Isolatie en Cellulaire fenotypering van mesenchymale stamcellen afkomstig van de gewrichtsvloeistof en beenmerg van minivarkens

Samenvatting

Een protocol dat mesenchymale stamcellen (MSC's) vaststelt die geïsoleerd zijn uit de synoviale vloeistof en het beenmerg van minivarkens en op niet-invasieve wijze verzameld worden met behulp van het afzuigapparaat van een spuit, wordt gepresenteerd. Cellulair fenotypen werd uitgevoerd met behulp van flowcytometrie na celisolatie en in vitro cultivatie van beenmerg en synoviale vloeistoffen afgeleid van MSC's.

Samenvatting

Mesenchymale stamcellen (MSC's) zijn vastgesteld na isolatie uit verschillende weefselbronnen, waaronder beenmerg en synoviaal vocht. Onlangs werd gemeld dat uit synoviaal vocht afgeleide MSC's multi-lineage differentiatiepotentieel en immunomodulerende eigenschappen hebben, wat aangeeft dat deze cellen kunnen worden gebruikt voor weefselengineering en systemische behandelingen. Deze studie presenteert een protocol voor eenvoudige en niet-invasieve isolatie van MSC's afgeleid van het beenmerg en het synoviaal vocht van minivarkens om celoppervlaktemarkers te analyseren voor celfenotypering en in vitro cultivering. Met behulp van seksueel volwassen zes maanden oude minivarkens werd het beenmerg uit de iliacale kam van het bot geëxtraheerd met behulp van een beenmergextractor, en het synoviaal vocht werd afgezogen uit het femorotibiale gewricht. Procedures voor het verzamelen van monsters uit beide bronnen waren niet-invasief. De protocollen voor effectieve isolatie van MSC's uit geoogste celbronnen en voor het creëren van in vitro kweekomstandigheden om stabiele MSC's van minivarkens te expanderen en de toepassing van systemische autologe behandelingen worden geboden. Voor celfenotypering werden de celoppervlaktemarkers van beide cellen geanalyseerd met behulp van flowcytometrie. In de resultaten werden de MSC's geïsoleerd uit het synoviaal vocht van de minivarkens en bleek dat uit synoviaal vocht afgeleide MSC's een vergelijkbare morfologie en celfenotype hebben als uit beenmerg afgeleide MSC's. Daarom is niet-invasief verkregen synoviaal vocht een waardevolle bron van MSC's.

Inleiding

Multipotente mesenchymale stamcellen (MSC's) kunnen worden ingedeeld in mesenchymale celstammen en MSC's zijn gevestigd en geïsoleerd uit verschillende weefselbronnen, zoals beenmerg, navelsnoeren, placenta's, vetweefsel, dermale huid, skeletspieren, haarzakjes, synoviale membranen en tanden^1-5. Momenteel is de aandacht uitgegaan naar synoviale MSC's omdat deze cellen kunnen helpen bij de behandeling van gewrichtsaandoeningen, zoals botfractuur, artrose en reumatoïde artritis (RA), en vanwege het regeneratieve potentieel van MSC's in beschadigd kraakbeen of bot, kunnen ze ook helpen bij de behandeling van immuunmodulatie of auto-immuunziekten^6-8. De meeste onderzoeken naar MSC's afkomstig uit synoviale bronnen hebben gebruik gemaakt van MSC's van het synoviale membraan in plaats van uit synoviaalvocht^2,9; dus het biologische begrip van uit synoviaalvocht afkomstige MSC's is beperkt.

Synoviaalvocht is een gemakkelijk toegankelijke bron van MSC's, die kan worden afgezogen tijdens de diagnose of behandeling van patiënten en tijdens diagnostische bevestigingen van verschillende artritisaandoeningen die geen invasieve procedures vereisen, zoals artrose of RA. De populatie van uit synoviaalvocht afkomstige MSC's in de gewrichtsholte is significant verhoogd bij artritispatiënten in vergelijking met niet-artritispatiënten^10-12. Daarom is synoviaalvocht een uitstekende bronkandidaat voor MSC's, met name voor autologe stamceltherapie bij patiënten met ontstoken of gewonde gewrichten. Bovendien hebben uit synoviaalvocht afkomstige MSC's een chondrogene capaciteit, immunomodulerende eigenschappen en een hoge proliferatiesnelheid. Dit onderzoek heeft protocollen vastgesteld voor beenmergextractie en synoviaalvochtafzuiging van minivarkens met behulp van niet-invasieve methoden en voor de in vitro expansie van geïsoleerde cellen en analyse van celfenotypen.

Protocol

Dierproeven werden goedgekeurd door de Animal Center for Biomedical Experimentation aan Gyeongsang National University.

1. De voorbereidingen voor de Animal Procedure

1. Bereid de volwassen vrouwelijke minivarkens voor de niet-invasieve verzameling MSCs uit beenmerg en synoviaal vocht. Voer het klinisch onderzoek van de minivarkens een dag voorafgaand aan de anesthesie en monstername.
   1. Zorg voor klinisch normale dieren voor lichamelijke onderzoeken, die de lichaamstemperatuur, ademhaling en hartslag, en voor de observatie van de varkens 'gedrag en hematologische status omvatten, met behulp van volledig bloedonderzoek testen.
      Opmerking: Parameter intervallen voor klinisch gezond minivarkens zijn 11-29 / min voor de ademhalingsfrequentie, 68-98 / min voor de hartslag en 37-38 ° C voor de lichaamstemperatuur.
2. Verwijder al eetbaar strooisel uit de kooi tijdens de pre-operatieve periode van vasten van 6-12 uur prior aan de administratie van de anesthesie voor jonge en volwassen minivarkens, moeten 3 uur van vasten in acht worden genomen voor de pasgeborenen. Leveren drinkwater tot de tijd van de anesthesie.

2. Voorbereiding van de dieren voor Anesthesie

1. Medicijnen de minivarkens voor toediening van anesthesie met acepromazine (0,1 mg / kg), medetomidine (0,03 mg / kg), en atropine (0,04 mg / kg).
   1. Injecteer medicatie intramusculair (IM) met een 21 G naald met een lengte van minimaal 30 mm voor volwassen varkens. Voer de IM injectie 1-3 cm achter het oor in de laterale cervicale spier of in de dijspier.
      Opmerking: Voer alle procedures zonder het opwekken van angst of stress bij de dieren of die ruwe behandeling om veilig te injecteren de premedicatie.
2. Plaats de mini varkens in een dorsale-liggende positie.
3. Vijftien minuten na de toediening van de premedicatie, initiëren anesthesie met behulp van 1,5% isofluraan adminmeldden zich bij inademing.
   1. Verdere inademing van isofluraan (1,5%) door een endotracheale buis, gevolgd door een toename van de concentratie tot 2,5%, met zuurstof (1,5 l / min) als draaggas.
4. Permanent toezicht op de hartslag, lichaamstemperatuur, en percutane bloed zuurstofverzadiging (SpO ₂₎ van de minivarkens tijdens anesthesie. Gebruik een circulerende water deken bij een temperatuur van 38-39 ° C tot lichaamstemperatuur te handhaven. Breng een oogheelkundig zalf om de ogen te beschermen tegen uitdroging tijdens de anesthesie.
5. Volg Guedel's indeling om de diepte van de anesthesie ¹³ te beoordelen.

3. Voorbereidingen voor Cell Isolatie en Teelt

1. De MSCs afgeleid van beenmerg en synoviaal vocht cultiveren, bereiden 500 ml advanced Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (ADMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% Glutamax, 10 ng / ml basische fibroblast growth factor (bFGF), en 1,0% penicilline-streptomycine (10.000 IE en 10.000 pg / ml, Pen-Strep).
   1. Incubeer de ADMEM bij 38,5 ° C in een bevochtigde atmosfeer van _5% CO2 in een _CO2 incubator.
2. Bereid 500 ml Dulbecco's fosfaat- gebufferde zoutoplossing (DPBS) volgens de instructies van de fabrikant voor celisolatie en wassen.

4. Het verzamelen van beenmerg van de minivarkens

1. Selecteer een gebied van ongeveer 15 x 15 cm groot op het bekken (figuur 1) en verwijder het haar van dit gebied met behulp van gesteriliseerde veiligheid scheerapparaten of elektrische tondeuse. Zodra de minipig gepositioneerd, afwisselend scrub de procedure ter driemaal met de volgende sterilisatiemiddelen: povidon jodium en 70% ethanol. Nadat het gebied is goed droog, gelden steriele doeken.
2. Voorbekleding de 10 ml spuit met 100 U / ml heparine door spoelen met 3-4 ml heparine voor ejecting anti-coagulatiemiddel.
   Let op: Voer deze stap om stolling in de spuit tijdens beenmergpunctie te voorkomen.
3. Extract minstens 5 ml van beenmerg uit het bekken bot van de minipig onder anesthesie, met een beenmerg extractor (3,0 x 100 mm) stevig aan heparine voorbekleed 10 ml spuit.

5. Isolatie van cellen uit het beenmerg en in vitro Teelt

1. Isoleer de cellen van de geëxtraheerde beenmerg.
   1. Verdun het beenmerg geëxtraheerd met een gelijk volume van DPBS in een 15 ml conische buis bij kamertemperatuur.
   2. Voeg 3 ml dichtheidscentrifugatie media (Ficoll-Paque) aan de 15 ml conische buis.
   3. Verdun een 4 ml laag van het beenmerg met DPBS, dat op de dichtheid centrifugatie medium zonder menging wordt geplaatst en Centrifugeer bij 400 xg gedurende 40 min bij kamertemperatuur.
   4. Oogst de laag van mononucleaire cellen(MNC) van de bufferlaag tussen de twee lagen die de plasma (bovenlaag) en de dichtheid centrifugatie media (onderste laag) en breng de MNCs in een 15 ml conische buis.
   5. Verdun het overgedragen MDL met 7-8 ml DPBS en centrifugeer ze bij 500 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en was de cellen tweemaal met DPBS.
   6. Suspendeer de celpellet in 2 ml ADMEM en overbrengen naar een 35 mm weefselkweekplaat. Incubeer de kweekschaal bij 38,5 ° C in een bevochtigde atmosfeer van _5% CO2.
2. In vitro kweken van cellen die zijn geïsoleerd uit beenmerg.
   1. Na 48 uur, zuig het medium met de cellen die niet aan de schaal en plaats 2 ml van de ADMEM en incubeer deze bij 38,5 ° C in een bevochtigde atmosfeer van _5% CO2. Verander het medium om de drie dagen.
   2. Bij 70-80% confluentie was de cellen met DPBS, dissociëren ze met 1 ml 0,25%trypsine / EDTA en incubeer ze op 37 ° C gedurende 3-5 minuten totdat de cellen los.
   3. Oogst de cellen met behulp van 10 ml ADMEM, overbrengen naar een 15 ml conische buis en centrifugeer ze bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant.
   4. Suspendeer de cellen geoogst in 1 ml verse ADMEM en tellen met een hemocytometer.
   5. Plaats de cellen in een 5-7,5 x 10 ⁵ / 25T kolf met 4 ml ADMEM en incubeer ze op 38,5 ° C in een bevochtigde atmosfeer van _5% CO2. Verander het medium elke derde dag.

6. Het verzamelen van de gewrichtsvloeistof uit de minivarkens

1. Net als bij de procedure voor het beenmerg aspiratie, selecteert u de juiste oppervlakte van ongeveer 15 x 10 cm (lengte / breedte) over de femorale gewricht, en verwijder het haar met behulp van gesteriliseerde veiligheid scheerapparaten of elektrische tondeuse, te volgen door sanering procedures (stap 4.1).
2. Plaats een 3 ml spuit met een 23 Gnaald in het gewricht na de palpatie monumenten (knieschijf en scheenbeen kuif).
   1. Solliciteer zachte zuigkracht naar de spuiten voor het streven van de gewrichtsvloeistof in het gewricht. Het geschatte hoeveelheid gewrichtsvloeistof vanuit een gewricht 0,5-1 ml, maar afhankelijk van de grootte van de minipig of gewricht. Doorspoelen DPBS in de synoviale holte wanneer het verzamelde volume van de gewrichtsvloeistof te klein.
   2. Onmiddellijk terug te trekken van de spuit om besmetting met bloed voorkomen.

7. Cel Isolatie van de Verzamelde gewrichtsvloeistof en in vitro Teelt

1. Isoleer de cellen van de synoviale vloeistof afgezogen.
   1. Verdun de afgezogen synoviale vloeistof met een gelijk volume van DPBS in een 15 ml conische buis bij kamertemperatuur.
   2. Om vuil te verwijderen, filteren de verdunde gewrichtsvloeistof met behulp van een 40 pm nylon cel zeef.
   3. Voeg 10 ml van DPBS om de buis met het gefilterde synovialevloeistof en Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en was de cellen tweemaal met DPBS.
   4. Suspendeer de celpellet in 2 ml ADMEM, plaatst de cellen op een 2-3 x 10 ⁵ cellen / 35 mm weefselkweekplaat met 2 ml ADMEM en incubeer ze op 38,5 ° C in een bevochtigde atmosfeer van _5% CO2 .
2. Herhaal stap 5.2 voor de in vitro kweek van geïsoleerde synoviale vloeistof afgeleide MSCs.

8. Post-procedure Onderhoud van de minivarkens

1. Indien nodig, sluit de huid op het beenmerg extractor injectieplaats met een hechtdraad met een huid nietmachine, na beenmergafname.
2. Nadat de procedure is voltooid, bestuurt een intramusculaire injectie enrofloxacine (5 mg / kg) en meloxicam (0,2 mg / kg) aan de minivarkens keer per dag gedurende 3 dagen.
3. Nadat de procedure is voltooid, desinfecteren beenmerg en synoviaal vocht verzamelplaatsmet 0,1% povidonjodium eenmaal daags gedurende 3 dagen. Zorgvuldig te observeren dagelijks te controleren op tekenen van complicaties (zoals zwelling, pus of roodheid).

9. Cel Fenotypering Met behulp van flowcytometrie

1. Wanneer de MSC's zijn 70-80% confluent bij passages 3-5, was de cellen met DPBS en te behandelen met 1 ml 0,25% (v / v) trypsine / EDTA. Dan, incubeer ze op 37 ° C gedurende 3-5 minuten totdat de cellen worden losgemaakt.
2. Oogst de cellen met behulp van 10 ml van DPBS, overbrengen naar een 15 ml conische buis en centrifugeer ze bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi de bovenstaande oplossing.
3. Om de cellen te bevestigen, schorsen de celpellet in 10 ml van een 3,7% formaldehyde-oplossing en bewaar ze bij 4 ° C gedurende één dag vóór de analyse.
   1. Een dag na de vaststelling, was de cellen met DPBS tweemaal met behulp van centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten per keer. Gooi de bovenstaande oplossing.
   2. Suspendeer de celpellet in 4 mlDPBS, dat wordt aangevuld met 1% (w / v) runderserumalbumine (BSA), en incubeer de pellet gedurende 1 uur bij 4 ° C om niet-specifieke Fc-gemedieerde interacties te blokkeren.
   3. Verdeel 500 ul aliquots van de celsuspensie in 1,5 ml buizen.
   4. Voor niet-geconjugeerde antilichamen (CD29 en vimentine), was de cellen door centrifugatie bij 300 x g gedurende 3 minuten. Gooi de bovenstaande oplossing.
   5. Suspendeer de celpellet in 500 ui van een 1: 100 verdunning van het primaire antilichaam en incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C.
   6. Was de cellen tweemaal met 1% runderserumalbumine door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten elke keer. Gooi de bovenstaande oplossing.
   7. Suspendeer de celpellet in 500 ui van een 1: 100 verdunning van het fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) geconjugeerd secundair antilichaam en incubeer gedurende 1 uur in het donker bij 4 ° C.
4. Voor de FITC-geconjugeerde antilichamen (isotype, CD34, CD44 en CD45), was de cellen door centrifugaleking bij 300 x g gedurende 3 minuten. Gooi de bovenstaande oplossing.
   1. Suspendeer de celpellet in 500 ui van de 1: 100 FITC-geconjugeerd antilichaam en incubeer gedurende 1 uur in het donker bij 4 ° C.
   2. Voor beide kleuring omstandigheden was de cellen tweemaal met DPBS door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten elke keer. Gooi de bovenstaande oplossing.
   3. Suspendeer de cellen in 500 gl DPBS, overbrengen naar een 5 ml rondbodem buis en analyseren van de resultaten met een flow cytometer ^8.

Resultaten

Oprichting van MSC's Afgeleid van het beenmerg en gewrichtsvloeistof van minivarkens

MSCs werden succesvol geïsoleerd uit het beenmerg en articulaire synoviale gewrichten van de minivarkens en uitgebreid in vitro (figuur 2). Injectiespuit aspiratie van gewrichtsvloeistof is eenvoudig en is het mogelijk om voldoende hechtende cellen in in vitro kweek van de primaire cellen...

Discussie

Minivarkens werden gebruikt om MSC isolatie stellen uit beenmerg en synoviaal vocht. Om verschillende fysiologische omstandigheden, zoals leeftijd, geslacht en ziekte uit te roeien, minivarkens van isogene achtergrond donoren werden gekozen om de celbron afhankelijke karakterisering accuraat evalueren. Varkens is bekend dat anatomisch, fysiologisch en genetisch vergelijkbaar met de mens, in het bijzonder, kan minivarkens grootte aangepast organen te produceren; Daarom kunnen ze worden gebruikt als vervanging donor soort...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Advanced Dulbecco’s modified Eagle medium (ADMEM)	Gibco	12491-023	MSC cultuurmedium
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	14190-144	Celwassingmedium, vrij van Ca2+/Mg2+
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	16000-044	Onderdeel van MSCs medium
Glutamax	Gibco	35050-061	Onderdeel van MSCs medium
Penicillin/streptomycin	Gibco	10378-016	Onderdeel van MSCs medium
Basic fibroblast growth factor (bFGF)	Simga	F0291	Onderdeel van MSCs medium
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A6003	Onderdeel van MSCs medium
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072	Celdissociatiereagens
β-mercaptoethanol	Sigma	M7522	Onderdeel van MSCs medium
Isotype antibody	BD Pharmingen	BD 550616	Isotype Controle
CD29 antibody	BD Pharmingen	BD 552369	Integrine beta-1 MSCs marker
CD44 antibody	BD Pharmingen	BD 553133	Celoppervlak glycoproteïne MSCs marker
CD45 antibody	BD Pharmingen	BD 340664	Hematopoëtische stamcellen marker
CD34 antibody	BD Pharmingen	BD 555821	Hematopoëtische stamcellen marker
CD90 antibody	BD Pharmingen	BD 555595	Thy-1 membraanglycoproteïne MSCs marker
MHC Class II antibody	Santa Cruz	SC-32247	Antigeenpresenterende cellen marker
Vimentin antibody	Sigma	Sigma-S6389	Type III intermediaire filament MSCs marker
Alkaline phosphatase	Promega	S3841	Mengsel van 5-broom-4-chloor-3-indolyl-fosfaat (BCIP) en nitro blauw tetrazoliium (NBT)
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02	Dichtheidsgradientencentrifugatie
Cell strainer	BD Falcon	352340	40 µm nylon celfilter
15-ml polystyreen conische buis	BD Falcon	351095	Staalcollectie en celisolatie
35 mm schotels	Nunc	153066	Celcultuurschaal
Beenmerg extractor	GmbH Medizintechnologie, Germany	1145-1W010	TrokaBone, 3.0 x 100 mm
Hematocrietkamer	Marinfeld	640130	Celtellingskamer
Atropine	Jeil Pharmaceutical Co, South Korea		Atropine sulfaat Hydraat
Acepromazine	Samu Median, South Korea		Pre-anesthetisch kalmerend en anti-emetisch medicijn
Medetomidine	Pfizer		Anesthetisch en analgetisch medicijn
Enrofloxacin	Bayer Healthcare, Germany		Antibiotica
Meloxicam	Over Veterinary Medicine, Argentinië		Ontstekingsremmend en analgetisch medicijn
Isoflurane	Hana pharm, South Korea		Inhalatieanesthesie
Povidon jodium	Korea Pharma, South Korea		Steriliserend middel
Ethanol	Sigma	E7023	Steriliserend middel
Heparine	Sigma	H3393	Antistollingsmiddel
Formaldehyde	Sigma	F8775	Celfixatiemiddel
Ophthalmologisch zalf	Pfizer		Oxytetracycline HCl met polymyxine B sulfaat
Circulerend waterdeken	Gaymar Industries		Verwarmingssysteem tijdens en na anesthesie
Huidnaaldapparaat	Covidien, USA		Hechting sluiting huid
CO2 Incubator	Thermo Forma	3111	Celcultuurapparatuur
Flow cytometer	BD Biosciences		Celanalysator
Minipig	PWG Genetics Korea, Ltd.	T-type	Miniatuurvarken