Tissue Engineering door Intrinsic Vascularisatie in een In Vivo Tissue Engineering Chamber

Samenvatting

Dit is een richtlijn voor het construeren van in vivo vasculair weefsel met behulp van een microchirurgische arterioveneuze lus of een doorstromende pedikkelconfiguratie binnen een weefselengineeringkamer. De gegenereerde vasculaire weefsels kunnen worden gebruikt voor orgaanregeneratie en vervanging van weefselderven, evenals voor medicijntesten en ziektemodellering.

Samenvatting

In reconstructieve chirurgie, is een klinische behoefte aan een alternatief voor de huidige methoden van autologe reconstructie die ingewikkeld en duur en handel een defect voor een ander zijn. Tissue engineering houdt de belofte om deze toenemende vraag te pakken. Echter, de meeste tissue engineering strategieën falen om een ​​stabiele en functionele weefsel vervangers vanwege de slechte vascularisatie te genereren. Dit artikel richt zich op een in vivo tissue engineering kamer model van de intrinsieke vascularisatie waarbij een perfusie slagader en een ader ofwel als een arterioveneuze lus of een flow-through uitloper configuratie is gericht in een beschermde holle kamer. In deze kamer-gebaseerde systeem optreedt angiogene ontspruit uit de arterioveneuze schepen en dit systeem trekt ischemische en inflammatoire gedreven endogeen celmigratie die geleidelijk vult de kamer ruimte met fibro-vasculair weefsel. Exogene cel / matrix implantatie ten tijde van de kamer bouw verbetert cel survival en bepaalt specificiteit van de gemanipuleerde weefsels die zich ontwikkelen. Onze studies hebben aangetoond dat deze kamer model succesvol genereren verschillende weefsels zoals vet, hartspier, lever en anderen. Echter, modificaties en verfijningen moeten doelweefsel vorming consistent en reproduceerbaar te waarborgen. Dit artikel beschrijft een gestandaardiseerd protocol voor de productie van twee verschillende gevasculariseerde weefselmanipulatie kamermodellen in vivo.

Inleiding

Vervaardigen van functionele doorbloed weefsel met behulp van een tissue engineering aanpak is een opkomende paradigma in de regeneratieve geneeskunde. ^1,2 Veel benaderingen van nieuwe en gezond weefsel ingenieur voor de vervanging van beschadigd weefsel of defecte organen zijn ontwikkeld, ^3-6 experimenteel in kleine dierlijke modellen met veelbelovende klinische potentieel. ^7,8 Toch vascularisatie blijft een van de grote uitdagingen voor de tissue engineering beperken van de mogelijkheden om weefsels van klinisch relevante omvang groeien. ⁹

De huidige aanpak om weefsel vascularizeren volgen ofwel een extrinsieke route waar nieuwe schepen groeien vanuit de ontvanger vasculaire bed en binnen te dringen in de hele geïmplanteerde weefsel construeert ¹⁰ of een intrinsieke vascularisatie route, waar het vaatstelsel groeit en breidt uit in harmonie met de nieuw te ontwikkelen weefsel. ¹¹ De extrinsieke benadering traditioneel omvat zaaien cellen op een steigerin vitro en implanteren van de volledige construct in het levende dier met de verwachting dat voedingsstoffen, eerder door kweekmedia geleverd, wordt aangeleverd door circulatie. ^12,13 Het concept is simpel vasculaire ingroei te langzaam en slechts zeer dunne implantaten (< 1-2 mm dik) zal levensvatbaar blijven. Verschaffen van voedingsstoffen en zuurstof door middel van een voldoende snelle en vascularisatie is de kern van elke succesvolle pogingen om complexere en grotere weefselengineering substituten zoals bot, spier, vet en vaste organen groeien. ^14,15 Intrinsieke vascularisatie sector stelt grotere constructies te ontwikkelen door progressieve groei van weefsel in verhouding met zijn uitbreiden bloedtoevoer. Een ontwerp is de in vivo implantatie in een kamer van een vaatsteel met of zonder cellen geënte scaffold. ^5,6 Dit heeft de weg naar nieuwe procedures voor het genereren van dikkere intrinsiek gevasculariseerde weefsels vrijgemaakt. ^16,17

Recenter hebben strategieën ontwikkeld om vooraf vasculariseren weefseltransplantaten, vóór implantatie. Deze opgenomen bloedvat netwerken zijn erop gericht om te doen vergroeien met de ontvangende schepen op implantatie waardoor de snelle levering van een compleet bloedtoevoer naar de overleving van alle onderdelen van een getransplanteerd dikke weefsel graft te verbeteren. ¹⁸

We zijn voorlopers een in vivo doorbloed tissue engineering model in kleine dieren die een subcutaan geïmplanteerd halfharde omsloten ruimte met daarin een perfusie vaatsteel en-cel met biomaterialen gaat. De kamer creëert een ischemische omgeving die angiogene ontspruit uit de geïmplanteerde vaten stimuleert. ³ De vaatsteel kan ofwel een gereconstrueerd arterioveneuze lus of een intacte doorstroming slagader en ader zijn. ^3-6,19 Deze vaatsteel spruiten een goed functionerende en uitgebreide arterio -capillary-veneuze netwerk dat verbindt aan beide arteriole en veneuze eindigt met de vaatsteel. ^3,20 Bovendien, de omliggende holle hulpkamer beschermt de ontwikkeling van weefsel van potentieel vervormen mechanische krachten en verlengt de ischemische drive om vascularisatie te verbeteren. ^3,21,22 Als het schip uitloper eenvoudig in is geïmplanteerd normaal weefsel en niet in de beschermde ruimte van de kamer, angiogenese houdt langs dezelfde tijdlijn als een normale wond en geen nieuw weefsel ophopen rond de pedikel. Onderzoekers hebben deze in vivo configuratie gebruikt om driedimensionale functionele gevasculariseerde weefselconstructen met ondersteunende vasculatuur en klinisch relevante afmetingen produceren. ^4,23 Voorts gevasculariseerde de gemanipuleerde weefselconstructen met intacte vaatsteel kunnen worden geoogst voor latere transplantatie in de beschadigde plaats . ^24,25 Een klinisch haalbaar scenario zou zijn het creëren van de kamer bij de definitieve locatie voor de wederopbouw such de borst. Aldus zou het de novo tissue engineering aanpak klinische potentie om een nieuwe bron van functionele doelweefsel voor reconstructieve chirurgie hebben. ^26-28

Het volgende protocol wordt een algemene handleiding een in vivo gevasculariseerde weefselmanipulatie kamer construct in de rat, die kunnen worden aangepast in verschillende diermodellen en toegepast om de complexe processen van angiogenese, matrixproductie, en cellulaire migratie en differentiatie te onderzoeken.

Protocol

De hier beschreven protocollen zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van St. Vincent's Hospital in Melbourne, Australië, en werden uitgevoerd onder strikte naleving van de Australian richtsnoeren van de Raad National Health en Medical Research.

OPMERKING: tweekamer protocollen worden hieronder beschreven. De twee verschillende modellen en hun specifieke kamer ontwerpen zijn aangegeven in figuur 1. Kamer (1) is gemaakt van polycarbonaat (voor rat arterioveneuze lus kamermodel). Het is cilindrisch met een inwendige diameter van 13 mm en 4 mm. Een venster op een punt in de muur maakt onbelemmerde toegang voor de pedikel. In het tweede model (voor de rat doorstroming pedikel kamer model), wordt de kamer gemaakt van polyacryl en is rechthoekig (10 x 8 x 4 mm ³ inwendige afmetingen). Het heeft twee openingen 1,5 mm aan weerszijden aan de femorale slagader en ader geschikt aangezien zij de kamer overtreden.

1. Rat Arterioveneuze Loop Chamber Model (One Chamber per dier)

NB: Voorafgaand aan het starten van de operatie, zorg ervoor dat alle instrumenten naar behoren zijn gesteriliseerd. Ook zorgen voor de instrumenten rust op steriele handdoeken en op een redelijke afstand van het chirurgische veld om besmetting tijdens de procedure te voorkomen.

1. Voorbereiding van de Animal voor Heelkunde
   1. Gebruik ratten met een gewicht van ten minste 250 gram voor hun grote omvang van de schepen voor de oprichting van de arterioveneuze lus.
   2. Verdoven het dier met 4% isofluraan inhalatie. Bevestigen voldoende diepte van de anesthesie door het beoordelen van ongevoeligheid tot teen-snuifje. Na verdoving, houdt het dier voldoende verdoofd gedurende de procedure met 2% isofluraan.
   3. Plaats het dier in liggende positie op een verwarmingskussen en steriel smeermiddel op de ogen om uitdroging te voorkomen tijdens de operatie.
   4. Met behulp van een elektrisch scheerapparaat, scheren beide liezen en verwijder haar met een stuk vochtig gaas.
   5. Prep de chirurgische sites met chloorhexidine/ 70% ethanoloplossing en draperen het dier met steriele handdoeken. Dien één dosis Carprofen (5 mg / kg, subcutaan) als analgeticum.
2. Harvest of lies Graft
   1. Met behulp van een # 15 blad, maak een 4 cm lange incisie aan de linker lies parallel aan het inguinale ligament. Dit onthult de lies vet pad.
   2. Snijd door de vet pad langs de omtrek met een schaar maar laat ze op haar vaatsteel op basis van de epigastrische vaten.
   3. Met behulp van micro-schaar, vrij de wazige bindweefsel verklevingen tussen de buikwand en de onderliggende femorale schepen.
   4. Plaats een oprolmechanisme aan de buikwand en trek mediaal. Dit onthult de inguinale ligament en de gehele lengte van de femorale vaten.
   5. Met behulp van micro tang en gebogen schaar ontleden de epigastrische ader en te isoleren uit de omliggende vet door het zachtjes te trekken en snijden. Deze geest werkt als een tuier de geconstrueerde lus.
   6. usinG Micro pincet en gebogen micro schaar open de perivasculaire omhulsel met daarin de femorale schepen en zenuwen helemaal uit de lies ligament om zijn bifurcatie distaal van de epigastrische tak.
   7. Met behulp van micro-tang, pak de lies door zijn adventitia en voorzichtig scheiden van de omliggende weefsels en bijbehorende slagader. Doe dit met micro pincet en gebogen ronde wees micro schaar door het weefsel uit elkaar te trekken en te snijden doorheen.
      OPMERKING: grijp nooit de gehele dikte van de aderwand als dit trauma zou kunnen veroorzaken aan de intima waardoor het gevoelig voor trombose.
   8. Ligeer zijtakken gevonden tijdens de dissectie met 10/0 nylon hechtdraad of stollen ze met een bipolaire coagulator.
   9. De femorale ader volledig vrij, ligeren zijn proximale en distale uiteinden met 4/0 zijden hechtdraden. Zorg ervoor dat een veneuze graft lengte ten minste 10 mm te verkrijgen en omvatten ongeveer 0,5 cm lengte van de epigastrische tak te gebruiken als scheerlijn kettingom de lus geopend in de kamer te houden.
   10. Met behulp van micro tang en rechte micro schaar, knip de adventitia van de uiteinden van het transplantaat door zachtjes te trekken en snijden. Dit kan ook later worden gedaan, voordat microchirurgische anastomosen.
   11. Spoel de ader graft met gehepariniseerde zoutoplossing (10 U / ml heparine) en laat het rusten in de oplossing. Sluit de wond met behulp van continu draaiende 4/0 zijden hechtdraad plus twee of drie extra eenvoudige onderbroken steken.
3. Creatie van Arterioveneuze Loop en Implantatie van Chamber
   1. Herhaal de stappen 1.2.1 tot en met 1.2.4 in de exact dezelfde manier op het contralaterale ledemaat.
   2. Met behulp van micro-tang, ontleden en te isoleren zowel de epigastrische slagader en ader van de omliggende vet pad te vormen. Doe dit door zachtjes te trekken van het weefsel uit de buurt van de vaten
   3. Met behulp van micro-tang, pak de dij slagader door zijn adventitia en vrij uit de omliggende weefsels. Doe dit met micro pincet en gebogen round-puntige micro schaar door het weefsel elkaar te trekken en snijden doorheen. Afbinden of coaguleren haar zijtakken.
   4. Afbinden de femorale slagader en ader distale tot de opkomst van de epigastrische vaartuigen die 4/0 zijden hechtdraad.
   5. Plaats één klem proximaal op elk van de femorale slagader en ader. Met behulp van een scherpe rechte micro schaar, maken een schone dwarsrichting in elk vat distale gesneden om de opkomst van de epigastrische takken. Plaats een steriele plastic contrast achtergrond onder de schepen.
   6. Spoel de schepen hevig met royale hoeveelheden gehepariniseerde zoutoplossing totdat al het bloed uit het lumen wordt verwijderd.
   7. Breng de ader graft in het operatiegebied en verwijder alle overbodige adventitia van de uiteinden van de schepen ', zoals per stap 1.2.10, indien nodig.
   8. Voer beide microchirurgische anastomosen met 10/0 nylon hechtdraad. Anastomose het proximale uiteinde van de bypass aan de femorale ader en het distale uiteinde op de femorale slagader. Hierdoor kan het bloed te laten stromen fROM De arteriële de veneuze kant zonder verzet van de kleppen in de ader graft.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de femorale schepen en de ader graft rust in hun natuurlijke houding, zonder enige wendingen.
   9. Controleer op lekkage bij beide anastomotische sites. Resolve kleine lekken, die er uitzien als niet-pulserende bloed uit de anastomose site, door het plaatsen van een klein stukje vet op de top en voorzichtig te comprimeren voor 5-10 min. Grotere pulserende lekken die het hele veld snel overspoelen zal extra hechtingen nodig.
   10. Controleer doorgankelijkheid van de arterioveneuze lus. Gentle occlusie van de femorale slagader moet het krimpen terwijl hetzelfde in de femorale ader dient snel te vullen.
   11. Bevestig de onderkant van de tissue engineering kamer onder arterioveneuze lus met laatstgenoemde rust in zijn natuurlijke positie zonder draaien of knikken.
   12. Bevestig de basis van de kamer naar de lies ligament en de onderliggende spier fascia met 6/0 nylon hechtingen.
   13. Plaats het deksel over debasis, zodat de femorale vaten voer de kamer door een inkeping (venster in de zijde van de kamer). Bij het sluiten van de klep, zorg ervoor dat het vangt de epigastrische takken, tussen de kamer basis en deksel, die fungeren als aanbinden om de arterioveneuze lus te houden in de juiste positie.
   14. Sluit de wond met behulp van continu draaiende 4/0 zijden hechtdraad plus twee of drie extra eenvoudige onderbroken steken.
   15. Laat het dier om te herstellen van narcose op een warming pad.
   16. Laat de dieren niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven. Ook niet een dier dat een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld terugkeren. 24 uur later, bestuurt een enkelvoudige dosis Carprofen (5 mg / kg, subcutaan) als analgeticum.
   17. Behandel de wond met actuele antibiotische zalf voor 5 dagen. Als de wond wordt geopend, verdoven van het dier in stap 1.1.2 tot 1.1.5 en sluit de wond in 1,30,14. Controleer de gezondheid van dieren dagelijks. Inslapen het dier met een dodelijke dosis lethabarb intraperitoneale injectie (163 mg / kg in 0,25 ml van 23 G naald) indien het dier toont meerdere matige tekenen van inacitivity, slechte eetlust, gewichtsverlies en kleurverlies.

2. Flow-through Pedicle Chamber (twee kamers per dier)

1. Voorbereiding van de Animal voor Heelkunde
   1. Herhaal de stappen 1.1.1 tot 1.1.4. Twee kamers kunnen worden geïmplanteerd in beide lies gebieden van een rat.
2. Isolatie van Femorale schepen en het inbrengen van de Kamer
   1. Herhaal de stappen 1.2.1 tot 1.2.8.
   2. Met zowel slagader en ader volledig bevrijd van de omliggende weefsels en hun filialen afgebonden, brengen de kamer in het operatiegebied.
   3. Plaats elk van de intacte femorale schepen op de overeenkomstige gleuf van de kamer basis om ervoor te zorgen dat er geen wendingen of knikken.
   4. Sluit de kamer door attaching het deksel op de basis. Sluiting van de wond met een continue draaiende 4/0 zijden hechtdraad plus twee à drie eenvoudige onderbroken hechtingen en dat de dieren herstellen zoals eerder beschreven.

3. Oogst van Chambers en Tissue Processing

1. Zodra het experiment tijdstippen (4-6 weken na implantatie) worden bereikt, verdoven het dier als in stap 1.1.2 en herhaal stappen 1.1.3 tot 1.1.5.
2. Open de wond met een # 15 blad en doorsnijden van de weefsels met een schaar tot de kamer geheel is blootgesteld.
3. Expose de femorale vaten proximale naar het construct en test voor vasculaire doorgankelijkheid: voorzichtig af te sluiten van het schip met twee microforceps, dan is melk het bloed in een distale richting en tenslotte de proximale tang los. Als het vat vult met bloed opnieuw, dit bevestigt doorgankelijkheid. Ligeren de femorale vaten proximaal bij de arterioveneuze lus en zowel proximaal als distaal bij The doorstroom configuratie, en verwijder de kamers met die weefsel en bloc.
4. Na afloop van het experiment inslapen het dier met een dodelijke dosis lethobarb intraperitoneale injectie (163 mg / kg in 0,25 ml van 23 G naald).
5. Fix weefsels in 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 24 uur. Verdeel weefsels in meerdere dwarsprofielen (1-2 mm dik) en insluiten in paraffine of optimale snij-temperatuur compound voor paraffine secties (5 pm) of bevroren secties (10 pm), respectievelijk. ^{3,4,8,17,22, 24}
6. Routinematige histologische kleuring zoals hematoxyline en eosine de algemene morfologie van weefsel te onderzoeken. Voer immunohistochemische kleuring met een specifiek antilichaam tegen celtype van belang, ^{3,4,8,17,22,24,29} identificeren bijvoorbeeld troponine T immunokleuring voor hartspiercellen.

Resultaten

De microchirurgische creatie van tissue engineering kamers werd uitgevoerd zoals beschreven in het protocol hierboven. Weefsels gegenereerd in de kamers kunnen histologisch worden onderzocht beschrijven protocol stap 3. De diverse weefseltypen zijn met succes geconstrueerd met behulp van de in vivo gevasculariseerde kamer (figuur 2). Deze omvatten hartweefsel neonatale cardiomyocyten van de rat (Figuur 2A), spierweefsel rat skeletmyoblasten

Discussie

Engineering van de microcirculatie wordt momenteel hoofdzakelijk wordt onderzocht door middel van twee benaderingen. De eerste omvat de ontwikkeling van een sterk onderling verbonden vasculaire netwerk binnen het construct in vitro zodat wanneer geïmplanteerd, capillairen van de gastheer vaatbed verbinden met die van de getransplanteerde construeren door een proces genaamd inoculatie, waardoor de levering van voedingsstoffen niet alleen de omtrek maar ook de kern. ^21,32,33 Dit wordt pre-vascularisati...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 15 Blade Scalpel	Braun	BB515
1 Toothed Adson Forceps	Braun	BD527R
1 Needle Holder	Braun	BM201R
1 Bipolar Coagulator	Braun	US335
1 Micro Needle Holder B-15-8.3	S & T	00763
1 Micro Dilator Forceps D-5a.2	S & T	00125
1 Micro Jeweler's Forceps JF-5	S & T	00108
1 Micro Scissors - Straight SAS-11	S & T	00098
1 Micro Scissors - Curved SDC-11	S & T	00090
2 Single Clamps B-3	S & T	00400
2 10/0 nylon suture	S & T	03199
1 6/0 nylon suture	Braun	G2095469
2 4/0 Silk Sutures	Braun	C0760145
Xilocaine 1%	Dealmed	150733	10 mg/ml
Heparin Sodium	Dealmed	272301	5.000 UI/ml
Ringer Lactate	Baxter	JB2323	500 ml
1 dome-shaped tissue engineering chamber	custom made
1 flow-through chamber	custom made
Lectin I, Griffonia Simplicifolia	Vector Laboratories	B-1105	1.67 μg/ml
Troponin T antibody	Abcam	Ab8295	4 μg/ml
Human-specific Ku80 antibody	Abcam	Ab80592	0.06 μg/ml
Desmin antibody	Dako	M0760	2.55 μg/ml
Cell Tracker CM-DiI dye	Thermo Fisher Scientific	C-7000	3 mg/106 cells
Lethabarb (sodium pentobarbitone)	Virbac Animal Health	LETHA450	325 mg/ml
Heat pad flexible	Redzone Heating	RZ/Medium