Een aanpak ter verbetering van Alignment en Myelination van dorsale wortel ganglion Neuronen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de isolatie van dorsale wortelganglion (DRG) neuronen geïsoleerd uit ratten en de kweek van DRG neuronen op een statisch voorgerekt celkweeksysteem om de uitlijning van axonen te verbeteren, met daaropvolgende co-cultuur van Schwann-cellen (SC's) om myelinisatie te bevorderen.

Samenvatting

Axonregeneratie is een chaotisch proces, grotendeels als gevolg van ongeorganiseerde axonenuitlijning. Daarom is er, om ervoor te zorgen dat een voldoende aantal geregenereerde axonen de laesieplaats kan overbruggen, een goed georganiseerde axonaal uitlijning vereist. Aangezien demyelinisatie na zenuwbeschadiging de geleidende capaciteit van overlevende axonen sterk aantast, is remyelinisatie cruciaal voor het succesvol functioneren van geregenereerde zenuwen. Eerder hebben we aangetoond dat mesenchymatische stamcellen (MSC's) uitgelijnd zijn op een anisotroop oppervlak dat vooraf wordt uitgerekt, omdat de cellen een grotere effectieve stijfheid kunnen waarnemen in de uitgerekte richting dan in de loodrechte richting. We toonden ook aan dat een anisotroop oppervlak dat voortkomt uit een mechanisch vooruitgerekt oppervlak op dezelfde manier de uitlijning, evenals de groei en myelinisatie van axonen beïnvloedt. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het voorbereiden van een vooruitgerekt anisotroop oppervlak, de isolatie en kweek van dorsale wortelganglion (DRG) neuronen op een vooruitgerekt oppervlak, en tonen het myelinisatiegedrag van een co-cultuur van DRG-neuronen met Schwann-cellen (SC's) op een vooruitgerekt oppervlak.

Inleiding

In zenuwletsels, worden de proximale en distale zenuwstompen vaak voorkomen directe aanpassing van de zenuw bundels door de laesie ^1-2. Gewoonlijk worden axon stukken uit sterk geordende en uitgelijnd bundels van axonen, die complexe netwerken van connectiviteit vormen. Echter, zenuwregeneratie is een chaotisch proces te wijten aan slecht georganiseerde axon uitlijning ^3-4. Derhalve voldoende regenererende axons die de laesie overbruggen genereren, is het noodzakelijk om goed georganiseerd axonale uitlijning induceren. Bovendien, demyelinisatie begeleidt zenuwbeschadigingen als gevolg van de dood van de myelinating cellen op het letsel plaats. Sinds demyelinisatie sterk schaadt de geleidende capaciteit van de overlevende axonen, behandelingen gericht demyelinisatie of het bevorderen van remyelinisatie zijn belangrijk voor functioneel herstel na zenuwletsel ^5. Dus het doel van dit protocol is om een ​​technische benadering die deze twee aspecten worden behandeld illustrerenvan zenuwregeneratie.

Oppervlak anisotropie, die wordt gedefinieerd als het verschil, gemeten langs verschillende assen in een materiaal fysische of mechanische eigenschappen, is toegepast op celuitlijning, groei en migratie ^6-7 beïnvloeden. Naast topografie, zijn er andere methoden om anisotropie induceren. Eerder onderzochten we oppervlak anisotropie geïnduceerd door statische mechanische voorrek poly-dimethyl-siloxaan (PDMS) membraan. De theorie van "kleine deformatie super opgelegd grote" voorspelde dat de effectieve stijfheid van de cellen zin in de gerekte richting afwijkt van de loodrechte richting, en dit verschil in effectieve stijfheid door anisotropie ⁸ oppervlak. Mesenchymale stamcellen (MSCs) gekweekt op een voorgerekt PDMS membraan kunnen de anisotropie zin door het oppervlak actief trekken en daardoor uitlijnen in de voorgerekte richting ^9. Ook een anisotrope oppervlak arising Uit mechanisch voorgerekt oppervlak beïnvloedt de uitlijning, alsmede groei en myelinisatie van dorsale wortel ganglion (DRG) axonen ^10. Hier hebben we een protocol voor het induceren oppervlak anisotropie op een statische voorgerekt PDMS substraat axon regeneratie ¹⁰ te verbeteren.

Om axon uitlijning, topologische kenmerken met de gewenste patronen te lokken, naar verluidt contact begeleiding bieden door middel van uitgelijnde vezels en kanalen ^6,11-12 werd aangetoond dat axon uitlijning ^11,13 vergemakkelijken. Meldde echter technieken voor het induceren axon uitlijning met topologische kenmerken, zoals vezels, zenders en patroonvorming, konden verlengen en verhoging van de dikte van de axonen. Daarentegen geleidelijke mechanisch rekken tot axon aanpassing in de verstrekrichting met langere en dikkere axonen die toe met de grootte van het rek ^14. Echter, voorzien van een motor aangedreven apparaat in vivo is niethaalbaar. Daarentegen statische voorgerekte geïnduceerde anisotropie eenvoudiger en gemakkelijker kunnen worden opgenomen in toekomstige ontwerpen scaffold voor in vivo toepassingen.

In dit protocol wordt een statische voorgerekt celcultuur gebruikt oppervlak anisotropie induceren zonder topologische kenmerken. De voor uitgerekte kweeksysteem bestaat uit een PDMS membraan, een rekbaar frame en een stretching fase, waarna het membraan op het frame is bevestigd en een vooraf bepaalde magnitude rek wordt aangebracht op het podium strekken. Vers geïsoleerde DRG neuronen gekweekt op het voorgerekte oppervlak maximaal 21 dagen gecontroleerd op axon uitlijning en dikte. Vervolgens Schwann-cellen (SC) tezamen gekweekt met de uitgelijnde axonen gecontroleerd op myelinisatie. Door de integratie voorreksysteem oppervlak geïnduceerde anisotropie konden we celuitlijning-differentiatie en axon-groei uitlijning van MSC's en DRG neuronen ^9-10 respectievelijk verbeteren.

Protocol

Alle procedures voor de isolatie van de cellen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Michigan State University.

1. Voorbereiding van de Pre-gespannen Anisotropische Surface

1. Meng een 10: 1 oplossing van base en uithardingsmiddel en giet het mengsel in een weefselkweekplaat (12 cm diameter). Gebruik 4900 mg base en 490 mg verharder voor het totale verknopingsmengsel.
2. Houd de gel mengsel onder vacuüm gedurende 20 minuten om luchtbellen te verwijderen.
3. Plaats de gel mengsel in de oven gedurende de nacht uitharden bij 60 ° C.
4. Na het PDMS membraan kuren, behandel het oppervlak met zuurstofplasma met behulp van een plasma cleaning / etsen voor 3 min bij 165 mTorr en 65 sccm stroom van _O2.
5. Knip een stuk rechthoekige membraan (5 x 3,5 cm) van de schotel, terwijl ze bewust welke kant-zuurstof behandeld, zorg ervoor dat de zuurstof behandelde zijde naar boven en zet op een stretching frame. Plaats het frame op een stretching fase en gelijkmatig strekken door de knop op het podium totdat 10% rek bereikt (of een andere vooraf bepaalde rek, de rek kan worden afgelezen uit de rekken fase) in de langere as ^9. Bevestig het traject door de schroeven op het frame.
6. Verwijder het frame van het podium. Zorg ervoor dat het membraanoppervlak is droog en vrij van stof, plaats dan een silicone kamer op het membraan waardoor de kleverige kant van de kamer om stevig te hechten aan het membraan.
   Opmerking: De siliconen kamer kan ook voor het vasthouden van het celmedium de PDMS membraan. Het apparaat apparatuur is getoond in figuur 1.
7. Steriliseer het oppervlak met UV gedurende 10 min.
8. Voeg 1 ml poly-L-lysine (PLL) (0,01% in fosfaat gebufferde zoutoplossing) aan de PDMS oppervlak binnen de kamer binnen 6 h plasmabehandeling en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C vóór de DRG neuronen zaaien. Dit vergroot celhechting.

le "> 2. Isolatie van DRG

1. Bereid standaard groeimedium voor de DRG neuronen.
2. Voorafgaand aan de isolatie, de isolatie autoclaaf apparatuur en reagentia filter. Voeg 5 ml van isolatie buffer in een putje van een 6-well plaat, en leg de plaat op het ijs. Bereid 10 ml dissociatie medium door toevoeging van 1 ml collagenase A (500 U / ml) aan 9 ml 0,05% trypsine-EDTA (1 mg / ml), filtreer de oplossingen met een 0,22 urn filter en plaats op ijs.
3. Gebruik 11:50 5-7 oude Sprague-Dawley ratten dagen voor de isolatie. Spuit de pups met 75% isopropanol, en offeren door onthoofding.
4. Knip de huid bovenliggende het ruggenmerg van de achterkant en verwijder eventueel overtollige weefsel rond de wervelkolom. Onder een chirurgische vergrootglas met de chirurgische spotjes, levert de eerste incisie van de hals en een snede langs de wervelkolom aan beide zijden met een schaar. Maak de ruggengraat van het lichaam van de pups en verwijder de overtollige spieren. Dan, met een schaar langs de lon te snijdenG as van de wervelkolom en het gebruik pincet om de wervelkolom volledig openen en extraheren de spinale cord.Remove de tip van een pipet om een ​​grotere opening voor het overbrengen van de DRG's met isolatie buffer in een steriele 15 ml buis te creëren.
5. Met behulp van een fijne pincet, verwijder de ganglion van het bot zak en het verzamelen van ongeveer 10-16 DRG van beide kanten. Snijd de zenuwwortels en de overdracht van de ganglia van de ijskoude isolatie buffer.
6. De tip van een pipet om een ​​grotere opening voor het overbrengen van de DRG's met isolatie buffer in een steriele 15 ml buis te creëren. Na de chemische dissociatie Centrifugeer de ganglia bij 900 xg en 4 ° C gedurende 5 minuten.
7. Laat de weefsels naar de bodem van de buis en verwijder de isolatie buffer geplaatst en voeg 10 ml dissociatie medium in de buis.
8. Incubeer de ontleed weefsel in de dissociatie medium in een 37 ° C waterbad gedurende 1 uur onder schudden de buis elke 5-10 minuten.
9. Nachemische dissociatie Centrifugeer de ganglia bij 900 xg en 4 ° C gedurende 5 minuten.
10. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 ml kweekmedium en vortex.
11. Centrifugeer de gescheiden cellen als vermeld in paragraaf 2.9 nogmaals.
12. Verwijder de bovenstaande vloeistof, resuspendeer de pellet in 12 ml van de standaard groei media en vortex.

3. Culture of DRG op pre-stretched Surface

1. Voorafgaand aan de cellen zaaien, de PLL oplossingen uit de kamer en spoel de PDMS oppervlak met steriel water en lucht drogen.
2. Na resuspenderen van de cellen, laat de suspensie ingesteld voor 1-2 minuten om de te laten bezinken naar de bodem van de buis. Voeg 1,5 ml celsuspensie in elk rek kamer en incubeer bij 37 ° C in _5% CO2.
3. Om gliacellen te elimineren, op 1 dag in vitro (DIV), voeg 10 ul (of 15 pi) mengsel van fluor-2 deoxy-uridine en uridine (FDU-U) stock solutiop (zie tabel van Materialen) aan elk putje. Na 7 uur, de plaats van dit medium door vers standaard groeimedium en plaats de voorgerekte kweekinrichting in een 37 ° C incubator met 5% _CO2.
4. Tijdens de celkweek periode (2-3 weken), veranderen de media om de twee dagen door het vervangen van de helft van het verbruikte medium door vers medium. Let op: Na het kweken op de uitgerekte en zonder rek oppervlakken voor 2 weken, worden gezuiverd SC's toegevoegd aan de kamer en gedurende een week (stap 4.7).

4. Co-kweek van Schwann-cellen (SC) met DRG neuronen op pre-stretched Surface

1. Isoleer SC's zoals beschreven door Dr. Campana de groep eerder ^15.
   1. In het kort, isoleren van de SCS van een 1 dag oud pup. Verzamelen en distantiëren de nervus zenuwen zowel chemisch (trypsine-EDTA en Collagenase A) en mechanisch (18 gauge naald / 10 ml spuit) ^15.
   2. Het zaad van de gescheiden cellen in poly-D-lysine (PDL) coated T25 kolf en kweek bij 37 ° C in _5% CO2. Op dag 5, zuiveren de cellen door selectie antilichaam Anti- thy 1,1 antilichaam en konijn complement en subcultuur de gezuiverde cellen passage 2 - 4. Gebruik kweekmedium dat Dulbecco's gemodificeerd Eagle Medium (DMEM), 10% foetaal runderserum (FBS) , 1% penicilline / streptomycine (Penn / Strep), 21 ug / ml runderhypofyse-extract (BPE) en 4 uM forskoline.
2. Verwijder het kweekmedium van de SC en voeg 5 ml 0,05% trypsine-EDTA in de kolf. Incubeer de cellen bij 37 ° C in 5% _CO2 gedurende 2 - 3 min.
3. Controleer cellen onder de optische microscoop met een 10X objectief te zien of ze verheffen uit de kolf, voeg 5 ml kweekmedium en meng met de cellen in de kolf.
4. Voeg de celsuspensie aan een 15 ml centrifugebuis en centrifugeer bij 200 xg en 20 ° C gedurende 5 minuten.
5. Verwijder de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de pellet in 7 ml standaard DRG groei medIA.
6. Neem 10 pi celsuspensie in een 0,5 ml microcentrifugebuis, mengen met 10 pi van trypan blauw, en tel het aantal cellen met een hemocytometer onder de optische microscoop met een 10X objectief. Verdun de celsuspensie tot 5000 cellen per ml door toevoeging DRG groeimedia.
7. Verwijder 0,5 ml van medium uit de DRG cultuur in de uitgerekte kamer en voeg 0,5 ml SC suspensie aan de DRG cultuur.
8. Kweken van de cellen gedurende 1 week bij 37 ° C en 5% CO _2. Verandering de media om de twee dagen door vervanging halve verbruikte medium met vers standaard groeimedium voor DRG. Na 1 week co-cultuur werkwijze de cellen door immunohistochemie ^10.

Resultaten

De pre-uitgerekt celcultuur gepromoot DRG axon uitlijning ^10. DRG neuronen werden gekweekt op voorgerekt en zonder rek oppervlakken 12 dagen. De axonen werden gekleurd voor β-III-tubuline om hun uitlijning te tonen. Figuur 2 vergelijkt axon oriëntatie op het pre-uitgerekte en zonder rek PDMS substraten na 12 dagen van de cultuur. De DRG axonen evenwijdig aan de gerekte richting, terwijl ze toonden willekeurige uitlijning en vormden een fijnmazig netwerk op de ...

Discussie

Om axon aanpassing aan voorgerekt oppervlak induceren, zijn er twee belangrijke stappen: 1) het PDMS membraan moet vlak en vormt een homogene dikte; en 2) gliacellen moeten van de DRG verwijderd. Na mengen van de PDMS en crosslinker en uitharding in een oven, moet de verknoopte PDMS gel op een vlakke werktafel bewaard en voorzichtig behandeld om eventuele kantelen te vermijden. De zuurstof plasmabehandeling van het PDMS membraan worden gevolgd door 6 uur PLL-bekleding, aangezien de hydrofiliciteit van het oppervlak (ver...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Neurobasal Medium 1x	GibcoBRL	21103-049
B27 Supplement 50x	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100x	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
Nerve Growth Factor-7S	Invitrogen	13290-010
Penicillin-streptomycin	GibcoBRL	15140-122
0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poly-L-Lysine	Trevigen	3438-100-01
Poly-D-Lysine	Sigma	p-6407
Fluoro-2 deoxy-uridine	Sigma	F0503
Uridine	Sigma	U3003
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Isolatie Buffer
Type I Collagenase	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
Heat inactivated Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30080.03
BPE	Clonetics	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
Silicone chamber	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
Plasma cleaning/etching system	March Instruments	PX-250
Anti-Thy 1.1 antibody	Sigma- Aldrich	M7898
Rabbit Complement	Sigma- Aldrich	S-7764
Standard growth medium			Voor 500 ml Neurobasal Medium 1x, voeg 10 ml van B-27 50x, 5 ml van Glutamax-I 100x, 2,5 ml van Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml van Albumax-I en 1 μl van NGF-- 7S (50 μg/ml) toe.
FDU Uridine stock solution			FDU 100 mg in 10 ml van ddH2O (10 mg/ml), filter in de kap en verdeel in 500 μl aliquots en bewaar bij -20 ºC. Uridine 5 g in 166,7 ml van ddH2O (33 mg/ml), filter in de kap, verdeel in 200 μl aliquots en bewaar bij -20 ºC. Neem 61,5 μl van FDU (10 mg/ml) en 20,5 μl van Uridine(33 mg/ml), en voeg 4.918 μl van ddH2O toe voor een eindconcentratie, verdeel in 1 ml aliquots en bewaar bij -20 ºC.