Methodenartikel

Rapid Verificatie van Terminators Met behulp van de PGR-Blue Plasmid en Golden Gate Assembly

DOI:

10.3791/54064

⸱

25 april 2016

 ,  , 
1Department of Biology, Ouachita Baptist University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol maakt gebruik van Golden Gate Assembly en de plasmide pGR-blue om snel de sterkte van terminatoren te kwantificeren die in silico gevonden worden.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit protocol is om de snelle verificatie van bioinformatica geïdentificeerde terminators mogelijk te maken. Verder is het plasmide (pGR-Blue) specifiek ontworpen voor dit protocol en maakt het de kwantificering van terminator-efficiëntie mogelijk. Als bewijs van concept werden zes terminators bioinformatica geïdentificeerd in de mycobacteriofaag Bernal13. Eenmaal geïdentificeerd, werden terminators vervolgens gemaakt als oligonucleotiden met de juiste sticky ends en aan elkaar geannealeerd. Met behulp van Golden Gate Assembly (GGA) werden terminators vervolgens gekloneerd in pGR-Blue. Onder zichtbaar licht zien valse positieve kolonies er blauw uit en positief getransformeerde kolonies zijn wit/geel. Na inductie van een arabinose-induceerbare promotor (pBad) met arabinose, kan de koloniaalsterkte worden bepaald door de verhouding te meten van geproduceerd groen fluorescent eiwit (GFP) tot geproduceerd rood fluorescent eiwit (RFP). Met pGR-Blue kan het protocol in slechts drie dagen worden voltooid en is het ideaal in een educatieve omgeving. Bovendien tonen de resultaten aan dat dit protocol nuttig is als middel om in silico voorspellingen van terminator-efficiëntie te begrijpen met betrekking tot de regulatie van transcriptie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grote projecten in de synthetische biologie vereisen het gebruik van zeer effectieve transcriptie-terminators om de genexpressie te reguleren. Identificatie van nieuwe terminators vereist bioinformatica-analyse van nieuwe genomen. Echter, naarmate er steeds meer bioinformatica-software wordt ontwikkeld, elk met een uniek algoritme voor voorspelling, ontstaan er meer verschillen tussen de veronderstelde resultaten. Omdat dit proces enigszins subjectief is en in silico wordt uitgevoerd, hebben deze voorspellingen biologische bevestiging nodig.1 Bovendien vereist de hoeveelheid veronderstelde terminators die door in-silico analyse zijn geïdentificeerd, het gebruik van kloneringsstrategieën die in een relatief korte tijd kunnen worden voltooid.

De PGR-Blue plasmide is een aanpassing van de PGR plasmide die is herontworpen om Golden Gate Assembly (GGA) te gebruiken om de kloneringsprocedure te vereenvoudigen door alle reactiestappen tegelijkertijd in één microcentrifugebuis uit te voeren.2,3 Kleurselectie werd in de plasmide opgenomen om het gemakkelijker te maken om positieve koloniën te identificeren. Een succesvolle ligatie zou wit/geel moeten zijn in zichtbaar licht en groen moeten fluoresceren onder blauw (450 nm) of ultraviolet (UV) licht wanneer gekweekt op platen die arabinose bevatten. Omdat ongesneden pGR-blue een blauw chromoproteïne (amilCP) bevat, zijn koloniën die een ongewijzigde plasmide bevatten blauw onder zichtbaar licht. Deze vereenvoudiging en het gestroomlijnde protocol stellen onderzoekers in staat om binnen drie tot vier dagen door te gaan van bioinformatica-identificatie naar biologische bevestiging. De ontwerpaard van dit systeem kan zowel in het onderzoekslab als in educatieve omgevingen gunstig zijn.

De pGR-Blue plasmide maakt kwantificering van de terminatorsterkte mogelijk.4 Een enkele arabinose-inductible promotor wordt gebruikt om groen fluorescent proteïne (GFP) en rood fluorescent proteïne (RFP) te produceren. De terminator wordt gekloond in de plasmide na de GFP-sequentie maar vóór de RFP-sequentie, waardoor de transcriptie van het RFP-proteïne wordt gestopt. De sterkte van de terminator wordt bepaald door de verhouding van geproduceerd GFP tot geproduceerd RFP.

Het Vision and Change5 rapport suggereerde dat Science, Technology, Engineering and Math (STEM) onderwijs onderzoeksgerichte ervaringen in de klas zou moeten opnemen.6 Dit vereist echter de ontwikkeling van protocollen die door studenten met beperkte vaardigheden in een gedefinieerde tijdsperiode kunnen worden uitgevoerd. Hoewel het protocol in slechts drie dagen kan worden voltooid, is het ook zo ontworpen dat elke grote stap in een afzonderlijke wekelijkse (2-3 uur) labperiode kan worden voltooid om een Course Research Experience (CRE) te creëren. Wanneer op deze manier gebruikt, zal de procedure tussen de drie en zes weken duren en is geschikt voor zowel inleidende als geavanceerde cursussen in Genetica, Celbiologie of Bioinformatica.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Het ontwerpen en bestellen Oligonucleotiden met de juiste Sticky Ends

  1. Identificeren van potentiële rho-onafhankelijke terminators door middel van genomische analyse met behulp van programma's die online vrij beschikbaar. 7
  2. Bij het ​​werken met dubbelstrengig DNA, bepaalt de oriëntatie van de terminator te testen. 7 De PGR-Blue plasmide wordt alleen gecontroleerd terminators geligeerd in de 5 'tot 3' richting op de bovenste (voorwaartse streng).
    1. Omzetten van een bodem (omgekeerde) streng terminator zijn teruggedraaid aanvulling op de reeks heroriënteren voor het testen in PGR-Blue met behulp van gratis online software, bijvoorbeeld, aap.
  3. Nadat de oriëntatie bepaald correct is, voeg de sticky end "5'-CGAC-3 '" het 5' uiteinde van de bovenste streng. Voeg het kleverig einde "5'-CCGC-3 '" aan het 5'-uiteinde van de onderste streng. 8 Hierdoor zullen geligeerd inzetstuk in de juiste ingevoegdoriënteren met behulp van GGA.
  4. Zodra sequenties worden bepaald, te gelasten enkelstrengs oligonucleotiden commercieel.

2. gloeien Oligonucleotiden (geldt alleen voor gevriesdroogde DNA)

  1. Resuspendeer individuele oligonucleotiden nuclease vrij water tot een concentratie van 100 uM.
  2. Voeg 10x annealing buffer: 1 M NaCI en 100 mM Tris-HCl pH 7,4. Annealing buffer kan meerdere weken bewaard bij 4 ° C. Zodra annealing buffer gemaakt en oligonucleotiden worden geresuspendeerd, begint het gloeien 8.
  3. Voor elke terminator te testen, voeg 16 ul van ultrazuiver water om een ​​1,5 ml microcentrifugebuis.
  4. Voeg 2 pl 10x annealing buffer aan elke microcentrifugebuis.
  5. Voeg 1 pl van de bovenste streng oligonucleotide (100 uM) van het gewenste terminator.
  6. Voeg 1 pl van de onderste streng oligonucleotide (100 uM) van het gewenste terminator.
  7. Maak een kokend water bath met behulp van een 1000 ml beker die ongeveer 400 ml water uit de kraan en leg ze op een hete plaat.
  8. Plaats de microcentrifugebuizen uit stap 2.6 in een vlotter en kook 4 min. Na 4 min, zet het vuur bord, maar laat de buis en drijven in het waterbad langzaam afkoelen O / N (18 uur) 8. Bewaar de gegloeide terminators bij -20 ° C.

3. Golden Gate Assembly (Standard Mix - Cost Efficient)

  1. Maak een 40 nm verdunning van de gegloeide terminators. Voeg 124 gl nuclease vrij water tot 1 pl versmolten terminators mengsel (100 uM).
    1. Centrifuge monsters gedurende 30 seconden bij 10.000 xg en bewaar op ijs.
  2. In een nieuwe buis geschikt is voor de thermocycler wordt gebruikt, voeg 6 ul van nuclease vrij water.
  3. Voeg 1 pl commerciële DNA Ligase buffer [300 mM Tris-HCl (pH 7,7-7,8), 100 mM MgCl2, 100 mM DTT en 10 mM ATP]. Voer alle volgende stappen op ijs.
  4. Toevoegen1 pl PGR-Blue (35-50 ng / ul) plasmide bestemming aan de microcentrifugebuis.
  5. Voeg 1 pl van de 40 nM uitgegloeid afsluitweerstanden aan de microcentrifugebuis.
  6. Voeg 0,5 ul commerciële high-fidelity BsaI restrictie endonuclease om de microcentrifugebuis.
  7. Voeg 0,5 pl commerciële DNA ligase aan de microcentrifugebuis.
  8. Centrifugeer het reactiemengsel bij 10.000 xg gedurende 120 sec. Plaats vervolgens de buis rechtstreeks in de thermocycler.
  9. Voer het thermocycler programma: 20 cycli van 1 min bij 37 ° C gevolgd door 1 min bij 16 ° C, gevolgd door 1 cyclus van 15 minuten bij 37 ° C. Gebruik monsters direct of vries en bewaar bij -20 ° C. 8

4. Golden Gate Assembly (Commercial Master Mix - Time Efficient)

  1. Voeg 124 ul van nuclease vrij water tot 1 pl van de 100 uM onthard terminators gemaakt in stap 2. Deze verdunt de terminator DNA-concentratie tot 40 nM.Voer deze stap in een nieuwe gelabelde 1,5 ml microcentrifugebuis.
  2. In een nieuwe buis geschikt is voor de thermocycler, voeg 14 ul van nuclease vrij water. Zorg ervoor dat de nieuwe buis dienovereenkomstig gelabeld.
  3. Voeg 2 pl Commercial Master Mix Buffer aan de microcentrifugebuis.
  4. Voeg 1 pl PGR-Blue plasmide (35-50 ng / ul) aan de microcentrifugebuis.
  5. Voeg 2 ul van het 40 nM uitgegloeid afsluitweerstanden aan de microcentrifugebuis.
  6. Voeg 1 ui van Commercial Master Mix aan de microcentrifugebuis.
  7. Centrifugeer de 40 nM buis bij 10.000 xg gedurende 120 sec. Plaats vervolgens de buis rechtstreeks in de thermocycler.
  8. Voer het thermocycler programma: 1 cyclus van 60 minuten bij 37 ° C gevolgd door 1 cyclus van 15 minuten bij 55 ° C. Gebruik monsters direct of vries en bewaar bij -20 ° C.

5. Transformatie en Colony Selection

  1. Bereid Luria Base (LB) agar Petri platen die 1 mM concentration ampicilline (Amp) en een 10 mM concentratie van arabinose (ARB). Maak minstens 10 ml 1 M L -arabinose voorraadoplossing omdat deze voorraadoplossing worden gebruikt in latere stappen.
  2. Gebruik een hoog-efficiënte (10 augustus-10 september transformanten / ug) chemisch competente E. coli (JM109) cellen voor transformatie. 9 voor het beste resultaat voeg 3-5 ul van de ligatiereactie 50 pi competente cellen. Bij gebruik van chemisch competente cellen, volgt de transformatie protocol specifiek voor de cellen die worden gebruikt.
  3. Spread helft (25 pl) van de getransformeerde cellen op voorverwarmd LB (Amp / arb) agarplaten met een steriel L-vormige "hockey stick" en incubeer O / N bij 37 ° C. Door hoge snelheid van afbraak van ampicilline, niet incuberen bij 37 ° C gedurende 24 uur.
  4. Voer kolonie selectie op basis van kleur door visuele inspectie. Een succesvolle ligatie moet wit / geel in zichtbaar licht en fluoresceren groene under blauw (450 nm) of UV-licht. 20 uur - een mislukte ligatie zal een kolonie die is blauw van kleur onder zichtbaar licht na 18 te produceren.

6. Controle en kwantificering van Terminator

  1. Bereid 5 ml steriel LB-bouillon buizen met 1 mM ampicilline en 10 mM arabinose. Het aantal buizen nodig is afhankelijk van het aantal terminators getest plus controles (cellen met ampicillineresistentie die niet fluoresceren en cellen die de ongesneden PGR-Blue plasmide).
  2. Onder zichtbaar licht pick 2-3 wit / geel kolonies (stap 5.4) met behulp van een steriele lus. Laat de monsters te incuberen in bouillon op een schudinrichting bij 37 ° C en 160 rpm gedurende 16-18 uur. Mis deze monsters niet incubeer gedurende meer dan 24 uur.
    1. Gebruik desgewenst een spectrofotometer optische celdichtheid te bepalen bij 600 nm (OD 600) voldoende celgroei waarborgen. In het algemeen, een OD 600 van ~ 0,8-1,0 waargenomen na 16-18 h groei.
  3. Gebruikeneen steriele 96-putjes plaat voor de resterende stappen. Het uitvoeren van deze stappen in een aseptische omgeving en in drievoud. Voeg 199 ul steriel LB + Amp / arabinose bouillon (1 mM ampicilline / 10 mM arabinose) in elk putje. Onder meer ruimte op het bord voor drie afzonderlijke controles.
    1. Gebruik de volgende drie knoppen: Een goed (1) met LB + Amp / arabinose bouillon alleen en een goed (2) voor niet-getransformeerde competente cellen (blanco) om te dienen als een blanco. Voor kwantificering (3) van de terminator sterkte, cellen die ongesneden originele PGR of met PGR-Blue geligeerd met een niet-beëindiging sequentie worden opgenomen (referentiesignaal voor de kwantificering). Zie figuur 1 voor plaatlezer lay-out.
  4. Pipet 1 pi van de celoplossing van de O / N bouillon in afzonderlijke putjes van de 96-well plaat.
  5. Seal-platen met een ademende deksel en schud gedurende 18-20 uur bij 37 ° C en 160 rpm.
  6. Met behulp van een plaat lezer, bepalen OD 600 door het lezenabsorptie bij 600 nm. Meet GFP fluorescentie als volgt: 395 excitatie en emissie 509. Meet RFP fluorescentie als volgt: 575 excitatie en emissie 605. Na 18-20 uur, dient de OD 600 ongeveer 0,5 zijn.
  7. Om te normaliseren voor variatie in groei, gebruik maken van de vergelijking: figure-protocol-1 voor zowel GFP en RFP.
  8. Na normalisatie Bepaal relatieve sterkte terminator met de vergelijking figure-protocol-2

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol cellen die PGR-Blauw met een terminator geligeerd tussen GFP en RFP behulp Golden Gate Samenstel (figuur 2) te produceren. Positieve kolonies die geligeerd insert kan worden geselecteerd op basis van kleur. In zichtbaar licht zal positieve kolonies wit / geel en valse positieven zal blauwe kolonies produceren na 18-20 uur incubatie bij 37 ° C (figuur 3).

Na kolonie selectie, kan e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De belangrijkste stap in dit protocol is de juiste oligonucleotide ontwerp voorafgaand aan de bestelling. De oligonucleotiden moet de juiste sticky ends toegevoegd aan de 5 'einden van zowel de bovenste en onderste strengen zodat GGA opname mogelijk. Bovendien is het belangrijk om de oriëntatie van links gerichte terminators (terminators die transcriptie op de onderste streng te stoppen) te veranderen overeenkomstig recht tegenover (eindigt transcriptie op de bovenste streng) terminatoren omdat GFP en RFP expressie ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auteurs willen graag Malcolm Campbell en Todd Eckdahl erkennen met de Genome Consortium voor Active Teaching (GCAT) en de HHMI-Science Education Alliance - Phage Jagers Voortschrijdende Genomics en Evolutionaire Science programma (SEA-fagen).

Dit project werd ondersteund door subsidies van het National Center for Research Resources (P20RR016460) en het National Institute of General Medical Sciences (P20GM103429) van de National Institutes of Health. Dit onderzoek werd mede ondersteund door de National Science Foundation in het kader van subsidie ​​# IIA-1457888. Daarnaast institutionele (Ouachita Baptist University) fondsen werden verstrekt door de JD Patterson Summer Research Fellowship.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
pGR-Blue PlasmidAddgene68374
pGR-PlasmidAddgene46002
AeraSeal-(Steriele vellen)Excel ScientificBS-25Alleen steriele vellen
10x T4 DNA ligase BufferNEB
BsaI-HFNEBR3535SHet niet-HF enzym werkt, maar is minder hittebestendig. 
NEB Golden Gate Assembly MixNEBE1600SCommerciële Master Mix waarnaar wordt verwezen in het protocol.
T4 DNA ligaseNEBM0202S
Rond Microcentrifuge drijvend rekNova Tech InternationalF18875-6401
Ampicilline natriumzoutSigma AldrichA9518
L-(+)-ArabinoseSigma AldrichA-3256D-Arabinose zal het pBAD-promotore niet induceren
Luria Base (LB) - Broth, MillerSigma AldrichL1900
Luria Base (LB) - Agar, MillerSigma AldrichL2025
Tecan-Infinite M200 Plate ReaderTecan
Mix & Go Competent Cells - Strain JM109Zymo ResearchT3005Gebruik het aanbevolen transformatieprotocol van het bedrijf
ApE: een plasmide-editor-softwarehttp://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
Tris-HCl, Molecular GradePromegaH5121
Natriumchloride (Kristallijn/Biologisch, Gecertificeerd)Fisher ChemicalS671
Commerciële oligonucleotide syntheseIntegrated DNA Technologies (IDT)http://www.idtdna.com/site
Microtest Tissue Culture Plates - 96 well (Steriele)Falcon35-3072
mycobacteriophage "Bernal13"GenebankKJ510413
Nuclease Vrije WaterIntegrated DNA Technologies (IDT)IDT004
Steriele, L-vormige Hockey-Stick CellLife Science Products6444-S1
Nano-Drop 2000c UV-Vis SpectrometerThermo Scientific2000c
ARNold: een webtool voor de voorspelling van Rho-onafhankelijke transcriptie-terminators.http://rna.igmors.u-psud.fr/

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, J., Zhang, Y. Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression. Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).
  2. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647(2008).
  3. Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043(2013).
  4. Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
  5. Woodin, T., Carter, V. C., Fletcher, L. Vision and change in biology undergraduate education, a call for action--initial responses. CBE Life Sci Educ. 9 (2), 71-73 (2010).
  6. Vasaly, H. L., Feser, J., Lettrich, M. D., Correa, K., Denniston, K. J. Vision and change in the biology community: snapshots of change. CBE Life Sci Educ. 13 (1), 16-20 (2014).
  7. Naville, M., Ghuillot-Gaudeffroy, A., Marchais, A., Gautheret, D. ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. RNA Biol. 8 (1), 11-13 (2011).
  8. Campbell, A. M., et al. pClone: Synthetic Biology Tool Makes Promoter Research Accessible to Beginning Biology Students. CBE Life Sci Educ. 13 (2), 285-296 (2014).
  9. Rhee, J. I., et al. Influence of the medium composition and plasmid combination on the growth of recombinant Escherichia coli JM109 and on the production of the fusion protein EcoRI::SPA. J Biotechnol. 55 (2), 69-83 (1997).
  10. Dirla, S., Chien, J. Y., Schleif, R. Constitutive mutations in the Escherichia coli AraC protein. J Bacteriol. 191 (8), 2668-2674 (2009).
  11. Schleif, R. Regulation of the L-arabinose operon of Escherichia coli. Trends Genet. 16 (12), 559-565 (2000).
  12. Kosuri, S., et al. Composability of regulatory sequences controlling transcription and translation in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 14024-14029 (2013).
  13. Sharon, E., et al. Inferring gene regulatory logic from high-throughput measurements of thousands of systematically designed promoters. Nat Biotechnol. 30 (6), 521-530 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Verificatie van terminatorenkwantificering van terminatorsterktebio informatische identificatie van terminatorenannealing van oligonucleotidenanalyse van fluorescentieverhoudingenkleurscreening van koloniesarabinose induceerbare promotorGFP RFP normalisatie

Gerelateerde artikelen