In dit protocol presenteren we de procedures vaststelling myotone dystrofie 1 myoblast modellen, waaronder geoptimaliseerde C2C12 celonderhoud, gen transfectie / transductie en myocyt differentiatie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Modelleren van myotone dystrofie 1 in C2C12 myoblastcellen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Myotone dystrofie 1 (DM1) is een veel voorkomende vorm van spierdystrofie. Hoewel verschillende diermodellen vastgesteld voor DM1, myoblast cell modellen blijven belangrijk omdat ze een efficiënte cellulaire alternatief voor het bestuderen van cellulaire en moleculaire gebeurtenissen. Hoewel C2C12 myoblast cellen zijn op grote schaal gebruikt myogenesis, resistentie te bestuderen gen transfectie of virale transductie, belemmert onderzoek C2C12 cellen. We beschrijven hier een geoptimaliseerd protocol dat dagelijks onderhoud, transfectie en transductie procedures omvat om genen in C2C12-myoblasten en de inductie van differentiatie myocyten. Tezamen zijn deze procedures inschakelen beste transfectie / transductie efficiëntie en samenhangende differentiatie resultaten. Het protocol bij de vaststelling DM1 myoblasten celmodellen zou de studie van myotone dystrofie, evenals andere spierziekten profiteren beschreven.
Inleiding
Myotone dystrofie (DM) is een autosomaal dominante ziekte die meerdere systemen, met name hart- en skeletspieren 1 beïnvloedt. Er zijn twee subtypen van deze ziekte, DM1 en DM2. DM1 is gebruikelijker en een ernstiger uiting dan DM2 2. De genetische mutatie onderliggende DM1 is een uitbreiding van CUG triplet repeats in het 3 'onvertaalde gebied (UTR) van DM proteïne kinase gen (DMPK) 3. De CUG aantal repeats in aangetaste individuen varieert van 5 tot 37. Daarentegen verhoogt tot meer dan 50 en soms wel duizenden in DM1 patiënten 4. Hierdoor RNA-bindende eiwitten, zoals muscleblind-like 1 (MBNL1), CUGBP en Elav-achtige ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. C2C12 Cell Culture
- Onderhouden C2C12 muis myoblasten in 100 mm platen in kweekmedium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM)) aangevuld met 20% foetaal bovien serum, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 2 mM L-glutamine. Sta C2C12 cellen gepasseerd tot ongeveer 50 worden - 60% confluent.
- Gooi het groeimedium en was C2C12 cellen met 3 ml kamertemperatuur fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder de PBS en voeg 500 ul 0,25% trypsine-EDTA op de cellen los. Plaats de plaat in een 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende 3-5 min.
- Neutraliseren van de trypsine door toevoeging van 3 ml groeimedium....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
C2C12-cellen werden getransfecteerd met GFP-CUG5 of GFP-CUG200. Na resistentie selectie werden stabiele pools opgericht, die worden gevisualiseerd kan door GFP expressie (Figuur 1A). Myotube formatie in het gedifferentieerde myoblasten werd gedetecteerd door immunokleuring myosine zware keten 10 (figuur 1B). De kwantificering van myotube formatie aangetoond dat fusie indices werden afgenomen van 35,4 ± 4,1% tot 2,6 ± 1,1% en myotube gebieden w.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
C2C12 cellijn is gebruikt als een model om myogenesis 11-14 bestuderen. Deze cellen behouden een fibroblast-achtige look, prolifereren snel in media die 20% foetaal runderserum en gemakkelijk differentiëren in media die 2% paarden serum 15. De snelle groei en differentiatie zijn voordelige eigenschappen in een myogenesis cel model. Hier tonen we het gebruik van plasmide, retrovirale en lentivirale vectoren om cDNA, 3'-UTR en shRNA introduceren in C2C12-cellen. De kritische punten voor transfect.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken Drs. Tom Cooper van het Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan van de University of Wisconsin-Madison en Didier Trono van de Universiteit van Genève voor reagentia. Dit werk wordt ondersteund door een startfonds van de Universiteit van Houston (YL), een American Heart Association-subsidie (YL, 11SDG5260033) en de National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM, hoge glucose | Life Technologies | 11965-084 | voor kweekmedium |
| Fetal Bovine Serum - Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | voor kweekmedium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Life Technologies | 10378-016 | voor kweekmedium |
| Insulin van bovien pancreas | Sigma Aldrich | I6634-100MG | voor differentiatiemedium |
| equine serum | Atlanta Biologicals | S12150 | voor differentiatiemedium |
| FuGENE HD Transfectie Reagens | Promega | E2311 | voor transfectie |
| G418 sulfaat | Gold Biotechnology | G-418-10 | voor selectie van geneesmiddelresistentie |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | sc-108071 | voor selectie van geneesmiddelresistentie |
| NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Proteïnegelen, 1,0 mm, 15 putjes | Life Technologies | NP0323BOX | voor western blot |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Life Technologies | NP00061 | voor western blot |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | NP0002 | voor western blot |
| Amersham Protran Supported 0,2 NC, 300 mm x 4 m | GE healthcare life science | 10600015 | voor western blot |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | primair Ab voor immunokleuring |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secundair Antilichaam, Texas Red-X-conjugaat | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secundair Ab voor immunokleuring |
| One step qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | voor qRT-PCR |
| TriPure Isolation Reagens | Roche | 11667165001 | voor RNA-isolatie |
| CUG-BP1 Antilichaam (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primair Ab western blot |
| Actin Antilichaam | santa cruz | sc-1615 | geiten polyklonaal IgG voor ladingscontrole |
| 293T Ecopack | Clontech | 631507 | cellen voor retrovirusvoorbereiding |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | lege retrovirale vector voor retrovirusvoorbereiding |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | huis-gebouwd | niet beschikbaar | retrovirale vector die Celf1Flag codeert, gebruikt in retrovirusvoorbereiding |
| psPAX2 | geschenk van Didier Trono | niet beschikbaar | voor lentivirusvoorbereiding |
| pMD2.G | geschenk van Didier Trono | niet beschikbaar | voor lentivirusvoorbereiding |
| GFP-CUG5 | geschenk van M.S. Mahadevan | niet beschikbaar | details in verwijzing 10 |
| GFP- CUG200 | geschenk van M.S. Mahadevan | niet beschikbaar | details in verwijzing 10 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | voor immunokleuring |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | voor immunokleuring |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | voor immunokleuring |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | voor immunokleuring |
Referenties
- Harper, P. S. Myotonic dystrophy. 3rd edn. , W. B. Saunders. (2001).
- Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
- Brook, J. D., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
