Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gerichte RNA Sequencing Assay Gene Expression en Genomic Wijzigingen karakteriseren

10K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54090

⸱

4 augustus 2016

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Division of Medical Oncology, Comprehensive Cancer Center, The Ohio State University, 2Department of Pharmacology, The Ohio State University

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een op getarget RNA-sequencing gebaseerde methode die de voorbereiding van geïndiceerde cDNA-bibliotheken, hybridisatie en captuur met aangepaste sondes en data-analyse om geselecteerde transcripten te onderzoeken op genexpressie, mutaties en genfusies omvat. Getarget RNAseq maakt een kosteneffectieve, snelle evaluatie van geselecteerde transcripten mogelijk op een desktop sequencer.

Samenvatting

RNA sequentie (RNAseq) is een veelzijdige werkwijze die kan worden gebruikt voor het detecteren en karakteriseren van genexpressie, mutaties, genfusies en niet-coderende RNA's. Standard RNAseq vereist 30-100000000 sequencing leest en kan meerdere RNA zoals mRNA en niet-coderende RNA's. We laten zien hoe gerichte RNAseq (capture) maakt een gerichte studie op geselecteerde RNA-producten met behulp van een desktop-sequencer. RNAseq capture kan een annotatie, lage, of tijdelijk tot expressie transcripten die anders kan worden gemist met behulp van traditionele methoden RNAseq karakteriseren. Hier beschrijven we de extractie van RNA uit cellijnen, ribosomaal RNA uitputting, cDNA synthese, het opstellen van barcode bibliotheken, hybridisatie en vastleggen van gerichte transcripties en multiplex sequencing op een desktop sequencer. We hebben ook een overzicht van de geautomatiseerde analyse pijpleiding, die kwaliteitscontrole assessment, uitlijning, fusion detectie, genexpressie kwantificering en identificatie van enkele Nuc omvatleotide varianten. Deze test maakt gerichte transcript sequentiebepaling genexpressie genfusies en mutaties te karakteriseren.

Inleiding

Gehele transcriptoom of RNA sequencing (RNAseq) is een onbevooroordeelde sequencingmethode om alle RNA-producten te beoordelen. Het doel van gerichte RNAseq (Capture) is een gerichte evaluatie van geselecteerde transcripten met verhoogde gevoeligheid, dynamisch bereik, verlaagde kosten of schaal, en verhoogde doorvoer in vergelijking met standaard RNAseq. Net als bij standaard RNAseq, kunnen getargete verrijkingsbenaderingen worden gebruikt om genexpressie, meerdere RNA-soorten zoals mRNA, microRNA (miRNA), lncRNA1, andere niet-coderende RNA's2, genfusies3 en mutaties4-6 te evalueren.

Capture omvat hybridisatie van complementaire oligonucleotiden om cDNA-bibliotheken te verrijken voor sequencing. De redenering voor RNAseq Capture is vergelijkbaar met microarray-benaderingen waarbij complementaire oligonucleotiden of sondes worden gehybridiseerd met monsters en vervolgens worden gemeten voor relatieve abundantie. Voor microarray-technologieën is expressie gebaseerd op relatief signaal gemeten voor transcripten die aan deze sondes binden. Microarrays zijn dus beperkt door bereik, potentiële achtergrondruis van niet-specifieke binding en kruishybridisatie van sondes. Bovendien hebben arrays een beperkt dynamisch bereik voor laag en hoog tot expressie gebrachte transcripten in vergelijking met RNAseq1. Microarrays worden veel gebruikt vanwege hun lagere kosten en hoge doorvoercapaciteit in vergelijking met RNAseq.

Hier demonstreren we een methode voor RNAseq Capture die een middenweg biedt tussen RNAseq- en microarray-benaderingen voor het evalueren van het transcriptoom. RNAseq Capture heeft een gemiddelde doorvoer, groter dynamisch bereik en gevoeligheid, en is geschikt voor snelle omzet op desktop sequencers. RNAseq Capture vereist ook minder computationele bronnen in termen van opslagruimte en dataverwerking.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: Dit protocol beschrijft de gelijktijdige verwerking en analyse van vier monsters. Deze methode is compatibel met RNA geïsoleerd uit cellen, vers bevroren weefsel en in formaline gefixeerd en in paraffine ingebed weefsel (FFPE). Dit protocol begint met 50 - 1.000 ng (250 ng aanbevolen) van start-RNA-input voor elk monster.

1. rRNA Depletion en fragmentatie van RNA-procedure

  1. rRNA Depletion
    1. Verwijder eluent, prime, fragment mix, rRNA verwijdering mix, rRNA binding buffer en resuspendatie buffer uit -20 °C en laat op kamertemperatuur ontdooien. Verwijder elutiebuffer, rRNA verwijderingskralen en RNA/cDNA specifieke paramagnetische kralen uit 4 °C en breng op kamertemperatuur.
    2. Voeg 0,25 µg RNA toe aan PCR-buis. Verdun het totale RNA met nuclease-vrij ultra-zuiver water tot een totaal eindvolume van 10 µl. Voeg 5 µl rRNA binding buffer toe aan elke buis, voeg vervolgens 5 µl rRNA verwijdering mix toe en pipet voorzichtig op en neer om te mengen. Plaats buizen in een thermische cycler met deksel voorverwarmd op 100 °C en programmeer de thermische cycler naar 68 °C gedurende 5 min om het RNA te denatureren.
    3. Na RNA-denaturatie, verwijder buizen uit de thermische cycler en incubeer gedurende 1 min op kamertemperatuur. Vortex rRNA verwijderingskralenbuis krachtig om de kralen te resuspenderen. Voeg 35 µl rRNA verwijderingskralen toe aan nieuwe buizen en breng de RNA-denaturatiereactie (20 µl) over naar buizen met rRNA verwijderingskralen.
    4. Stel pipet in op 45 µl en pipet snel 20x op en neer om te mengen. Incubeer buizen bij RT gedurende 1 min. Plaats vervolgens buizen in magnetische standaard bij kamertemperatuur gedurende 1 min. Breng supernatant over naar nieuw gelabelde PCR-buizen en plaats deze buizen opnieuw in magnetische standaard bij kamertemperatuur gedurende 1 min. Dit zorgt ervoor dat er geen kralen worden overgebracht. Breng supernatant over naar nieuw gelabelde PCR-buizen.
    5. Vortex RNA/cDNA specifieke paramagnetische kralen en voeg 99 µl kralen toe aan elke buis. Pipet voorzichtig het hele volume 10x op en neer om te mengen. Als u begint met gedegradeerd-RNA, voegt u 193 µl goed gemengde RNA/cDNA specifieke paramagnetische kralen toe aan elke buis. Incubeer bij RT gedurende 15 min. Plaats vervolgens buizen op de magnetische standaard bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Verwijder en gooi de supernatanten weg.
    6. Voeg 200 µl vers bereide 70% ethanol (EtOH) toe. Houd buizen op magnetische standaard en zorg ervoor dat de kralen niet worden verstoord. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 sec, verwijder en gooi vervolgens supernatant weg. Laat buizen bij kamertemperatuur gedurende 5 - 10 min staan om te drogen.
    7. Centrifugeer ontdooid elutiebuffer bij kamertemperatuur bij 600 x g gedurende 5 sec. Voeg 11 µl elutiebuffer toe aan elke buis en pipet voorzichtig 10x op en neer om te mengen. Incubeer buizen bij RT gedurende 2 min. Plaats buizen bij kamertemperatuur gedurende 5 min op magnetische standaard. Breng 8,5 µl van het supernatant over naar nieuw gelabelde PCR-buizen.
  2. Fragmentatie van rRNA gedepleteerde RNA
    1. Voeg 8,5 µl eluent, 8,5 µl prime en 8,5 µl fragment mix toe aan elke buis. Pipet voorzichtig 10x op en neer om te mengen. Plaats buizen in thermische cycler met het volgende programma: voorverwarmd deksel op 100 °C, 94 °C gedurende 8 min, vervolgens 4 °C houden.
      OPMERKING: Deze stap is ontworpen om een gemiddelde insertgrootte van 155 bp te genereren. Als de gemiddelde fragmentgrootte van het RNA-monster lager is dan 200 bp, sla deze stap over en ga door naar First Strand cDNA Synthese.

2. cDNA Synthese

  1. Synthesize First Strand cDNA
    1. Verwijder first strand synthesemix uit -20 °C en laat op kamertemperatuur ontdooien.
    2. Programmeer de thermische cycler vooraf met de volgende instellingen: kies de optie voorverwarmen deksel en stel in op 100 °C, vervolgens 25 °C gedurende 10 min, 42 °C gedurende 15 min, 70 °C gedurende 15 min en houd op 4 °C. Sla dit programma op als 'Synthesize 1st Strand'.
    3. Centrifugeer ontdooide first strand synthesemixbuis bij 600 x g gedurende 5 sec. Meng 1 µl reverse transcriptase met 9 µl first strand synthesemix.
    4. Voeg 8 µl first strand synthese en reverse transcriptasemix toe aan elke buis, pipet voorzichtig 6x op en neer om te mengen. Centrifugeer buizen gedurende 4 sec met een vaste snelheid mini tafelcentrifuge bij 6,0 x g om de vloeistof naar de bodem te brengen. Plaats buizen in de thermische cycler en selecteer Synthesize 1st Strand. Wanneer de thermische cycler 4 °C bereikt, verwijder buizen en ga onmiddellijk door naar Synthesize Second Strand cDNA.
  2. Synthesize Second Strand cDNA
    1. Verwarm de thermische cycler voor op 16 °C met het deksel voorverwarmd op 30 °C. Ontdooi tweede streng mastermix en re-suspensiebuffer op ijs. Verwijder van tevoren de fles met paramagnetische kralen uit 4 °

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een schema waarin de belangrijkste stappen van RNAseq Capture worden belicht, is weergegeven in Figuur 1. Vier kankercellijnen met bekende mutaties werden gebruikt om de effectiviteit van de RNAseq Capture-techniek aan te tonen (K562 met ABL1-fusie, LC2 met RET-fusie, EOL1 met PDGFRalpha-fusie en RT-4 met FGFR3-fusie). De vier monsters werden samengevoegd en gesequenced met 2x 10 bp reads op een desktop-sequencer, wat FASTQ-bestanden ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

RNAseq Capture is een tussenliggende strategie tussen RNAseq- en microarray-benaderingen voor het evalueren van een geselecteerd deel van het transcriptome. De voordelen van Capture omvatten lagere kosten, snelle doorlooptijd op een desktopsequencer, hoge doorvoer en detectie van genomische veranderingen. De methode kan worden aangepast om niet-coderende RNA's23 te karakteriseren, enkele nucleotidevarianten4-6 te detecteren, RNA-splijten te onderzoeken en genfusies of structurele herschikkingen te i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

S.R. ontvangt financiering van Novartis en Ariad Pharmaceuticals voor het uitvoeren van klinische onderzoeken. Directe familieleden van S.R. bezitten aandelen in Johnson en Johnson.

Dankbetuigingen

We danken Ezra Lyon, Eliot Zhu, Michele Wing, Esko Kautto en Eric Samorodnitsky voor technische ondersteuning. We willen ook Jenny Badillo bedanken voor haar administratieve ondersteuning voor ons team. We danken het Ohio Supercomputer Center (OSC) voor het verstrekken van schijfruimte, verwerkingscapaciteit en ondersteuning om onze analyses uit te voeren. We danken het Comprehensive Cancer Center (CCC) van het Wexner Medical Center van The Ohio State University voor hun administratieve ondersteuning van dit werk. S.R. en Team worden ondersteund door de American Cancer Society (MRSG-12-194-01-TBG), een Prostate Cancer Foundation Young Investigator Award, NHGRI (UM1HG006508-01A1), Fore Cancer Research Foundation, American Lung Association en Pelotonia.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Thermomixer REppendorf21516-166
Centrifuge 5417REppendorf5417R
miRNeasy Mini KitQiagen217004
Molecular Biology Grade EthanolSigma AldrichE7023-6X500ML
Thermoblock 24 x 1.5 mlEppendorf21516-166
MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles)IlluminaMS-102-2002
MiSeq Desktop SequencerIllumina
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001
TruSeq Stranded Total RNA Kit with RiboZero Gold SetAIlluminaRS-122-2301
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p5IDT127040822
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(6nt)IDT127040823
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(8nt)IDT127040824
Agencourt® AMPure® XP - PCR Purification beads Beckman-CoulterA63880
Dynabeads® M-270 StreptavidinLife Technologies65305
COT Human DNA, Fluorometric Grade, 1 mgRoche Applied Science05480647001
Qubit® Assay Tubes Life TechnologiesQ32856
Qubit® dsDNA HS Assay KitLife TechnologiesQ32851
SeqCap® EZ Hybridization and Wash Kits  (24 or 96 reactions)Roche NimbleGen 05634261001 or 05634253001 
Qubit® 2.0 Fluorometer Life TechnologiesQ32866
10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x TE Solution)IDT
Tween20 BioXtraSigmaP7949-500ML
Nuclease Free WaterLife TechnologiesAM9937
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96–Well Fast Rection ModuleBiorad185-1196
SeqCap EZ Hybridization and Wash KitsRoche Applied Science05634253001
SuperScript II Reverse Transcription 200 U/μlLife Technologies18064-014
D1000 ScreenTapeAgilent Technol. Inc.5067-5582
Agencourt RNAClean XP - 40 mlBeckman Coulter IncA63987
RNA ScreenTapeAgilent Technol. Inc.5067-5576
RNA ScreenTape LadderAgilent Technol. Inc.5067-5578
RNA ScreenTape Sample BufferAgilent Technol. Inc.5067-5577
Sodium HydroxideSigma72068-100ML
DynaBeads MyOne Streptavidin T1Life Technologies65602
DYNAMAG -96 SIDE EACHLife Technologies12331D
ChloroformSigmaC2432-1L
KAPA HotStart ReadyMixKAPA BiosystemsKK2602
NanoDrop 2000 SpectrophotometerThermo Scientific
My Block Mini Dry BathBenchmarkBSH200
D1000 ReagentsAgilent Technol. Inc.5067- 5583
Vacufuge PlusEppendorf022829861 

Referenties

  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Mercer, T. R., et al. Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq. Nat Protoc. 9, 989-1009 (2014).
  3. Maher, C. A., et al. Chimeric transcript discovery by paired-end transcriptome sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12353-12358 (2009).
  4. Piskol, R., Ramaswami, G., Li, J. B. Reliable identification of genomic variants from RNA-seq data. Am J Hum Genet. 93, 641-651 (2013).
  5. Quinn, E. M., et al. Development of strategies for SNP detection in RNA-seq data: application to lymphoblastoid cell lines and evaluation using 1000 Genomes data. PLoS One. 8, e58815(2013).
  6. Tang, X., et al. The eSNV-detect: a computational system to identify expressed single nucleotide variants from transcriptome sequencing data. Nucleic Acids Res. 42, e172(2014).
  7. Invitrogen. Qubit dsDNA HS Assay Kit Manual. , Available from: http://www.science.smith.edu/cmbs/documents/QubitdsDNAHSAssay.pdf (2010).
  8. Agilent. Agilent D1000 ScreenTape System Quick Guide. , Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2964-90032_ScreenTape_D1000_QG.pdf (2013).
  9. Illumina. Preparing Libraries for Sequencing on the MiSeq®. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf (2013).
  10. Illumina. MiSeq® Reagent Kit v2 Reagen Preparation Guide. , Available from: https://support.illumina.com/downloads/miseq_reagent_kit_reagent_preparation_guide.html (2012).
  11. Andrews, S. FastQC. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
  12. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14, R36(2013).
  13. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
  14. Broad Institute. Picard. , Available from: http://picard.sourceforge.net/ (2014).
  15. DeLuca, D. S., et al. RNA-SeQC: RNA-seq metrics for quality control and process optimization. Bioinformatics. 28, 1530-1532 (2012).
  16. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
  17. Van der Auwera, G. A., et al. From FastQ data to high confidence variant calls: the Genome Analysis Toolkit best practices pipeline. Curr Protoc Bioinformatics. 11, 11.10.1-11.10.33 (2013).
  18. Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
  19. Iyer, M. K., Chinnaiyan, A. M., Maher, C. A. ChimeraScan: a tool for identifying chimeric transcription in sequencing data. Bioinformatics. 27, 2903-2904 (2011).
  20. Kim, D., Salzberg, S. L. TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel fusion transcripts. Genome Biol. 12, R72(2011).
  21. Fernandez-Cuesta, L., et al. Identification of novel fusion genes in lung cancer using breakpoint assembly of transcriptome sequencing data. Genome Biol. 16, 7(2015).
  22. Shugay, M., Ortiz de Mendibil,, Vizmanos, I., L, J., Novo, F. J. Oncofuse: a computational framework for the prediction of the oncogenic potential of gene fusions. Bioinformatics. 29, 2539-2546 (2013).
  23. Clark, M. B., et al. Quantitative gene profiling of long noncoding RNAs with targeted RNA sequencing. Nat Methods. 12, 339-342 (2015).
  24. Cieslik, M., et al. The use of exome capture RNA-seq for highly degraded RNA with application to clinical cancer sequencing. Genome Res. , (2015).
  25. Cabanski, C. R., et al. cDNA hybrid capture improves transcriptome analysis on low-input and archived samples. J Mol Diagn. 16, 440-451 (2014).
  26. Costa, C., Gimenez-Capitan, A., Karachaliou, N., Rosell, R. Comprehensive molecular screening: from the RT-PCR to the RNA-seq. Transl Lung Cancer Res. 2, 87-91 (2013).
  27. Zhao, W., et al. Comparison of RNA-Seq by poly (A) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling. BMC Genomics. 15, 419(2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

RNA capture assayribosomaal RNA depletiehybridisatie capturepost capture PCRgenexpressieanalysefusiedetectieenkelnucleotide variantendesktopsequencertranscriptverrijking
Gerichte RNA Sequencing Assay Gene Expression en Genomic Wijzigingen karakteriseren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.