Multi-enzym screening met een hoge verwerkingscapaciteit Genetische screening Enzyme System

Summary

Dit werk presenteert een methode voor hoogdoorvoerscherming met behulp van een universeel genetisch enzymschermingssysteem dat theoretisch kan worden toegepast op meer dan 200 enzymen. Hier identificeert het enkele schermsysteem drie verschillende enzymen (lipase, cellulase en alkalische fosfatase) door eenvoudigweg het gebruikte substraat te veranderen (p-nitrofenylacetaat, p-nitrofenyl-α-D-cellobioside en fenylfosfaat).

Abstract

De recente ontwikkeling van een high-throughput single-cell assay techniek maakt het mogelijk om nieuwe enzymen te screenen op basis van functionele activiteiten uit een grootschalige metagenomische bibliotheek¹. We stelden eerder een genetisch enzymscreeningsysteem (GESS) voor dat gebruikmaakt van dimethylfenolregulator geactiveerd door fenol of p-nitrofenol. Aangezien een grote hoeveelheid natuurlijke enzymatische reacties deze fenolische verbindingen produceren uit fenol afgeleide substraten, kan dit enkele genetische screeningsysteem theoretisch worden toegepast om meer dan 200 verschillende enzymen in de BRENDA-database te screenen. Ondanks de algemene toepasbaarheid van GESS, vereist het toepassen van het screeningsproces een specifieke procedure om de maximale flowcytometrie signalen te bereiken. Hier beschrijven we het ontwikkelde screeningsproces in detail, dat metagenoompre-processing met GESS en de werking van een flowcytometrie sorter omvat. Drie verschillende fenolische substraten (p-nitrofenylacetaat, p-nitrofenyl-β-D-cellobioside, en fenylfosfaat) met GESS werden gebruikt om respectievelijk drie verschillende enzymen (lipase, cellulase en alkalische fosfatase) te screenen en te identificeren. De geselecteerde metagenomische enzymactiviteiten werden alleen bevestigd met de flowcytometrie, maar DNA-sequencing en diverse in vitro analyse kunnen worden gebruikt voor verdere genidentificatie.

Introduction

Een recent ontwikkelde high-throughput assay eencellige techniek maakt nieuwe enzymen te screenen van een grote bibliotheek genetische basis van hun functionele activiteiten ^1. Bij de enkele cel niveau worden eiwitten die transcriptie gebruikt voor reportergenexpressie te activeren door het aftasten van kleine moleculen die worden geproduceerd als gevolg van een doel enzymactiviteit. Een eerste benadering betrof de isolatie van een fenol-afbrekende operon van Ralstonia eutropha E2 met de substraat-geïnduceerde genetische expressiescreenen (SIGEX) methode, waarbij het ​​substraat induceert de expressie van een reporter proteïne ^2. Nhar van Pseudomonas putida werd gebruikt om benzaldehyde dehydrogenase ³ selecteren en LysG van Corynebacterium glutamicum werd gebruikt voor high-throughput screening van een nieuwe-L-lysine producerende stam van diverse mutante bibliotheken ^4.

Voorheen, een genetische enzym screening systeem (GESS) werd voorgesteld als een algemeen geldend screening platform ^5. Dit systeem maakt gebruik van de met fenol herkennen dimethylfenol regulator DMPr, P. putida. DMPr (E135K) en een mutant van DMPr, kan ook worden toegepast in GESS (pNP-GESS) voor de detectie van p-nitrofenol (pNP). In aanwezigheid van het doel enzymen produceren fenolverbindingen, GESS in E. coli-cellen geeft een fluorescentiesignaal, zodat de snelle isolatie van afzonderlijke cellen met behulp van een fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Maar de expressie van metagenomic enzym lijkt zwakker dan die van conventionele recombinant-enzymen; Daarom GESS ontworpen om fenolverbindingen met maximale gevoeligheid gedetecteerd door het onderzoeken van de combinatie van ribosomale bindingsplaats (RBS) en terminatorsequenties met optimale bedrijfstoestand ^5.

Een van de fundamentele voordelen van GESS is dat deze enkele methode theorie maakt de screening van over dan 200 verschillende typen enzymen in de BRENDA gegevensbank (Tabel 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013,7) door eenvoudigweg gebruik verschillende substraten. Er werd aangetoond dat cellulase, lipase en methyl parathion hydrolase (MPH) kunnen worden gedetecteerd onder toepassing pNP-GESS met geschikt substraat p-nitrofenyl butyraat, p-nitrofenyl cellotrioside en methyl parathion respectievelijk ^5. Recent werd aangetoond dat een alkalische fosfatase (AP), die één van de nieuwe enzymen geïdentificeerd middels pNP-GESS, is de eerste thermolabiele AP in koude aangepast marine metagenomes ^6.

Hier, details van de screening wordt gepresenteerd pNP-GESS detecteren van de activiteiten van drie verschillende soorten enzymes- lipase, cellulase, en alkalische fosfatase; en snel vast kandidaatcomponenten enzymen uit een bibliotheek metagenomic ^5,6. De werkwijzen omvatten metagenoom voorbewerking met PNP GESS en de exploitatie van een flow cytometrie sorter. Terwijl het verkregen treffers moeten worden gesequenced voor verdere identificatie Dit protocol omvat de procedure bij het trapje enzym bevestiging activiteit met flowcytometrie.

Protocol

1. Voorbereiding van de Metagenomic Bibliotheek met PNP GESS

1. De bouw van een metagenomic bibliotheek in E. coli met gebruikmaking van een vector fosmid fosmid bibliotheek productie kit volgens de fabrikant protocol ^5.
2. Aliquot 100 ul van de bibliotheek voor opslag bij -70 ° C, hetgeen een bron van metagenomic bibliotheek cellen.
   Opmerking: De optische dichtheid van een monster gemeten bij een golflengte van 600 nm (OD ₆₀₀₎ van deze bibliotheek stock ongeveer 100.
3. Ontdooien 100 pl van de stock metagenomic bibliotheek op ijs en beënt in een kolf van 500 ml bevattende 50 ml Luria-Bertani (LB) en 12,5 ug / ml chlooramfenicol gevolgd door 37 ° C incubatie gedurende 2 uur.
4. Oogst de cellen in een 50 ml conische buis door centrifugeren bij 1000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
5. Resuspendeer de pellet snel in 50 ml ijskoud gedestilleerd water (DW) en gecentrifugeerd bij 1000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C weer.
6. Resuspend de pellet in 50 ul ijskoude DW met 10% (v / v) glycerol. Gebruik 50 gl van deze cel aliquot voor elektroporatie.
7. Plaats het mengsel van elektrocompetente cellen 50 pl en pGESS (E135K) ⁵ DNA (100 ng) in een ijskoude elektroporatie cuvette en electroporate (1,8 kV / cm, 25 uF) het mengsel.
8. Snel voeg 1 ml super optimale bouillon met katabolische repressie (SOC) medium en resuspendeer de cellen voorzichtig.
9. Breng de cellen in 14 ml ronde bodem buis met behulp van een pipet en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
10. Spread 500 ul van de cellen teruggewonnen op een LB 20 x 20 cm vierkante plaat met 12,5 ug / ml chloramfenicol en 50 ug / ml ampicilline. Incubeer plaat bij 30 ° C gedurende 12 uur.
11. Schraap de kolonies met behulp van een cel schraper en het verzamelen van de cellen in een 50 ml conische buis met behulp van ijskoude cel opslagmedia.
12. Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet in 10 ml ijskoude cel opslagmediaom een OD ₆₀₀ te bereiken van 100.
13. Aliquot 20 ul van de cellen voor opslag bij -70 ° C.

2. Het verwijderen van valse meldingen van de Metagenomic Library

1. Ontdooi de voorraad metagenomic bibliotheek cellen (vanaf stap 1,13) dat metagenomic DNA fosmid en pGESS (E135K) op ijs.
2. Inoculeer 10 ul van de cellen in 2 ml LB met 50 ug / ml ampicilline en 12,5 ug / ml chlooramfenicol in een 14-ml ronde bodem buis. Incubeer bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm gedurende 4 uur.
3. Ondertussen zet de FACS machine en open de standaard FACS software. Gebruik de volgende instellingen: nozzle tip diameter, 70 micrometer; Forward Scatter Area (FSC-A) gevoeligheid, 300 V-logaritmische versterking; Side Scatter Area (SSC-A) gevoeligheid, 350 V-logaritmische versterking; Fluoresceïneisothiocyanaat Area (FITC-A) gevoeligheid, 450 V-logaritmische versterking; drempel parameter, FSC-A waarde 5.
   Opmerking: Typisch instellingen worden gegevenvoor FACS in de tabel van Materialen genoemd apparaat. Pas de instellingen voor andere FACS apparaten.
4. Verdun het metagenomic bibliotheek cellen uit stap 2.2 door toevoeging van 5 ul van het monster op een 5-ml ronde bodem buis met 1 ml PBS.
5. Leg het verdunde bibliotheek monster op de laad-poort van de FACS instrument en klik op de knop Load op de Overname Dashboard van de FACS software.
6. Pas de incidentie tot 1.000 - 1.500 evenementen / sec door te klikken en regelen van het debiet knoppen op het dashboard.
7. Maak log geschaald FSC-A vs. log geschaald SSC-A scatter plot op een wereldwijde werkblad door te klikken op de Dot Plot-knop in de werkbalk. Pas de scatter poort R1 aan de singlet evenementen (bacteriële populatie) met de Polygon Gate knop in de werkbalk te omvatten.
8. Plot een histogram met celgetal vs. log geschaald FITC-A op het werkblad door te klikken op de knop Histogram. Dan pas de FITC spanning van de Cytometab ter instellingen op het infovenster controle zodanig dat de piek van de klokvormige verdeling kleiner dan 10 ² van FITC-A.
9. Maak een log geschaald FSC-A vs. de log-FITC Een perceel door te klikken op de Dot Plot-knop op de wereldwijde werkblad. Stel een sortering poort R2 op perceel via de veelhoek Gate knop op de werkbalk zodat de poort zich tussen + 5% en -5% van de cellen van het centrum van de verdeling (totaal 10% cellen rond de piek van de bell- vormige curve).
10. Plaats een verzamelbuis met 1,2 ml LB met 50 ug / ml ampicilline en 12,5 ug / ml chlooramfenicol bij de uitlaat van de FACS instrument en uitzoeken 10 ⁶ cellen die zowel aan de R1 en R2 poorten.
11. Verwijder de collectie buis, cap, en voorzichtig vortex.

3. Metagenomic Enzyme Screening

1. Incubeer de gesorteerde cellen (uit stap 2,11) bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm tot de _OD600 0,5 bereikt.
2. Voeg 1 ui kopiëren inductie oplossing voor de intracellulaire fosmid aantal kopieën te versterken. Incubeer de cellen gedurende nog 3 uur bij 37 ° C onder schudden bij 250 rpm.
3. Cellen voorbereiden voor het sorteren, voeg 0,5 ml van de gekweekte cellen en een geschikt substraat (p-nitrofenyl acetaat, p-nitrofenyl-β-D-cellobioside of fenyl fosfaat) in een 14 ml rondbodem buis bij een eindconcentratie van 100 uM.
   1. Een controlemonster, voeg 0,5 ml van de gekweekte cellen uit stap 3.2 in een 14-ml ronde bodem buis. Voeg hetzelfde volume van PBS als het substraat volume in stap 3,3.
4. Incubeer de twee monsters bij 37 ° C met schudden bij 200 tpm gedurende 3 uur.
5. Ondertussen bereiden de FACS apparaat met dezelfde configuratie als stap 2.3.
6. Voeg 5 ul van de cellen (voor het sorteren) en controlecellen twee 5 ml rondbodem buisjes met 1 ml PBS, respectievelijk.
7. Plaats de buis met controlecellen op thij het laden haven van de FACS en klik op de knop Laden op Overname Dashboard van de FACS software. Stel de gebeurtenis Rate 1.000 - 3.000 evenementen / sec door het beheersen van Flow Rate knoppen op het dashboard.
8. Maak log schaal FSC-A versus log schaal SSC-A scatterplot op de pagina puntenplot knop op de globale werkblad van de software en stel de spreiding poort R1 de singlet gebeurtenissen omvatten (bacteriepopulatie) via de veelhoek Gate knop op de werkbalk.
9. Maak log geschaald FSC-A vs. log geschaald FITC-A scatterplot door te klikken op de Dot Plot-knop op het werkblad en stel een sortering poort R2 op het perceel met de Polygon Gate knop op de werkbalk, zodat er minder dan 0,1% van de negatieve cellen worden gedetecteerd binnen de R2 gate.
10. Vervang de monsterbus met de sortering monsterbuis en stel de incidentie tot 1.000 - 3.000 evenementen / sec door het regelen van het debiet knoppen op het dashboard.
11. Leg een verzameling buis met 0,5ml LB bij de uitlaat van de FACS instrument en uitzoeken 10 ⁴ cellen die voldoen aan zowel de R1 en R2 poorten.
    Opmerking: De sorteercriterium kan van boven 0,1% tot 5% van FITC-A variëren in de R2 gate. In dit protocol werden de top 1% van de cellen verzameld als positieven.
12. Verwijder de collectie buis, cap, en voorzichtig vortex.
13. Spreid de 0,5 ml verzamelde monsters op twee agarplaten (90 mm petrischalen) bevattende LB, 50 ug / ml ampicilline, 12,5 ug / ml chlooramfenicol en incubeer de plaat bij 37 ° C overnacht.
14. Voer zo nodig extra ronden van het sorteren voor FITC-A verrijking door het herhalen van Steps 3,1-3,14.

4. Hit Selection en enzymactiviteit Bevestiging

1. Flowcytometrieanalyse
   1. Uit de bebroede plaat bij stap 3.14, selecteer een kolonie toont geen fluorescentie met behulp van een kolonie picker onder de observatie van 488 nm golflengte van een LED-verlichting.
   2. Inoculeer de geselecteerde kolonie in een 14-ml ro-und bodem buis met 2 ml LB met 50 ug / ml ampicilline en 12,5 ug / ml chlooramfenicol bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm tot de _OD600 0,5 bereikt.
   3. Voeg 2 pl kopiëren inductie oplossing voor de intracellulaire fosmid aantal kopieën te versterken. Incubeer de cellen gedurende nog 3 uur bij 37 ° C onder schudden bij 250 rpm.
   4. Bereid een 14 ml rondbodem buis en voeg 1 ml van de gekweekte cellen (stap 4.1.3). Voeg een geschikt substraat (p-nitrofenyl acetaat, blz -nitrophenyl- β-D-cellobioside of fenyl fosfaat) bij een uiteindelijke concentratie van 100 uM.
      1. Voor een controle, voeg 1 ml gekweekte cellen uit stap 4.1.3 in een 14 ml rondbodem buis en voeg hetzelfde volume van PBS als het substraat volume in stap 4.1.4.
   5. Incubeer de twee monsters bij 37 ° C met schudden bij 200 tpm gedurende 3 uur.
   6. Ondertussen bereiden de FACS apparaat met dezelfde configuratie als Step 2.3.
   7. Voeg 5 ul van de controle- en behandelde substraat cellen 5 ml rondbodem buisjes met 1 ml PBS, respectievelijk.
   8. Plaats de buis met controle cellen op de laadhaven van de FACS apparaat en klik op de knop Laden op Overname Dashboard van de FACS software. Pas de incidentie tot 1.000 - 3.000 evenementen / sec met behulp van Flow Rate knoppen op het dashboard.
   9. Klik op Acquisitie knop om te meten FITC-A.
   10. Vervang de monsterbus met het substraat behandelde monster buis. Pas de incidentie tot 1.000 - 3.000 evenementen / sec met behulp van Flow Rate knoppen op het dashboard.
   11. Klik op Acquisitie knop om te meten FITC-A.
   12. Vergelijk de fluorescentie van beide groepen van cellen door het uitzetten van een histogram van het aantal cellen versus de log schaal FITC-A.
2. Andere assays voor enzymactiviteit bevestigen
   1. Voor verdere identificatie van de geselecteerde kandidaten enzym, extraheren fosmid DNA met behulp van standaard-extractie proprocedures van het commerciële kits extractie en analyse van de nucleotidesequentie of de in vitro enzymactiviteit ^6,7.

Results

De drie fenolische substraten werden onderzocht om nieuwe metagenomic enzymen uit een metagenoom bibliotheek van de oceaan-tidal flat sedimenten in Taean, Zuid-Korea te identificeren aan de hand van de voorgestelde protocol. Voor de bankconstructie, gemiddeld 30 - 40 kb werden metagenoom sequenties ingevoegd in fosmids, die zijn gebaseerd op de E. coli F factor replicon en gepresenteerd als een enkel exemplaar in een cel. Merk op dat fosmids zijn op grote schaal gebruikt voor he...

Discussion

Het verhogen van de productie-efficiëntie van biokatalysatoren is een sleutel voor het succes van de bio-chemische gebaseerde industrie ⁹ en metagenoom wordt beschouwd als een van de beste natuurlijke enzym bron. In dit opzicht is het essentieel om screening nieuwe enzymen van de metagenoom waarbij meeste genetische middelen niet onderzocht ^10. Verschillende screeningswerkwijzen ontwikkeld die direct detecteren enzymproducten via transcriptionele activators ^{11, 12} maar deze technieken ve...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CopyControl	Epicentre	CCFOS110	Fosmid library production kit
CopyControl Induction Solution	Epicentre	CCIS125	Fosmid copy induction solution
EPI300	Epicentre	EC300110	Electrocompetent cell
pCC1FOS	Epicentre	CCFOS110	Fosmid vector
Gene Pulser Mxcell	Bio-Rad		Electroporation cuvette en electroporeersysteem
FACSAria III	Becton Dickinson		Flow Cytometry (FACS-apparaat)
AZ100M	Nikon		Microscoop
UltraSlim	Maestrogen		LED-verlichter
50-ml conische buis	BD Falcon
14-ml ronde bodembuis	BD Falcon
5-ml ronde bodembuis	BD Falcon
p-nitrofenylfosfaat	Sigma-Aldrich	N7653	Substraat
p-nitrofenyl β-D-cellobioside	Sigma-Aldrich	N5759	Substraat
p-nitrofenylbutyraat	Sigma-Aldrich	N9876	Substraat
Luria-Bertani (LB)	BD Difco	244620	Trypton 10 g/L, Gistextrakt 5 g/L, Natriumchloride 10 g/L
Super Optimal bouillon (SOB)	BD Difco	244310	Trypton 20 g/L, Gistextrakt 5 g/L, Natriumchloride 0,5 g/L, Magnesiumsulfaat 2,4 g/L, Kaliumchloride 186 mg/L
Super Optimal bouillon met Catabool onderdrukking (SOC)		SOB, 0,4 % glucose
2x Gistextrakt Trypton (2xYT)	BD Difco	244020	Pancreasdigest van Caseïne 16 g/L, Gistextrakt 10 g/L, Gistextrakt 5 g/L
Celopslagmedia			2x YT-bouillon, 15% Glycerol, 2% Glucose
pGESS(E135K)			Een DNA-vector die dmpR, egfp-genen bevat met hun geschikte promotoren, RBS en terminator. Zie de referentie 5 in het manuscript voor meer details.
Chloramfenicol	Sigma	C0378
Ampicilline	Sigma	A9518
BD FACSDiva	Becton Dickinson		Flow Cytometry Software Version 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,0144% Na2HPO4, 0,024% KH2OP4, pH 7,4