Expressie en zuivering van virusachtige deeltjes voor vaccinatie

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het synthetiseren van virusachtige deeltjes met behulp van baculovirus of zoogdierlijke expressiesystemen en ultracentrifugatie zuivering. Deze zeer flexibele aanpak wordt gebruikt om virale antigenen vaccin taakstellingen op veilige en soepele wijze.

Samenvatting

Virusachtige deeltjes (VLP's) en subvirale deeltjes (SVP) een alternatieve benadering voor virale vaccins die de voordelen van een verhoogde biologische veiligheid en stabiliteit op het gebruik van levende pathogenen heeft. Niet-infectieuze en zelfassemblerende VLP's worden gebruikt voor structurele eiwitten presenteren als immunogenen, het omzeilen van de behoefte aan levende pathogenen of recombinante virale vectoren voor antigeen-afgifte. In dit artikel tonen we de verschillende stadia van VLP ontwerp en ontwikkeling voor toekomstige toepassingen in preklinische dierproeven. De procedure omvat de volgende stadia: selectie van antigeen expressie van antigeen in cellijn naar keuze, zuivering van VLP's / SVP en kwantificering van antigeen doseren. We demonstreren gebruik van zowel zoogdieren en insecten cellijnen voor expressie van onze antigenen en tonen hoe methoden verschillen opbrengst. De gepresenteerde methode kan voor een verscheidenheid aan pathogenen en kan worden bereikt door het substitueren van de immunogene antigenen met structural eiwitten van micro-organisme van het belang van de gebruiker. VLP's en SVP helpen met antigeen karakterisering en selectie van de beste kandidaat-vaccins.

Inleiding

Virusachtige deeltjes (VLP's) zijn een erkende technologie voor de vaccinatie van mensen. In feite zijn sommige van de meer eigentijdse geregistreerde vaccins, zoals de menselijke papillomavirus (HPV) en hepatitis Β (HepΒ) vaccins gebruiken deze aanpak. VLP's worden gevormd uit structurele eiwitten die in staat zelf te monteren. De samengestelde deeltjes nabootsen virale morfologie, maar kan infecteren of te repliceren, omdat ze geen virale genomen. VLP's kunnen tot expressie worden gebracht en gezuiverd uit een aantal prokaryotische en eukaryotische systemen. Een overzicht van de literatuur is gebleken dat verschillende expressie systemen worden ingezet tegen de volgende tarieven: bacteriën - 28%, gist - 20%, plant - 9%, insect - 28%, en van zoogdieren - 15% ^1. Van de nota, zijn HPV-vaccins gebaseerd op L1 capside-eiwit geproduceerd in gist (Gardasil) of in een insect cel systeem (Cervarix) ^2. HepΒ vaccins Recombivax en Engerix-Β, worden geproduceerd in gist, en bestaan ​​uit HepΒ oppervlakteantigeen ³, 4.

We gebruiken zoogdier- en insectencellen-expressiesystemen tot VLP's die co-expressie van meerdere eiwitten voor structurele assemblage produceren. Ons werk richt zich op het ontwerpen, produceren en zuiveren-VLP gebaseerde vaccins tegen menselijke pathogenen: griepvirus, respiratoir syncytieel virus (RSV), dengue virus (DENV) en chikungunya-virus (CHIKV). De methoden zijn flexibel genoeg om voor co-expressie van meerdere structurele eiwitten van verschillende expressieplasmiden of een expressieplasmide (figuur 1). Eerder hebben we geproduceerd en gezuiverd H5N1 VLP's opgebouwd uit de co-expressie van plasmiden die coderen voor influenza hemagglutinine (HA), neuraminidase (NA) en matrix (M1) in humane embryonale nier 293T-cellen ^5,6. De genen werden codon geoptimaliseerd voor expressie in zoogdiercellen en gekloneerd in pTR600, een eukaryotische expressievector die de cytomegalovirus immediate-early promotor plus intron A voor het initiëren Transcription van eukaryote inserts en runderen groeihormoon polyadenyleringssignaal voor beëindiging van de transcriptie ^7. Een vergelijkbare benadering met behulp van drie plasmide co-expressie van HA, NA (figuur 1A) en een andere virale matrix eiwit, HIV Gag p55, werd gebruikt voor het verkrijgen van seizoensgebonden influenzasubtype menselijke H3N2 VLP's in dit onderzoek en blijkt genereren VLP's van soortgelijke grootte als influenza deeltjes ^8. Hoewel griepvaccins hoofdzakelijk opwekken anti-HA-antilichamen, de toevoeging van griep neuraminidase bemiddelt sialidase activiteit VLP budding uit getransfecteerde cellen en ⁹ aanwezig additionele immunogene targets mogelijk. RSV VLP produceren we ook de geselecteerde verbonden kern van HIV Gag prototypische vaccins die uitsluitend RSV-glycoproteïnen van het oppervlak presenteren verder aan te tonen flexibiliteit van VLP-vorming middels HIV Gag, zoals eerder beschreven en gekenmerkt door elektronenmicroscopie ^6,10 ontwerpen. anderenhebben eerder aangetoond dat VLP presenteren RSV-glycoproteïnen kunnen worden geassembleerd met behulp van verscheidene virale componenten van Newcastle Disease virus (NDV) ¹¹ en ¹² influenza matrix. Full-length oppervlakte glycoproteïne sequenties werden gebruikt in deze studie natieve conformaties die noodzakelijk zijn voor receptorbinding en functionele antilichaamherkenning assay kan worden door middel van enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) behouden.

Onze voorbeelden voor het gebruik van enkel plasmide expressie systemen om deeltjes te genereren DENV en CHIKV. Bij DENV, kunnen we subvirale deeltjes (SVP) zonder capside in 293T cellen van een plasmide dat een prM / E structurele genexpressiecassette ¹³ produceren. De term SVP wordt gebruikt om het gebrek aan een kern- of capside-eiwit in de assemblage van virale structurele proteïnen duiden. CHIK VLP's kunnen ook worden geproduceerd met een plasmide dat een structureel gen CHIKV cassette codeert capside en envelop eiwitten of insect cellen door het infecteren met een recombinant baculovirus coderend voor hetzelfde gen cassette structureel geoptimaliseerd voor insectencel expressie (Figuur 1B - C).

Het eindresultaat van de expressie benaderingen hierboven besproken is het vrijkomen van VLP's in celkweekmedium dat dan via ultracentrifugatie kan worden gezuiverd door een 20% glycerol kussen. In dit rapport presenteren we methoden om uit te drukken en te zuiveren van deze VLP's van zoogdieren en insecten cel systemen.

Protocol

1. Mammalian Expression Systeem voor het genereren van Influenza H3N2 VLP

1. Subkloon virale structurele glycoproteïnen hemagglutinine (HA), neuraminidase (NA) en humaan immunodeficiëntie virus (HIV) Gag p55 in eukaryotische expressievectoren zoals eerder beschreven pTR600. ⁷
2. Amplificeren DNA in chemisch competente Escherichia coli (bijvoorbeeld DH5a) en isoleren transfectie-grade plasmide met een plasmide zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Hoeveelheid DNA is afhankelijk van de opbrengst en de wensen van de gebruiker.
3. Handhaaf zoogdiercellijn, 293T, in groeimedia bevattende 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C met 5% _CO2 in een bevochtigde incubator.
4. Groeien cellen zodanig dat een T-150 weefselkweek kolf bevat 45-75 x 10 ⁶ cellen per fles zodanig dat fles verkrijgt volledige cel hechting en 85-95% cel confluentie door de volgende dag. Inspecteer cellen onder de microscoop op gewenste conflurantie.
   Opmerking: De hoge celdichtheid wordt meestal aanbevolen om optimale eiwit expressie opleveren met minimale cytotoxiciteit bij het gebruik van commerciële transfectie reagentia echter over-confluentie kan leiden tot ophoping van cellulaire afval bijproducten en levensvatbaarheid van de cellen te verminderen.
5. Op de dag van transfectie bereiden liposomen en DNA-mengsel volgens de aanbevelingen van de fabrikant en transfecteren DNA cellen met een DNA samenstelling van 1: 1: 2 of HA: NA: Gag met totaal DNA hoeveelheid 40 ug per T-150 kolf. Verdun DNA- en liposoomoplossingen in serumvrije transfectie media zonder antibiotica zodat elke kolf een totaal volume van 20-30 ml.
   Let op: Ratio van gen-constructen kunnen gebruikers optimalisatie nodig. Hoewel hier niet getoond, heeft een soortgelijke transfectie procedure uitgevoerd met respiratoir syncytieel virus (RSV) en F HIV Gag op een 1: 1 ratio. Voor DENV en CHIKV één expressieplasmiden totaal 20 ug DNA per T-150 kolf gebruikt voor optimale eXpression. DNA: transfectiereagens verhoudingen gebruiker geoptimaliseerd. Gebruik aanbevolen transfectiemedium gebaseerd op transfectie methode, dwz polykationische lipide transfecties aanbevolen door verlaging of afwezigheid van foetaal runderserum aldus media worden gesupplementeerd met groeihormonen en sporenelementen groei in de afwezigheid van serum ondersteunen.
6. Terugkeren kolven tot 37 ° C met 5% _CO2 incubator. Voor een volume van 200 ml, gebruiken 9 T-150 kolven. De cellen worden gehandhaafd in transfectie kweekmedium tot de dag van VLP oogst.
7. Oogst kweeksupernatant van cellen na 72-96 uur na transfectie afhankelijk antigeen, of wanneer cellevensvatbaarheid is gedaald tot 70-80%, zoals geschat door microscopische inspectie. Overdracht supernatant in 50 ml conische buizen en spin de cellen neer op 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C om celresten te pelleteren.
   Opmerking: Vervanging van 3 dagen supernatant met verse voorverwarmde, serumvrije transfectie media om hechtende cellen zal yielda tweede partij van VLPs met gelijke of iets lagere opbrengst en worden geoptimaliseerd door gebruiker.
8. Pool supernatant en filter door een 0,22 pm porie membraan voor sedimentatie via ultracentrifugatie.
9. Test de hemagglutinatie activiteit van de HA-expressie VLP's door standaard hemagglutinatietest ¹⁴ bij 0,8% kalkoen of zoogdiercellen rode bloedcellen of doorgaan met antigeen-specifieke ELISA. Zie figuur 2 voor representatieve resultaten.

2. CHIK VLP expressie met behulp van baculovirus / Insect Cell System

1. Genereren recombinant baculovirus tot expressie chikungunyavirus capside en envelop-eiwitten (C-E3-E2-6K-E1) van S-27-stam onder toepassing van een commercieel baculovirus expressiesysteem.
2. Cultuur Spodoptera frugiperda Sf9-cellen in serumvrij Sf9 groeimedium met 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine bij 28 ° C. Gebruik 3-5 x 10 ⁵ c / ml tot centrifugekolf culturen voor suspens initiërenion celgroei. Passage routinematig bij het ​​bereiken celdichtheden van 2-4 x 10 ⁶ c / ml (om de 3-4 dagen).
3. Cultuur Sf9 cellen in suspensie in spinner flessen met roeren bij 130 rpm op een multipoint roerder plate-systeem. Voor een goede beluchting, te handhaven cultuur volumes op niet meer dan de helft van het volume van de spinner kolf.
4. Voor expressie van CHIK VLP infecteren Sf9-cellen bij een dichtheid van 2 x 10 ⁶ cellen / ml recombinant baculovirus met een multipliciteit van infectie van 1 en terugkeer naar 28 ° C incubator. Gewoonlijk infecteren één of twee spinner flessen gemaakt met 250 ml Sf9-cellen.
   Let op: Hoewel we niet deze methode gebruikt, kan Sf9 cellen gekweekt in schudkolven bij 28 ° C met behulp van een shaker platform.
5. Oogst kweken na 72-96 uur na infectie, of wanneer cellevensvatbaarheid is gedaald tot 70-80% zoals bepaald door trypan blauw exclusie volgens het protocol van de fabrikant.
   Opmerking: De cellen blijven prolifereren terwijl geïnfecteerde en ereen ~ 80% levensvatbaarheid Sf9 kweken geïnfecteerd met recombinant baculovirus CHIK VLP op 3 dagen na infectie (dpi). -Baculovirus geïnfecteerde cellen zijn groter van uiterlijk. Morfologie ook veranderen van rond tot langwerpig. In de late stadia van baculovirus infecties, de cellen begon te lyseren.
6. Transfer kweken direct van suspensiekweek in 50 ml conische buizen en spin de cellen neer op 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
7. Verzamel supernatanten en te filteren door middel van een 0,22 pm porie membraan voor sedimentatie via ultracentrifugatie.

3. Sedimentatie / Zuivering van VLP / SVP

1. Steriliseren 25 mm x 89 mm met open dak ultracentrifuge buizen met 70% ethanol in bioveiligheid kap. Zorg ervoor dat de ethanol is opgedroogd af voor gebruik.
2. Plaats maximaal 32 ml van de bovenstaande in een schone buis. Een minimaal volume van 25 ml wordt aanbevolen om collaps en beschadiging van onvoldoende gevuld ultracentrifuge buizen te voorkomen.
3. onderlaag zorgvuldig supernatanten with steriele 3 ml 20% glycerol in PBS (v / v). Controleer buizen zijn gebalanceerd.
4. Spin bij 135.000 g gedurende 4 uur bij 4 ° C.
5. Zuig supernatant, het waarborgen van de pellet niet los van de buis.
6. Hersuspenderen gesedimenteerd VLP onderaan de buizen met steriele PBS door krachtig pipetteren en neer. De hoeveelheid PBS nodig resuspenderen VLP afhankelijk VLP totale eiwitopbrengst en verdere toepassingen. Typisch, resuspendeer pellet in elk VLP ten minste 100 pl.
7. Store monsters 4 ° C voor de korte termijn opslag en -80 ° C opslag voor de lange termijn opslag.

4. Vaststellen Eiwit Opbrengsten en Specifiek Antigeen Opbrengsten

1. Bepaal het totale eiwitgehalte onder toepassing van een commerciële eiwit kwantificering werkwijze, zoals BCA assay volgens protocol van de fabrikant.
2. Specifieke antigeengehalte beoordelen voeren direct enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) door bekleding van seriële verdunningen van standaard antigen en 2-51, g totaal eiwit monster een ELISA 96-well plaat met vlakke bodem.
   1. Breng vervolgens antigeenspecifieke antilichamen om de aanwezigheid van de antigenen op de plaat sonde en gebruik conventionele ELISA ontwikkeling substraten detecteerbare absorptie voor microplaatlezer produceren. Zie figuur 2 voor representatieve resultaten van HA en ELISA bepaling voor een monster HA tot expressie VLP; vele combinaties van HA en NA zijn mogelijk, maar de opbrengst kan verschillen bij HA-NA compatibiliteit ^15.
      Opmerking: Antigeen-specifieke antilichamen hebben variabele affiniteiten en het wordt aanbevolen dat eindpunt-verdunning titratie van antilichamen worden bepaald voordat VLP kwantificering. Commerciële antilichamen voorgestelde concentratie of verdunning bereiken voor gebruik in ELISA, alsmede gesuggereerd protocollen.

Resultaten

VLP opbrengsten waren variabel door virale antigeen construct ontwerp. In dit protocol hebben we gebruik van insectencellen en zoogdiercellen voor de productie van SVP of VLP's in supernatant en zuivering door ultracentrifugatie toonde. Vier subtypen van DENV prM / E structuurgen expressiecassettes werden gebruikt om de versie van DENV SVP (afgebakend zoals 1-4) construct in tabel 1 en tonen een bereik tussen 1,1-2,6 mg totaal eiwit in 0,6 ml volumes. Voor VLP dat ee...

Discussie

We hebben de hierboven beschreven technieken die worden gebruikt om met succes uit te drukken en te zuiveren SVP en VLP samengesteld uit meerdere structurele eiwitten van verschillende ziekteverwekkers. In het algemeen gebruiken we zoogdierexpressiesystemen onze VLP's te genereren. Echter, in onze handen, zoogdieren cel afkomstige CHIK VLP opbrengsten waren laag. CHIK VLP opbrengst was robuuster bij het gebruik van een recombinant baculovirus-insectencel systeem. In het algemeen baculovirus-insectencel systemen leve...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12163
DMEM	Cellgro	10-013
Lipofectamine	Life Technologies	L3000075	Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000
Opti-MEM I	Life Technologies	31985062
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Life Technologies	10359-016
Cimarec I 6 multipoint stirrer plate	ThermoFisher Scientific	50094596
Polyclear ultracentrifuge tubes	Seton	7025	Bevestig geschikte buizen voor ultracentrifuge en emmergrootte
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
Fosfaat citraat buffer	Sigma	P4922
o-fenyleendiamine dihydrochloride	Sigma	P8287
0.22 μm vacuümfilter top (500 ml)	Nalgene	569-0020
Glycerol	Sigma	G5516
H2SO4	Sigma	339741
Sf-900 II SFM	ThermoFisher Scientific	10902-096