Methodenartikel

Verwijdering van exogene materialen uit het buitenste gedeelte van Frozen Cores tot de Oude Biologische Gemeenschappen koesterde Inside Onderzoek

8.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54091

⸱

3 juli 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biogeochemical Sciences Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Hanover, NH, 2Environmental Processes Branch, Environmental Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Vicksburg, MS, 3Terrestrial and Cryospheric Scienes Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Hanover, NH, 4Biogeochemical Sciences Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Fairbanks, AK

In dit artikel

Samenvatting

De cryosfeer biedt toegang tot bewaarde organismen die bleef onder het verleden omgevingsomstandigheden. Een protocol wordt gepresenteerd te verzamelen en te ontsmetten permafrost kernen van de bodem en ijs. De afwezigheid van exogeen DNA kolonies en suggereren dat microorganismen gedetecteerd vertegenwoordigt de theorie en minder contaminatie door boren of verwerking.

Samenvatting

De ijskappen bieden toegang tot bewaarde organismen die onder vroegere omgevingsomstandigheden hebben overleefd. In feite kunnen deze bevroren materialen de omstandigheden over lange tijdsperioden weerspiegelen en onderzoek van biologische materialen die zich daarin bevinden, kan inzicht geven in oude omgevingen. Om deze ecosystemen goed te kunnen analyseren en zinvolle biologische informatie uit bevroren bodems en ijs te kunnen halen, is het noodzakelijk om de bevroren monsters op de juiste manier te verzamelen en te verwerken. Dit is vooral van cruciaal belang voor microbiële en DNA-analyses, omdat de aanwezige gemeenschappen zo uniek anders kunnen zijn dan moderne. Hier wordt een protocol gepresenteerd om bevroren kernen succesvol te verzamelen en te ontsmetten. Zowel het ontbreken van de kolonies die zijn gebruikt om het buitenoppervlak te dopen en exogeen DNA suggereren dat we de bevroren kernen succesvol hebben ontsmet en dat de gedetecteerde micro-organismen afkomstig waren van het materiaal, in plaats van besmetting door het boren of verwerken van de kernen.

Inleiding

De cryosfeer (bijv permafrost bodems, ijs eigenschappen, ijzige sneeuw, firn en ijs) biedt een kijkje in welke soorten organismen bleef onder het verleden omgevingsomstandigheden. Aangezien deze substraten tientallen kan zijn om honderden duizenden jaren oud, hun microbiële gemeenschappen, wanneer bewaard gebleven bevroren sinds de afzetting, weerspiegelen de oude milieu-omstandigheden. Om adequaat te analyseren deze ecosystemen en extract zinvolle biologische informatie van bevroren bodems en ijs, een goede inzameling en verwerking van de bevroren monsters nodig. Dit is van groot belang als het klimaat prognoses voor de 21e eeuw geven het potentieel voor een uitgesproken opwarming in arctische en sub-arctische gebieden 1. In het bijzonder, Interior Alaska en Groenland zullen naar verwachting op te warmen ongeveer 5 ° C en 7 ° C, respectievelijk in 2100 2,3. Dit zal naar verwachting grote invloed bodem en het aquatische microbiële gemeenschappen, en dus, aanverwantebiogeochemische processen. De warmere temperaturen en veranderde neerslag regime wordt verwacht dat permafrost afbraak in veel gebieden 2-5 kan leiden tot een dikkere, seizoen ontdooid (actieve) laag 6,7, het ontdooien van bevroren bodems, en het smelten van de massale ijs organen zoals initiëren gemalen ijs, ijs wiggen, en segregatie ijs 8. Dat zou dramatisch de biogeochemische attributen veranderen in aanvulling op de biodiversiteit van planten en dieren in deze ecosystemen.

Gletsjerijs en syngenetische permafrost sediment en ijs functies zijn gevangen chemische en biologische bewijs van een omgeving die wat daar woonde op het moment dat de functies gevormd. Bijvoorbeeld, in Binnenlands Alaska, zowel Illinoisan en Wisconsin jaar permafrost aanwezig zijn en deze permafrost in het bijzonder biedt unieke locaties daterend van modern tot 150.000 jaar voordat de huidige (YBP), die de biologische en geochemische bewijs van de Impa bevattenct van vroegere klimaatveranderingen op de biodiversiteit. Als gevolg van deze sedimenten geven een overzicht van de biogeochemie en de biodiversiteit gedurende vele duizenden jaren. Omdat het gebied heeft een lage sedimentatie tarieven en is nooit glaciated, ongestoorde monsters zijn toegankelijk voor het verzamelen en analyseren, ofwel boren verticaal in het bodemprofiel of boren horizontaal in tunnels. Wat nog belangrijker is, uitgebreide verslagen bestaan ​​die vooral wijzen op de unieke biogeochemische kenmerken van permafrost in deze regio 9-14. Met name de toepassing van DNA-onderzoek om de aanwezigheid en de omvang van de biodiversiteit te schatten, zowel in bestaande en oude ijs en permafrost samples maakt verkenning van de koppeling van de oude milieu-omstandigheden en de habitat aan bezetting door specifieke organismen.

Eerdere studies hebben klimatologische effecten op zoogdieren, planten en micro-organismen uit monsters dating tot 50k YBP 11, 15-19 geïdentificeerd, hoewel elk onderzoek gebruik gemaakt van een different methodologie voor het verzamelen en ontsmetten van de permafrost of ijskernen. In sommige gevallen werden de boorkernen gesteriliseerde 16, 20-21, hoewel de specifieke methodologie niet duidelijk of vreemde nucleïnezuren ook werden uit de monsters. In andere studies, bacteriële isolaten 15 (bijvoorbeeld Serratia marcescens) en fluorescente microsferen 22 zijn gebruikt om de effectiviteit van zuiveringsmethoden meten.

Dit experiment was onderdeel van een groter onderzoek naar microbiële gemeenschappen van permafrost monsters die teruggaat tot ongeveer 40k YBP. De specifieke doelstelling van dit deel van het onderzoek was om met succes te ontsmetten ijs en permafrost kernen. Voor zover wij weten, is er geen methode het gebruik van oplossingen volgens vreemde nucleïnezuren en geassocieerde nucleasen verwijderen uit het buitenste gedeelte van de bevroren kernen geïntegreerd. Dit ondanks het feit dat deze oplossingen commonly gebruikt om laboratoriumapparatuur decontamineren voor moleculaire experimenten.

Zodra de kernen werden gedecontamineerd, werd genomisch DNA geëxtraheerd met behulp van protocollen ontwikkeld door Griffiths et al. 23 en towe et al. 24, gekwantificeerd onder toepassing van een spectrofotometer en verdund met steriel, DNA-vrij water tot 20 ng per reactie te bereiken. Bacteriële 16S rRNA genen werden geamplificeerd met primers 331F en 797R en sonde BacTaq 25 en Archaea 16S rRNA genen werden geamplificeerd met primers Arch 349F en Arch 806R en sonde TM Arch 516F 26 onder de volgende voorwaarden: 95 ° C gedurende 600 seconden, gevolgd door 45 cycli van 95 ° C gedurende 30 sec, 57 ° C gedurende 60 sec en 72 ° C gedurende 25 sec met een laatste verlenging bij 40 ° C gedurende 30 sec. Alle qPCR reacties werden uitgevoerd in tweevoud. De 20 pi reactievolume inbegrepen 20 ng DNA, 10 uM primers, 5 uM van de sonde en 10 pl van het reactiemengsel qPCR. normen for bacteriën en archaea qPCR werden bereid met behulp van genoom DNA van Pseudomonas fluorescens en Halobacterium Salinarum, respectievelijk. Beiden werden gekweekt tot fase in te loggen. Plaattellingen uitgevoerd en DNA werd geïsoleerd uit de kweken. Genoom DNA werd gekwantificeerd met een spectrofotometer met de aanname van één en zes exemplaren van de 16S rRNA gen per genoom voor H. Salinarum en P. fluorescens, respectievelijk 27-28. Kopieaantallen van de bacteriën en archaea genen werden berekend op basis van de standaardcurve, log-getransformeerde om rekening te houden ongelijke verschillen tussen behandelingen, en beoordeeld door ANOVA.

Community samenstelling werd bepaald door het sequencen van het 16S rRNA-gen met behulp van stroom cellen en de brug versterking technologieën en analyseren van de gemeenschappen 'kwantitatieve inzichten in microbiële ecologie' (QIIME) 29. Vooruit en achteruit leest werden samengevoegd en vervolgens sequenties werden gefilterd, geïndexeerd,en vertegenwoordigers van hoge kwaliteit werden geselecteerd voor de novo operationele taxonomische eenheden (OTU) toewijzing door middel van sequentie-uitlijning met een referentie-database. Gealigneerde sequenties werden vergeleken met een afzonderlijke referentiedatabank voor taxonomische opdracht. Een phylum niveau OTU tafel werd opgericht om de algemene gemeenschap samenstelling te bepalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. apparatuur Voorbereiding en Permafrost Core Collection

  1. Apparatuur voorbereiding en veldmonster verzamelen en bewaren gear
    1. Monteer vijzel voor het monster collectie door het plaatsen van de drive-adapter in de bovenkant van het vat en het draaien van de hendel om het te vergrendelen. Speld de adapter slang op de drive-adapter en pin de motor op de adapter buis. Plaats de messen op het vat.
    2. Draag lichte pakken, nitril handschoenen en maskers om verontreiniging om de monsters te verminderen. Draag oorbeschermers en een helm voor de veiligheid bij het ​​binnenkomen Permafrost Tunnel (figuur 1).
    3. Ga de tunnel in en selecteer een locatie om de monsters (Figuur 1B) te verzamelen.
      Opmerking: Voor verticale of horizontale boringen plaats, selecteert u een gebied waar kan worden aangetoond dat het materiaal is bevroren (bijvoorbeeld ijs of permafrost) bekend is, is er geen bekende grote wortel systemen, en er is geen bekende gravel. alles verwijderenlevend plantenmateriaal van het gebied voor het verzamelen van een monster. Als verticaal of horizontaal boren, selecteer een gebied dat is relatief vlak en toegankelijk met de vijzel.
    4. Bereid een werkstation van de grond lagen een kunststof materiaal dat is gesteriliseerd met 70% isopropanol, DNA decontaminatie oplossing en RNase decontaminatie oplossing.
    5. Plaats een 10 cm diameter polyvinylchloride (PVC) pijp gesneden in de lengte op het werkstation om een ​​trog te bieden aan de kernen in bezit als van de grondboor worden verwijderd. Ontsmet de PVC-buis met 70% isopropanol, DNA decontaminatie-oplossing, en RNase decontaminatie oplossing.
    6. In de buurt van de werkplek, ontsmetten de boor door te besproeien met 70% isopropanol, DNA decontaminatie-oplossing, en RNase decontaminatie oplossing. Verwijder oplossingen van de vijzel met een doekje.
  2. Ijs en permafrost kerncollectie en opslag
    1. Selecteer een gebied van de wand monster (zie 1.2.1Notitie).
    2. Ontsmet ongeveer 10 cm diameter van bevroren muur gebied schoon met 70% isopropanol, DNA decontaminatie-oplossing, en RNase decontaminatie oplossing.
    3. Verhoog de ​​gedecontamineerd vijzel om het gebied van belang, dat deze loodrecht op het monster stippellijn beginnen boren in de gereinigde van de wand (figuur 1C, D).
    4. Haal de boor uit monstername omgeving. Koppel de vijzel van de motor en plaats de boor boven het steriele PVC pijp in de schone werkplek. Kantelen vijzel zorgvuldig zodanig dat de bevroren kernen glijden op de steriele PVC-buis (figuur 1E).
    5. Ontsmet handschoenen met 70% isopropanol, DNA decontaminatie-oplossing, en RNase decontaminatie oplossing.
    6. Pick-up het ijs en permafrost kernen met steriele handschoenen en plaats ze in steriele zakken.
    7. Plaats de kernen in een koeler of koude kamer tot ze worden verzonden of verwerkt.
    8. Ship de bevroren kernen middels droogijs te handhaven bij een temperatuur onder 0 ° C.
    9. Onmiddellijk slaan de kernen bij -80 ° C.

2. Permafrost and Ice Core Processing

  1. materiaal Voorbereiding
    1. Bereid steriele nucleïnezuur vrij zware aluminiumfolie, metalen rekken, glaswerk, metaal tang en glaswol door bakken in een oven bij 450 ° C gedurende 4 uur. Zet opzij deze materialen tot gebruik.
    2. Steriliseren 95% ethanol en ultrapuur water door het passeren van de oplossingen door een 0,22 pm filter.
    3. WINKEL ethanol oplossing bij -20 ° C en water bij 4 ° C.
    4. Steriliseren een plastic liniaal worden bespoten met 70% ethanol, DNA decontaminatie oplossing en RNase decontaminatie oplossing onmiddellijk afvegen na elke oplossing.
  2. Bacteriekweek Bereiding
    1. Bereid bouillon platen en Serratia marcescens groeien.
      1. Voor de bouillon, combineer 5 g tryptone, 1 g glucose, 5 g gistextract en 1 g kalium dibasisch en voeg gedestilleerd water tot 1 L. bereiken om platen te maken, voeg 15 g agar de bovenstaande mix. Voor medium en platen, de pH instellen op 7 en autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 minuten.
    2. Bereid 1x fosfaat afgeslepen zoutoplossing (PBS) door het combineren van 8 g natriumchloride, 0,2 g kaliumchloride, 1,44 g dibasisch natriumfosfaat en 0,24 g monobasisch kaliumfosfaat en gedestilleerd water tot 800 ml te bereiken. Stel de pH tot 7,4 en voeg gedestilleerd water tot 1 L. Autoclaaf bereiken op 121 ° C gedurende 15 min.
    3. Inoculeren bouillon met een steriele lus door dompelen in de S. marcescens cultuur die eerder opgeslagen werd bevroren bij -80 ° C. Onder aseptische omstandigheden, seriële verdunde de cultuur door het toevoegen van 1 ml van de cultuur tot 9 ml PBS en handmatig keren de oplossing. Voeg 1 ml van deze verdunning met 9 ml PBS en de oplossing handmatig omdraaien. Herhaal dit nog acht keer, totdat een 10 -9 Dilutie wordt bereikt.
    4. Spreid de 10 -6, -7 10, 10 -8, 10 -9 en oplossingen op agarplaten door het verspreiden van 1 ml bouillon op de plaat en verspreiden met een mobiele spreader. Doe dit in drievoud per verdunning. Bewaar de oorspronkelijke cultuur bij 4 ° C.
    5. Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 24 uur. Tel het aantal kolonies tot het aantal cellen berekenen de oorspronkelijke cultuur. Opmerking: Het aantal kolonies in de oorspronkelijke cultuur is afhankelijk van de groeisnelheid van de bacteriën.
    6. Pipetteer 250 ul van de oorspronkelijke kweek in een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis. Verdun oorspronkelijke cultuur met voldoende volume van de 1x PBS voegen zoals bepaald met kiemgetal in de vorige stap tot ongeveer 10 9 cellen / ml te verkrijgen. Pellet de cellen in een microcentrifugebuis door centrifugeren bij 2500 xg gedurende 10 min.
      Opmerking: Het volume van 1x PBS is afhankelijk van de groeisnelheid van de bacteriën.
    7. Steriel biohood, Pipet uit de bouillon en resuspendeer de cellen in 1 ml 1x PBS-buffer. Bewaren bij 4 ° C tot gebruik of ongeveer twee maanden.
    8. Op de dag van verwerking verdunnen S. marcescens kweek uit stap 2.2.7 door toevoeging van 1 ml van de oorspronkelijke S. marcescens cultuur 39 ml 1x PBS buffer in een 50 ml centrifugebuis.
  3. Bereid koude ruimte voor core processing en bewaring gear
    1. Voorafgaand aan het koelen de koude kamer, schoon muren, vloeren en metalen tafel met een 1% bleekwater oplossing.
    2. Ingestelde temperatuur van de koelruimte tot ongeveer -11 ° C.
    3. Zodra de koude kamer de gewenste temperatuur heeft bereikt, slijtage lichte kostuums, nitril handschoenen en maskers om verontreiniging aan de koude kamer en de monsters te verminderen.
      Opmerking: Twee correct gekleed personen nodig zijn voor deze procedure.
    4. Breng de steriele materialen (bv, aluminiumfolie, metalen rekken, glaswerk, dienblad, S. marcescens cultuur, en microtome mes) en samples in de koude kamer en plaats op de steriele tafel.
  4. Permafrost en ijs core processing in een koude kamer faciliteit
    1. Plaats een permafrost kern op een steriele, nucleïnezuur vrij vel aluminiumfolie.
    2. Licht enten de buitenkant van de kern met de verdunde kweek van S. marcescens met een steriele schuimplug (figuur 2B).
    3. Plaats de kern van de steriele metalen rek die zit boven een lade.
    4. Steriliseer de stalen microtoom mes met 70% ethanol, DNA decontaminatie-oplossing, en RNase decontaminatie oplossing.
    5. Hebben individuele Een schone nitril met 70% ethanol, DNA decontaminatie-oplossing, en RNase decontaminatie oplossing en houdt de kern in een hoek van 45 ° boven de lade.
    6. Hebben individuele B voorzichtig schrapen ongeveer 5 mm van de buitenzijde van de gehele kern, met inbegrip van de uiteinden met behulp van de steriele mes terwijl bij particuliere A draait de kern na elke schrapen ( Figuren 2C en 3A, B). Veeg het mes met 70% ethanol, DNA decontaminatie oplossing en RNase decontaminatie oplossing nodig.
    7. Hebben individuele B pour-filter gesteriliseerde 95% ethanol over de kern zorgvuldig en snel, terwijl de persoon Een draait de kern als de oplossing wordt uitgegoten (Figuren 2D, 3C).
    8. Hebben individuele B de kern met filter gesteriliseerd water onmiddellijk te spoelen.
    9. Vervang de gebruikte metalen rek op dienblad met een nieuwe steriele metalen rek.
    10. Hebben persoon Een schoon te maken zijn of haar nitril met 70% ethanol, DNA decontaminatie-oplossing, en RNase decontaminatie oplossing en houdt de kern in een hoek van 45 ° boven de lade.
    11. Hebben individuele B spuit de hele kern met DNA decontaminatie-oplossing.
    12. Hebben individuele B de kern met filter gesteriliseerd water onmiddellijk te spoelen.
    13. Hebben individuele B spuit de hele kern met RNase decontaminatie oplossing.
    14. hebben IndividuB al onmiddellijk spoelen de kern met filter gesteriliseerd water.
    15. Plaats de kern op een steriel vel aluminiumfolie en licht wrap.
  5. Dooi buitenkern
    1. Plaats een steriele metalen rek over een steriele glazen schaal in een steriele biohood met laminaire stroming.
    2. Plaats twee agarplaten specifieke S. marcescens in de glazen schaal onder de steriele rek vloeistof te verzamelen van de kern (figuur 2E).
    3. Plaats de kern van de steriele metalen rek.
    4. Rekening met ongeveer 2-5 mm van het buitenoppervlak van de kern te ontdooien bij 23 ° C (gemiddeld zal dit gebeuren binnen ongeveer 10 min). Draai de kern ongeveer 90 ° verder 2 min.
    5. Zwabberen gehele oppervlak van de kern met behulp van een steriel pincet en steriele glaswol en het enten van twee agarplaten die specifiek zijn voor S. marcescens zwabberen van deze materialen op het oppervlak van de platen. Enten twee nieuwe platen met de oorspronkelijke cultuur gebruikt om de buitenkant van de dopekern, die werd blootgesteld aan lage temperaturen van de koude kamer.
    6. Meet buitenafmetingen van ontdooid cilindrische kern door het plaatsen van een steriel heerser in de buurt, maar de kern niet te raken.
    7. Plaats de kern in grote steriele zak en het op -80 ° C.
  6. Controleer op groei
    1. Incubeer agarplaten bij 23 ° C gedurende één week.
    2. Onderzoek agarplaten groei van S. marcescens kolonies.
      1. Als er geen zichtbare kolonies op de plaat, ga dan naar stap 2.5.3.
      2. Als kolonies verschijnen op de plaat, herhaal stap 2.1.1 in hoofdstuk 2 "Permafrost en ijskern processing".
    3. Het verkrijgen van de kern van de vriezer en aseptisch overbrengen naar een steriele zak.
    4. Bewaar de kern in een steriele zak bij 4 ° C gedurende ongeveer 24-48 uur om de gehele kern ontdooien.

3. Zorg deelsteekproef voor Nucleic Acid Extraction uit ijskernen en Permafrost

  1. Nucleïnezuur extractie uit ijskernen
    1. Meng de ontdooide materiaal uit de ijskern door voorzichtig schudden van de zak (figuur 2G).
    2. Giet het ontdooide materiaal in een steriele fles met een 0,22 urn filter onder vacuüm microorganismen verzamelen.
    3. Aseptisch verwijder het filter met steriel pincet en plaats deze in een steriele 2 ml keramische kraal buis (1,4 mm).
    4. Bewaar het filter bij -80 ° C.
  2. Nucleïnezuur extractie uit permafrost kernen
    1. Meng de ontdooide materiaal uit de permafrost kern door zachtjes te kneden de zak.
    2. Nadat de permafrost is goed gemengd, het verkrijgen van een subgroep van ongeveer 0,5 g bulk bodem met een steriele scoopula en plaats deze in een getarreerd steriele 2 ml kraal keramiek schroefdop buis (1,4 mm) die rechtop zit op een evenwicht.
    3. Store subsamples bij -80 ° C.
    4. Verkrijgen gravimetrische watergehalte van de monsters.
      1. Maatregel 10 g van de permafrost met een sterielee scoopula en plaats in een getarreerde tin op een evenwicht. Meet natte massa van de permafrost en tin.
      2. Incubeer permafrost in een oven ingesteld op 105 ° C gedurende 24 uur. Meet de droge massa van de permafrost en tin.
      3. Bereken de gravimetrische watergehalte door het aftrekken van de natte massa van permafrost van het drooggewicht van de permafrost en te delen door het drooggewicht van permafrost.
    5. WINKEL permafrost bij -80 ° C.

4. Uittreksel nucleïnezuren uit Permafrost en Ice Cores

  1. materiële voorbereiding
    1. Bereid amberkleurige flesjes oplossingen houden door behandeling met 0,1% diethylpyrocarbonaat (DEPC), incuberen O / N bij 37 ° C, en autoclaaf.
    2. Bereid 240 mM kaliumfosfaat bufferoplossing. 2. Voeg 5 g monobasisch kaliumfosfaat en 38,7 g dibasisch kaliumfosfaat. Pas uiteindelijke volume tot 500 ml door het toevoegen van steriel water.
    3. Bereid hexadecyltrimethylammoniumbromide (CTAB) extractie buffer door het oplossen van 4,1 g natriumchloride in 80 ml water langzaam toevoegen van 10 g CTAB onder verwarming en roeren. Pas uiteindelijke volume tot 100 ml door het toevoegen van steriel water.
    4. Voeg gelijke volumes fosfaatbufferoplossing en CTAB-buffer en filter gesteriliseerd met een 0,22 urn filter. Bedek fles met aluminiumfolie en bewaar bij kamertemperatuur.
    5. Bereid 1,6 M natriumchloride (NaCl) door het combineren van 9,35 g NaCl en 100 ml steriel water. 10 g polyethyleenglycol 8000 met de 1,6 M NaCl-oplossing en filter steriliseren. Bewaren bij 4 ° C.
  2. Nucleïnezuur extractie volgens een gemodificeerde versie van Griffiths et al. 22 en towe et al. 23
    1. Draag lichte pakken, nitril handschoenen en maskers. Schone laboratoriumruimte en pipetten met 70% ethanol, DNA decontaminatie oplossing en RNase decontaminatie oplossing.
    2. Verwijder deelmonster (filter uit ijskern of permafrost bodemmonster) in 2 ml kraal keramiek schroef-cap buis van -80 ° C vriezer en ontdooien bij kamertemperatuur.
    3. Voeg 0,5 ml van hexadecyltrimethylammoniumbromide (CTAB) extractie buffer en vortex kort.
    4. Voeg 0,5 ml fenol-chloroform-isoamylalcohol (25: 24: 1) (pH 8) en schud buizen horizontaal gedurende 10 min met behulp van een vlakke plaat adapter op een vortexer.
    5. Na kraal-beating centrifugebuizen bij 16.100 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
    6. Verwijderen waterlaag een nieuwe steriele buis van 1,5 ml en meng met een gelijk volume chloroform-isoamylalcohol (24: 1). Centrifugeer bij 16.100 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
    7. Verwijderen waterlaag een nieuwe steriele 1,5 ml buis en voeg twee volumes van 30% polyethyleenglycol 8000 en 1,6 M NaCl. Incubeer gedurende 2 uur bij 4 ° C.
    8. Centrifugeer bij 16.100 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
    9. Was nucleïnezuur pellet met ongeveer 500 ul ijskoude 70% ethanol en centrifugeer bij 16.100 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
    10. Air droge pellet in een steriele biohood gedurende 2 uur. Resuspendeer in 50 ul DNase / RNase-vrij TE buffer (pH 8,0). DNA is klaar voor verdere toepassingen zoals PCR en qPCR.
    11. Bepaal de concentratie van DNA met een spectrofotometer.
    12. Verdun DNA met steriel, DNA-vrij water tot 20 ng per reactie te bereiken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De onderhavige methode kan worden gebruikt om ingevroren monsters uit verschillende milieus cryosfeer saneren van glacial ijs permafrost. Hier presenteren we data specifiek verzameld van ijs en permafrost monsters van de Engineering Research and Development Center - koude gebieden Research and Engineering Laboratory (ERDC-CRREL) Permafrost Tunnel gelegen in Fox, AK (figuur 1A en 1B). De Permafrost Tunnel zich ongeveer 110 m in de zijkant van Goldstream v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De cryosfeer biedt toegang tot bewaarde organismen die bleef onder het verleden omgevingsomstandigheden. Hoewel de herstelde taxa de complete historische gemeenschap niet mogen vertegenwoordigen, kunnen die hersteld van de analyse van gletsjerijs en permafrost monsters waardevolle historische informatie over select perioden 15-16 opleveren. Zo heeft zinvolle biologische gegevens zijn ontleend aan ijs onderzoeken naar anaërobe activiteit in de Groenlandse ijskap 20 en permafrost studies onderzoeken ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door het U.S. Army Engineer Research and Development Center, Basic Research Program Office. Toestemming voor het publiceren van deze informatie is verleend door de Chief of Engineers.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AugerSnow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK
70% IsopropanolWalmart551116880
95% Ethyl Alcohol (denatured) Fisher Scientific, Pittsburgh, PAA407-4
DNA decontamination solution, DNA AwayMolecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA7010
RNase decontamination solution, RNase AwayMolecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA 7002
Light Duty SuitsKimberly-Clark Professional, Roswell, GA10606
Nitrile GlovesFisher Scientific, Pittsburgh, PAFFS-700
Antiviral MasksCurad, WalgreensCUR3845
Sterile Sample Bags Nasco, Fort Atkinson, WIB01445
Steel Microtome Blade B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC
Metal RackFabricated at CRREL, Hanover, NH
TrayHandy Paint Products, Chanhassen, MN7500-CC
Aluminum FoilWestern Plastics, Temecula, CA
500 ml Bottle with 0.22 μm FilterCorning, Corning, NY430513
Serratia marcescensATCC, Manassas, VA17991
Biosafety HoodNuAire, Plymouth, MNNU-425-400
Petri DishFisher Scientific, Pittsburgh, PAFB0875712
ATCC Agar 181- TryptoneAcros Organics, NJ61184-5000
ATCC Agar 181- GlucoseFisher Scientific, Pittsburgh, PABP381-500
ATCC Agar 181- Yeast ExtractFisher Scientific, Pittsburgh, PABP1422-500
ATCC Agar 181- Dipotassium PhosphateJT Baker, Phillipsburg, NJ3252-01
ATCC Agar 181- AgarDifco, Sparks, MD214530
NanoDrop 2000 UV Vis SpectrophotometerThermo Fisher Scientific, Wilmington, DE
Lightcycler 480 SystemRoche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN
Halobacterium salinarumAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Pseudomonas fluorescensAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Microbial DNA Isolation KitMoBio Laboratories, Carlsbad, CA12224-50
Ear ProtectionElvexEP-201
Hard Hat
KimwipesKimberly-Clark Professional, Roswell, GA34705
Glass WoolPyrex430330
Ruler
Weighing Tin Fisher Scientific, Pittsburgh, PA08-732-100
Sodium chlorideSigma Aldrich, St Louis, MOS-9625
Potassium chlorideJT Baker, Phillipsburg, NJ3040-04
Potassium phosphate, monobasicJT Baker, Phillipsburg, NJ 3246-01
Potassium phosphate, dibasicJT Baker, Phillipsburg, NJ3252-01
Sodium phosphate dibasic, anhydrousFisher Scientific, Pittsburgh, PABP332-500
50 ml Centrifuge TubesCorning, Corning, NY4558
2 ml Microcentrifuge TubesMoBio Laboratories, Carlsbad, CA1200-250-T
2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm)MoBio Laboratories, Carlsbad, CA13113-50
ScoopulaThermo Fisher Scientific, Wilmington, DE1437520
BalanceOhaus, Parsippany, NJE12130
Diethylpyrocarbonate (DEPC)Sigma Aldrich, St Louis, MOD5758
Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB) Acros Organics, NJ22716-5000
Polyethylene glycol 8000 Sigma Aldrich, St Louis, MOP5413-1KG
Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8) Fisher Scientific, Pittsburgh, PABP1752-400
CentrifugeEppendorf, Hauppauge, NY5417R
Chloroform-isoamyl alcohol (24:1)Sigma Aldrich, St Louis, MOC0549-1PT
TE BufferAmbion (Thermo Fisher), Wilmington, DEAM9860
PipetsRainin, Woburn, MAPipet Lite XLS, 2, 10, 200, and 1,000 µl pipets
Pipet tipsRainin, Woburn, MARainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1,000 µl
VortexorScientific Industries, Bohemia, NYG-560
Vortex AdaptorMoBio Laboratories, Carlsbad, CA13000-V1
Clear BottleCorning, Corning, NYC1395500
Amber BottleCorning, Corning, NYC5135250
Bottle Top Filters, 0.22 µmCorning, Corning, NY430513
60 ml SyringeBecton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJBD 309653
Millex Syringe filters, 0.22 μmEMD Millipore, Billerica, MASLGV033RB
70% EthanolFisher Scientific, Pittsburgh, PABP2818-500diluted & filter sterilized
Isotemp 100 L OvenFisher Scientific, Pittsburgh, PA151030511
Cell SpreaderFisher Scientific, Pittsburgh, PA08-100-10
Disposable Inoculating LoopsFisher Scientific, Pittsburgh, PA22-363-602

Referenties

  1. Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2007: The Physical Science Basis. Solomon, S., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, United Kingdom. (2007).
  2. Marchenko, S., Romanovsky, V., Tipenko, G. Numerical Modeling of Spatial Permafrost Dynamics in Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. University of Alaska Fairbanks, 29, 1125-1130 (2008).
  3. Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2014: Synthesis Report. Contributions of Working Groups I, II, and III to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Pachauri, R. K., Meyer, L. A. , Intergovernmental Panel on Climate Change. Geneva, Switzerland. (2007).
  4. Osterkamp, T. E., Romanovsky, V. E. Evidence for warming and thawing of discontinuous permafrost in Alaska. Permafr. Periglac. Process. 10 (1), 17-37 (1999).
  5. Wolken, J. M., et al. Evidence and implications of recent and projected climate change in Alaska's forest ecosystems. Ecosphere. 2 (11), 1-35 (2011).
  6. Hinzman, L. D., Kane, D. L., Gieck, R. E., Everett, K. R. Hydrologic and thermal properties of the active layer in the Alaskan Arctic. Cold Reg. Sci. Technol. 19 (2), 95-110 (1991).
  7. Hinzman, L. D., Goering, D. J., Kane, D. L. A distributed thermal model for calculating temperature profiles and depth of thaw in permafrost regions. J. Geophys. Res.: Atmos. 103 (D22), 28975-28991 (1998).
  8. Osterkamp, T. E., Jorgenson, J. C. Warming of Permafrost in the Arctic National Wildlife Refuge. Alaska. Permafr. Periglac. Process. 17, 65-69 (2006).
  9. Petrone, K. C., Jones, J. B., Hinzman, L. D., Boone, R. D. Seasonal export of carbon, nitrogen, and major solutes from Alaskan catchments with discontinuous permafrost. J. Geophys. Res. 111, G02020(2006).
  10. Guo, L., Ping, C. -L., Macdonald, R. W. Mobilization pathways of organic carbon from permafrost to arctic rivers in a changing climate. Geophys. Res. Lett. 34 (13), L13603(2007).
  11. Katayama, T., et al. Phylogenetic analysis of bacteria preserved in a permafrost ice wedge for 25,000 years. Appl. Environ. Microbiol. 73 (7), 2360-2363 (2007).
  12. Katayama, T., et al. Glaciibacter superstes gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Microbacteriaceae isolated from a permafrost ice wedge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59, 482-486 (2009).
  13. Waldrop, M. P., White, R., Douglas, T. A. Isolation and identification of cold-adapted fungi in the Fox Permafrost Tunnel, Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. , 1887-1891 (2008).
  14. Douglas, T. A., et al. Biogeochemical and geocryological characteristics of wedge and thermokarst-cave ice in the CRREL Permafrost Tunnel. Alaska Permafr. Periglac. Process. 21 (2), 120-128 (2011).
  15. Willerslev, E., et al. Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments. Science. 300 (5620), 791-795 (2003).
  16. Bellemain, E., et al. Fungal palaeodiversity revealed using high-throughput metabarcoding of ancient DNA from Arctic permafrost. Environ. Microbiol. 15 (4), 1176-1189 (2013).
  17. Steven, B., Pollard, W. H., Greer, C. W., Whyte, L. G. Microbial diversity and activity through a permafrost/ground ice core profile from the Canadian high Arctic. Environ. Microbiol. 10 (12), 3388-3403 (2008).
  18. Lorenzen, E. D., et al. Species-specific responses of Late Quaternary megafauna to climate and humans. Nature. 479 (7373), 359-364 (2011).
  19. Wilhelm, R. C., Radtke, K., Mykytczuk, N. C. S., Greer, C. W., Whyte, L. G. Life at the wedge: The activity and diversity of Arctic ice wedge microbial communities. Astrobiol. 12 (4), 347-360 (2012).
  20. Sheriden, P. P., Miteva, V. I., Brenchley, J. E. Phylogenetic analysis of anaerobic psychrophilic enrichment cultures obtained from a Greenland glacier ice core. Appl. Environ. Microbiol. 69 (4), 2153-2160 (2003).
  21. Rivkina, E., et al. Biogeochemistry of methane and methanogenic archaea in permafrost. FEMS Microbiol. Ecol. 61 (1), 1-15 (2007).
  22. Juck, D. F., et al. Utilization of fluorescent microspheres and a green fluorescent protein-marked strain for assessment of microbiological contamination of permafrost and ground ice core samples from the Canadian High Arctic. Appl. Environ. Microbiol. 71 (2), 1035-1041 (2005).
  23. Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O'Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
  24. Töwe, S., et al. Improved protocol for the simultaneous extraction and column-based separation of DNA and RNA from different soils. J. Microbiol. Methods. 84 (3), 406-412 (2011).
  25. Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257-266 (2002).
  26. Takai, K., Horikoshi, K. Rapid detection and quantification of members of the archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes. Appl. Environ. Microbiol. 66 (11), 5066-5072 (2000).
  27. Fogel, G. B., Collins, C. R., Brunk, C. F. Prokaryotic genome size and SSU rDNA copy number: Estimation of microbial relative abundance from a mixed population. Microb. Ecol. 38, 93-113 (1999).
  28. Bodilis, J., Nsigue-Meilo, S., Besaury, L., Quillet, L. Variable copy number, intra-genomic heterogeneities and later transfers of the 16S rRNA gene in Pseudomonas. PLOS One. 7, e35647(2012).
  29. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
  30. Sellmann, P. V. Geology of the USA CRREL permafrost tunnel, Fairbanks, Alaska. US Army Cold Reg. Res. Eng. Lab. Technical Rep. 199. , New Hampshire. (1967).
  31. Sellmann, P. V. Additional information on the geology and properties of materials exposed in the USA CRREL permafrost tunnel. US Army CRREL Special Rep. , (1972).
  32. Christner, B. C., Mikucki, J. A., Foreman, C. M., Denson, J., Priscu, J. C. Glacial ice cores: A model system for developing extraterrestrial decontamination protocols. Icarus. 174 (2), 572-584 (2005).
  33. Mackelprang, R., et al. Metagenomic analysis of a permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw. Nature. 480 (7377), 368-371 (2011).
  34. Champlot, S., et al. An efficient multistrategy DNA decontamination of PCR reagents for hyper sensitive PCR applications. PLoS One. 5 (9), e13042(2010).
  35. Yergeau, E., Hogues, H., Whyte, L. G., Greer, C. W. The functional potential of high Arctic permafrost revealed by metagenomic sequencing, qPCR, and microarray analyses. The ISME J. 4 (9), 1206-1214 (2010).
  36. Welzl, G., Schloter, M. Bacterial community structure in soils of the Tibetan Plateau affected by discontinuous permafrost or seasonal freezing. Biol. Fertil. Soils. 50 (3), 555-559 (2014).
  37. Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol. Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
  38. Wagner, D., Kobabe, S., Liebner, S. Bacterial community structure and carbon turnover in permafrost-affected soils of the Lena Delta, northeastern Siberia. Can. J. Microbiol. 55 (1), 73-83 (2009).
  39. Jiang, N., et al. Characteristic microbial communities in the continuous permafrost beside the bitumen in Qinghai-Tibetan Plateau. Environ. Earth Sci. 74, 1343-1352 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Decontaminatie van bevroren kernencryosfeeranalysepermafrostbemonsteringverwerking van ijskernensteriele techniekcontrole van DNA contaminatiedetectie van Serratia marcescenskouderekamerprotocolanalyse van microbi le gemeenschappen16S rRNA sequencing

Gerelateerde artikelen