polarization and the establishment and growth of 4T1 primary breast tumours but has different effects on tumour quantities in the lung and brain. Scand J Immunol. 78 (5), 408-418 (2013).
  30. Chambers, A. F., et al. Steps in tumor metastasis: new concepts from intravital videomicroscopy. Cancer Metastasis Rev. 14 (4), 279-301 (1995).
  31. Chiang, A. C., Massague, J. Molecular basis of metastasis. N Engl J Med. 359 (26), 2814-2823 (2008).
  32. Gupta, G. P., et al. Identifying site-specific metastasis genes and functions. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 70, 149-158 (2005).
  33. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4195-4200 (2010).
  34. Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
  35. Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).
  36. Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
  37. Psaila, B., Lyden, D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer. 9 (4), 285-293 (2009).
  38. Lee, R. H., Oh, J. Y., Choi, H., Bazhanov, N. Therapeutic factors secreted by mesenchymal stromal cells and tissue repair. J Cell Biochem. 112 (11), 3073-3078 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Borstkanker metastaseisolatie van lymfeklierenextractie van beenmergverwerking van longweefseloogsten van hersenweefselgeneratie van geconditioneerd mediumflowcytometrische analysecelmigratie assaysRT qPCR analyse
Genereren van Organ-geconditioneerde media en toepassingen voor het bestuderen van Organ-specifieke invloeden op Borstkanker Gemetastaseerde Behavior
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.