Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Modelleren van myotone dystrofie 1 in C2C12 myoblastcellen

15.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54078

⸱

29 juli 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology and Biochemistry, University of Houston, 2Department of Economics, University of Houston, 3Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Nanchang University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

In dit protocol presenteren we de procedures vaststelling myotone dystrofie 1 myoblast modellen, waaronder geoptimaliseerde C2C12 celonderhoud, gen transfectie / transductie en myocyt differentiatie.

Samenvatting

Myotone dystrofie 1 (DM1) is een veel voorkomende vorm van spierdystrofie. Hoewel verschillende diermodellen vastgesteld voor DM1, myoblast cell modellen blijven belangrijk omdat ze een efficiënte cellulaire alternatief voor het bestuderen van cellulaire en moleculaire gebeurtenissen. Hoewel C2C12 myoblast cellen zijn op grote schaal gebruikt myogenesis, resistentie te bestuderen gen transfectie of virale transductie, belemmert onderzoek C2C12 cellen. We beschrijven hier een geoptimaliseerd protocol dat dagelijks onderhoud, transfectie en transductie procedures omvat om genen in C2C12-myoblasten en de inductie van differentiatie myocyten. Tezamen zijn deze procedures inschakelen beste transfectie / transductie efficiëntie en samenhangende differentiatie resultaten. Het protocol bij de vaststelling DM1 myoblasten celmodellen zou de studie van myotone dystrofie, evenals andere spierziekten profiteren beschreven.

Inleiding

Myotone dystrofie (DM) is een autosomaal dominante ziekte die meerdere systemen, met name hart- en skeletspieren 1 beïnvloedt. Er zijn twee subtypen van deze ziekte, DM1 en DM2. DM1 is gebruikelijker en een ernstiger uiting dan DM2 2. De genetische mutatie onderliggende DM1 is een uitbreiding van CUG triplet repeats in het 3 'onvertaalde gebied (UTR) van DM proteïne kinase gen (DMPK) 3. De CUG aantal repeats in aangetaste individuen varieert van 5 tot 37. Daarentegen verhoogt tot meer dan 50 en soms wel duizenden in DM1 patiënten 4. Hierdoor RNA-bindende eiwitten, zoals muscleblind-like 1 (MBNL1), CUGBP en Elav-achtige familie 1 (Celf1), zijn misregulated. Door de opslag van de geëxpandeerde CUG herhalingen, verliest MBNL1 zijn vermogen om alternatieve splicing 5 reguleren. Celf1, anderzijds, wordt opwaarts gereguleerd 6,7. Overexpressie van Celf1 gaat gepaard met het verlies van spiermassaen zwakheid, die niet worden toegeschreven aan verlies van MBNL1 functie. Diermodellen simuleren DM1-gerelateerde veranderingen, waaronder DMPK 3'-UTR CUG expansie, verlies van MBNL1 en overexpressie van Celf1, zijn vastgesteld. Echter, modelleren DM1 in myoblasten biedt een efficiënt alternatief, vooral voor ontleden DM1-gerelateerde cellulaire en moleculaire gebeurtenissen.

C2C12 myoblasten-cellijn werd voor het eerst geïsoleerd uit gewond C3H muis spier en op grote schaal gebruikt om myogene differentiatie 8,9 bestuderen. C2C12 cellen sneller prolifereren in foetaal bovine serum (FBS) bevattende media en gemakkelijk differentiatie ondergaan wanneer FBS leeg. Maar met deze myoblast differentiatie model presenteert twee problemen: C2C12 cellen zijn vaak resistent tegen gentransfectie / virale transductie; en lichte variaties in cel handling en differentiatie procedure kan leiden tot duidelijke veranderingen in myotube formatie.

Ons laboratorium maakt gebruik van routinematig C2C12 myoblasten als acell model en heeft protocollen die effectief genen door plasmide transfectie, retrovirale transductie, en lentivirale transductie geven in C2C12 cellijn 10 ontwikkeld. In de video, tonen we de geoptimaliseerde procedures voor het transfecteren / transduceren C2C12 cellen en het behoud van differentiatie consistentie bij de vaststelling van DM1 myoblast modellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. C2C12 Cell Culture

  1. Onderhouden C2C12 muis myoblasten in 100 mm platen in kweekmedium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM)) aangevuld met 20% foetaal bovien serum, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 2 mM L-glutamine. Sta C2C12 cellen gepasseerd tot ongeveer 50 worden - 60% confluent.
  2. Gooi het groeimedium en was C2C12 cellen met 3 ml kamertemperatuur fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder de PBS en voeg 500 ul 0,25% trypsine-EDTA op de cellen los. Plaats de plaat in een 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende 3-5 min.
  3. Neutraliseren van de trypsine door toevoeging van 3 ml groeimedium. Pipet 6-8 keer om de cellen te schorten. Voeg 1 ml gesuspendeerd cel in nieuw 100 mm plaat en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2.

2. C2C12 celtransfectie / transductie en selectie

  1. C2C12 plasmide transfectie
    1. 24 uur voorafgaand aan transfectie, plate 7,0 x 10 5 C2C12 cellen in één putje van een zes-well plaat voor elke transfectie.
      Opmerking: Dit leidt tot 50-60% confluentie op het moment van transfectie.
    2. Laat het transfectiereagens tot kamertemperatuur vóór gebruik te komen.
    3. Voeg 2 ug plasmide DNA (GFP-CUG5 of GFP-CUG200) in 200 ul voorverwarmde serum vrij medium en vortex kort. Voeg 6 ul transfectiereagens aan het medium toe en meng onmiddellijk voor 30 sec met een vortex. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Verander het medium van C2C12 cellen aan 2,5 ml serumvrije groeimedia. Voeg het transfectiemengsel aan de cellen na incubatie. Zet de platen een 5% CO2, 37 ° C incubator.
    5. Houd de cellen in transfectiemengsel / serumvrije groeimedia voor 4 uur of tot overnacht. Verander media terug naar de groei media de volgende dag of wanneer cytotoxiciteit is duidelijk.
      Opmerking: Cytotoxiciteit wordt beoordeeld door microscopische inspectie van het ceLLS. Let op de veranderingen in de cel morfologie en cel onthechting. Zolang er geen openlijke cytotoxiciteit, overnacht incubatie in serumvrije groeimedia verhoogt transfectie.
    6. Selecteer de cellen 48 uur na transfectie door toevoeging van 1,2-1,6 mg / ml G418 voor ~ 10 dagen tot de controlecultuur (getransfecteerd zonder de plasmiden) geen levende cellen hebben. Verander het medium elke twee dagen met groeimedium aangevuld met G418.
    7. Handhaaf de G418 resistente cellen in groeimedium en 5% CO2 bij 37 ° C voor daaropvolgende experimenten.
  2. Retrovirus voorbereiding en C2C12 retrovirale transductie
    1. Bereid HEK 293 kweekmedium door toevoeging DMEM hoge glucose met 10% foetaal bovien serum, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 2 mM L-glutamine.
      1. Ongeveer 24 uur voorafgaand aan transfectie, plaat 4,0 x 10 6 ecotropische HEK 293-cellen gebaseerde verpakking in een 100 mm plaat (80% confluentie op transfectie) containing celkweekmedium.
    2. Laat het transfectiereagens tot kamertemperatuur vóór gebruik te komen.
    3. Meng 15 ug plasmide DNA (pMSCV-Puro of pMSCV-Celf1Flag-Puro) in 1 ml serumvrij groeimedium. Vortex kort. Voeg 30 ul transfectiereagens uit stap 2.2.2 in het DNA / serumvrije groeimedium buis en meng goed met behulp van vortex. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
    4. Voeg transfectiemengsel druppelsgewijs aan het ecotrope HEK 293-cellen gebaseerde verpakking. Zwenk de platen en terug te keren ze terug naar de 5% CO 2, 37 ° C incubator. Na 24 uur, veranderen de media om 10 ml voorverwarmde vers groeimedium.
    5. Oogst de supernatant (bevattende retrovirus) 48 uur na transfectie met een pipet breng de supernatant in een 50 ml centrifugebuis. Voeg 10 ml warm nieuwe media op de plaat en terug naar de incubator. Houd de supernatant bij 4 ° C.
      Opmerking: De media wordt voorzichtig toegevoegd aan tHij kant van de put zodat niet de cel monolaag verstoren.
    6. Oogst de tweede partij van de supernatant 60 uur na transfectie en het zwembad met de bovenstaande vloeistof uit 2.2.5. Centrifugeer bij 500 xg, 4 ° C gedurende 7 min om celafval te verwijderen.
    7. Breng het supernatant in een nieuwe 50 ml centrifugebuis. Gebruik retrovirus C2C12 transduceren op dit punt, door een stap 2.2.9 of aliquot en bewaar de bovenstaande vloeistof bij -20 ° C voor toekomstig gebruik.
    8. Ontdooi de retrovirus uit 2.2.7 bij kamertemperatuur in een bevroren voorraad hier wordt gebruikt.
      Opmerking: Vermijd meerdere vries-dooi cycli.
    9. Plaat C2C12 cellen op dezelfde dag van transductie streven naar 30-40% confluentie.
      1. Gooi het groeimedium en was C2C12 cellen met 3 ml PBS kamertemperatuur. Verwijder de PBS, voeg 500 ul 0,25% trypsine-EDTA en incubeer de plaat in een 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende 3-5 min.
      2. Neutraliseren van de trypsine door toevoeging van 3 ml groei medium. Pipet 6-8 keer om de cellen te schorten. Aantal cellen met een hemocytometer en voeg 8,0 x 10 5 cellen C2C12 een 60 mm plaat.
    10. Voeg 0,5 ml retrovirus een 60 mm plaat van cellen te infecteren in 3 ml groeimedia. Zet de plaat naar de incubator.
    11. Vervangen door 3 ml vers medium aangevuld met antibiotische selectie (puromycine 1-3 ug / ml) 48 uur na infectie. Vervang 3 ml medium met antibiotica elke dag voor ~ 5 dagen tot de getransduceerde C2C12 controle cultuur sterft uit.
  3. Lentivirus voorbereiding en C2C12 lentivirale transductie
    Opmerking: Voer alle-lentivirus gerelateerde procedures in Biosafety Level 2 kast en volg biologische veiligheidsrichtlijnen. Vloeibaar afval dat het virus moeten vóór verwijdering worden gedesinfecteerd.
    1. Plaat 4,0 x 10 6 293T cellen in een 100 mm plaat (-80% confluentie op de dag van transfectie) met HEK 293 celkweekmedium (DMEM hoog glucose, aangevuld met 10% foetaalrunderserum, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 2 mM L-glutamine) 24 uur voor transfectie.
    2. Verwarm het transfectiereagens tot kamertemperatuur. Meng de lentivirale verpakkingsvectoren (4 ug pMD2.G en 6 ug psPAX2) met 8 ug lentivirale transfervector (Celf1 shRNA of scrambled controle shRNA) in 1 ml serumvrij celkweekmedium. Vortex kort.
    3. Voeg 36 ul voorverwarmde transfectiereagens aan het DNA / DMEM buis en meng goed door vortex. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
    4. Verwijder de 293T cellen uit de incubator en voeg het transfectie mengsel aan de plaat. Zwenk de plaat en vervolgens terug naar 5% CO 2, 37 ° C incubator. Na 24 uur werd vervangen transfectie mengsel met 10 ml vers kweekmedium.
    5. Verzamel de bovenstaande vloeistof bevattende lentivirus 48 uur na transfectie en overzetten in een 50 ml centrifugebuis. Voeg 10 ml warm nieuwe media op de plaat en retournerenincubator. Bewaar het supernatant bij 4 ° C.
    6. Verzamel de tweede partij van de supernatant 60 uur na transfectie en deze combineren met de bovenstaande vloeistof uit 2.3.5. Centrifugeer kort bij 500 xg, 4 ° C gedurende 7 min.
    7. Breng het supernatans in een verse 50 ml centrifugebuis. Als het gebruiken van verse virus, ga dan naar stap 2.3.9. Voor toekomstig gebruik, opslag virus-bevattende supernatans bij -20 ° C in porties van 10 ml.
    8. Ontdooi het virus 2.3.7 bij kamertemperatuur voor gebruik als een ingevroren voorraad wordt gebruikt.
      Opmerking: Vermijd meerdere vries-dooi cycli.
    9. Plate C2C12-CUG200 cellen (verkregen in paragraaf 2.1) zoals beschreven in 2.2.9 op dezelfde dag van transductie.
      Opmerking: Streef naar 30 - 40% van de samenvloeiing.
    10. Voeg 0,5 ml virus op een 60 mm plaat van C2C12-CUG200 infecteren en de terugkeer van de plaat naar de incubator.
    11. Vervang het kweekmedium door vers medium aangevuld met de selectie antibioticum (puromycine 1-3 ug / ml) 72 uur na transductie.Vernieuwen cultuur media elke dag met de selectie antibioticum voor ~ 5 dagen tot alle niet getransduceerde C2C12-CUG200 controlecultuur sterft uit.
    12. Gebruik Western blot om Celf1 knock-down te controleren in GFP-CUG200 getransfecteerde cellen.

3. C2C12 Celdifferentiatie

  1. Plate 2 x 10 6 cellen in een putje van een 6-wells plaat in 2,5 ml groeimedium 24 uur voor aanvang van differentiatie.
    Opmerking: De uitplaatdichtheid kan worden afgesteld dat volledige confluentie bereikt in 24 uur.
    1. Spoel confluente cellen met PBS en voeg 2,5 ml van laag serum differentiatie medium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium gesupplementeerd met 2% paarden serum, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 2 mM L-glutamine, en 1 uM insuline) . Vervang het medium elke twee dagen.
      Let op: Houd voorraad insuline bevroren en voeg deze toe aan de media op elk medium verandering.
  2. Tijdens C2C12 differentiatie, het verzamelen van monsters voor quantieve RT-PCR (zie hoofdstuk 4) op de volgende tijdstippen: Day0, 1, 2, 4 en 6. Werkwijze van de cultuur voor immunokleuring op dag 6-8 (zie paragraaf 5).

4. RNA isolatie en kwantitatieve RT-PCR

  1. Gebruik protocol van de fabrikant voor RNA-isolatie. Na isolatie, resuspendeer de RNA pellet in 30 pi RNase-vrij water en pipet op en neer meerdere malen.
    Opmerking: De monsters overgaan tot kwantitatieve RT-PCR en kan bij -80 ° C opgeslagen.
  2. Gebruik een RT-qPCR kit voor Kwantitatieve RT-PCR 10 en volg de instructies van de fabrikant. Bereid het reactiemengsel volgens tabel 1.
bestanddeel Volume (pl) eindconcentratie
2x reactiebuffer 10 1x
voorwaartse primer 0.5 200 nM
Reverse primer 0.5 200 nM
Sonde 0.5 200 nM
Reverse transcriptase en RNase Inhibitor 0.1 0,25 U / ml
Sjabloon 1 100 ng totale RNA
RNase vrij water 7.4 NA
Total Mix 20

Tabel 1. Kwantitatieve RT-PCR Master Mix Bereiding

  1. Voer een 20 pl RT-qPCR reactie middels thermisch profiel Tabel 2.
Reverse transcriptie stap 30 min, 48 ° C
DNA-polymeerase activering / reverse transcriptase inactivatie 10 min, 95 ° C
40 Cycles 15 sec, 95 ° C
1 min, 60 ° C

Tabel 2. De kwantitatieve RT-PCR thermisch profiel

5. Immunokleuring

  1. Bevestig de monolaag kweek in 2,5 ml vers bereide 4% paraformaldehyde / PBS bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
  2. Permeabilize de monsters in 2,5 ml 0,1% Triton X-100 / PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Breng de monsters naar een vochtige kamer. Blokkeer de monsters in 2,5 ml blokkerende buffer (0,1% nietionogene oppervlakteactieve stof / PBS, 10% normaal geit serum) gedurende 30 min bij 37 ° C.
  4. Gooi blokkeerbuffer en breng 800 ul primaire antilichaam tegen de zware keten van myosine verdund in het blokkeren van buffer (1: 100). Incuberen in een bevochtigde kamer overnacht bij kamertemperatuur.
  5. Was de plaat 3 times (10 min elk) met 2,5 ml wasbuffer (0,1% polysorbaat 20 / PBS) op dag 2.
  6. Verwijder de wasbuffer en breng 800 ul secundair antilichaam (geit anti-muis IgG, 1: 500 verdund in PBS). Incuberen in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  7. Was twee keer (10 min elk) met 2,5 ml wasbuffer.
  8. Incuberen met 800 ui DAPI (1 ug / ml, verdund in gedestilleerd gedeïoniseerd H2O) gedurende 5 min.
  9. Wassen met 2,5 ml wasbuffer opnieuw gedurende 10 min.
  10. Verander de wasbuffer tot 2,5 ml PBS en het gebruik van een fluorescentiemicroscoop om beelden vast te leggen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

C2C12-cellen werden getransfecteerd met GFP-CUG5 of GFP-CUG200. Na resistentie selectie werden stabiele pools opgericht, die worden gevisualiseerd kan door GFP expressie (Figuur 1A). Myotube formatie in het gedifferentieerde myoblasten werd gedetecteerd door immunokleuring myosine zware keten 10 (figuur 1B). De kwantificering van myotube formatie aangetoond dat fusie indices werden afgenomen van 35,4 ± 4,1% tot 2,6 ± 1,1% en myotube gebieden w...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

C2C12 cellijn is gebruikt als een model om myogenesis 11-14 bestuderen. Deze cellen behouden een fibroblast-achtige look, prolifereren snel in media die 20% foetaal runderserum en gemakkelijk differentiëren in media die 2% paarden serum 15. De snelle groei en differentiatie zijn voordelige eigenschappen in een myogenesis cel model. Hier tonen we het gebruik van plasmide, retrovirale en lentivirale vectoren om cDNA, 3'-UTR en shRNA introduceren in C2C12-cellen. De kritische punten voor transfect...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Drs. Tom Cooper van het Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan van de University of Wisconsin-Madison en Didier Trono van de Universiteit van Genève voor reagentia. Dit werk wordt ondersteund door een startfonds van de Universiteit van Houston (YL), een American Heart Association-subsidie (YL, 11SDG5260033) en de National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DMEM, hoge glucoseLife Technologies11965-084voor kweekmedium
Fetal Bovine Serum - PremiumAtlanta BiologicalsS11150voor kweekmedium
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)Life Technologies10378-016voor kweekmedium
Insulin van bovien pancreasSigma AldrichI6634-100MGvoor differentiatiemedium
equine serumAtlanta BiologicalsS12150voor differentiatiemedium
FuGENE HD Transfectie ReagensPromegaE2311 voor transfectie
G418 sulfaat Gold Biotechnology G-418-10voor selectie van geneesmiddelresistentie
Puromycin dihydrochlorideSigma Aldrichsc-108071voor selectie van geneesmiddelresistentie
NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Proteïnegelen, 1,0 mm, 15 putjesLife TechnologiesNP0323BOXvoor western blot
NuPAGE Transfer Buffer (20x)Life TechnologiesNP00061voor western blot
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)Life TechnologiesNP0002voor western blot
Amersham Protran Supported 0,2 NC, 300 mm x 4 mGE healthcare life science10600015voor western blot
MF 20Developmental Hybridoma BankMF 20primair Ab voor immunokleuring
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secundair Antilichaam, Texas Red-X-conjugaatThermo Fisher ScientificT-862secundair Ab voor immunokleuring
One step qRT-PCR MasterMixAnaSpec05-QPRT-032Xvoor qRT-PCR
TriPure Isolation ReagensRoche11667165001voor RNA-isolatie
CUG-BP1 Antilichaam (3B1)santa cruzsc-20003primair Ab western blot
Actin Antilichaamsanta cruzsc-1615geiten polyklonaal IgG voor ladingscontrole
293T EcopackClontech631507cellen voor retrovirusvoorbereiding
pMSCV-puroClontech634401lege retrovirale vector voor retrovirusvoorbereiding
pMSCV-Celf1Flag-purohuis-gebouwdniet beschikbaarretrovirale vector die Celf1Flag codeert, gebruikt in retrovirusvoorbereiding
psPAX2geschenk van Didier Trononiet beschikbaarvoor lentivirusvoorbereiding
pMD2.Ggeschenk van Didier Trononiet beschikbaarvoor lentivirusvoorbereiding
GFP-CUG5geschenk van M.S. Mahadevanniet beschikbaardetails in verwijzing 10 
GFP- CUG200geschenk van M.S. Mahadevanniet beschikbaardetails in verwijzing 10 
Triton X-100Sigma AldrichX100voor immunokleuring
paraformaldehydeSigma AldrichP6148voor immunokleuring
TWEEN 20Sigma AldrichP9416voor immunokleuring
DAPISigma AldrichD9542voor immunokleuring

Referenties

  1. Harper, P. S. Myotonic dystrophy. 3rd edn. , W. B. Saunders. (2001).
  2. Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
  3. Brook, J. D., et al. Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3' end of a transcript encoding a protein kinase family member. Cell. 68 (4), 799-808 (1992).
  4. Chau, A., Kalsotra, A. Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics. Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).
  5. Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).
  6. Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation. Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).
  7. Kalsotra, A., et al. The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression. Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).
  8. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
  9. Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
  10. Peng, X., et al. Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity. Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).
  11. Amack, J. D., Mahadevan, M. S. The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation. Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).
  12. Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model. Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).
  13. Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. (CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy. Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).
  14. Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Dev Biol. 265 (2), 294-301 (2004).
  15. Emerson, C. P., Sweeney, H. L. Methods in muscle biology. 52, Academic Press. (1997).
  16. Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).
  17. Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

C2C12 myoblastenplasmidetransfectieretrovirale transductielentivirale transductiemyocytdifferentiatieWestern blot analysefluorescentieanalyseCelf1 opregulatiegen knock out
Modelleren van myotone dystrofie 1 in C2C12 myoblastcellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.