In dit manuscript worden periodaatoxidatie- en glutaraldehyde-crosslinking-methoden voor covalente immobilisatie van antilichamen op papierschijven gepresenteerd. De bindingsactiviteit van geïmmobiliseerde antilichamen werd geëvalueerd. Op basis van deze resultaten werd een glutaraldehyde-crosslinking-methode gebruikt om een nieuwe papiergebaseerde immunoassay voor immunoglobuline G (IgG) detectie te ontwikkelen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Covalente binding van antilichamen aan Cellulose Paper Discs en hun toepassingen in het blote oog Colorimetrisch Immuniteitsonderzoeken
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dit rapport bevat twee methoden voor de covalente immobilisatie van capture antilichamen op cellulose filterpapier graad No. 1 (gemiddeld-flow filter papier) discs en rang No. 113 (fast-flow filter papier) discs. Deze cellulose papierschijven werden geënt met functionele aminegroepen door een silaankoppelingsmiddel techniek voor de antilichamen geïmmobiliseerd daarop. Perjodaat oxidatie en glutaaraldehyde verknopende werkwijzen werden gebruikt om invangantilichamen enten op de cellulose papierschijven. Om de maximale bindingscapaciteit van de invangantilichamen hun doelen na immobilisatie te waarborgen, werden de effecten van verschillende concentraties van natriumperjodaat, glutaaraldehyde en invangantilichamen op het oppervlak van de papierschijven onderzocht. De antilichamen die aan de amine-gefunctionaliseerde cellulose papierschijven werden bekleed door een glutaaraldehyde verknopingsmiddel vertoonden verbeterde bindingsactiviteit naar het doel ten opzichte van het perjodaat oxidatiewerkwijze. IgG (in muizen referentieserum) werd gebruikt als een meetobject in deze studie de toepassing covalent geïmmobiliseerde antilichamen getest met glutaaraldehyde. Een nieuwe papieren, enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) werd met succes ontwikkeld en gevalideerd voor de bepaling van IgG. Deze methode vereist geen apparatuur vereist en kan 100 ng / ml IgG te detecteren. De fast-flow filter papier was gevoeliger dan het filterpapier medium-flow. De incubatietijd van deze assay was kort en vereist kleine monstervolumes. Dit blote oog, kan colorimetrische immunoassay worden uitgebreid naar andere doelen die worden geïdentificeerd met conventionele ELISA gedetecteerd.
Inleiding
De point-of-care testen (POCT) diagnostisch onderzoek is belangrijk voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën voor therapeutische, gepersonaliseerde geneeskunde, en thuiszorg 1. Cellulose papier worden veel gebruikt als platforms immunoassays, omdat ze goedkoop toegankelijk, en waarvan de consument 2. Bovendien, de poreuze structuur van cellulose papier bezit het vermogen om vloeistofstroom rijden zonder extra energie impact. Registraties van papieren bioanalyse kan al in de 20 e eeuw, wanneer het papier chromatografie eerst werd uitgevonden in 1952. Het meest voorkomende voorbeeld is immunochromatographic testen 3, zoals....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Enten Amine functionele groepen op Cellulose papier Discs
- Bereid een vierkant stuk papier met een afmeting van 1 cm x 1 cm en 100 papierschijven gemaakt van rang No. 1 cellulose papier met een diameter van 6,0 mm (filtreerpapier gemiddeld-stroom) met een perforator.
- Om -NH2 groepen af te leiden op het papier schijven, meng 1 ml APS en 10 ml aceton in een 50 ml glazen fles in de zuurkast. Voeg papierschijven aan de vers bereide APS mengsel van reagentia, en incubeer gedurende 5 uur met orbitaal roeren (200 opm) bij kamertemperatuur 32.
Let op: Behandel APS en aceton in de zuurkast. - Giet overtollige oplossi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 3. Fourier transformatie infrarood (FTIR) spectra van onbehandelde en behandelde APS-medium stroomfilter vierkant papier (A) en fast-flow filter vierkant papier (B). A. De spectra voor onbehandelde medium stroomfilter vierkant papier was vergelijkbaar met dat van APS behandelde medium stroomfilter vierkant papier. De toename van de intensiteiten op banden van .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Directe coating van affiniteit gezuiverd geit-anti-muis IgG-Fc capture antilichaam op niet-gemodificeerde cellulose papierschijven werd uitgevoerd IgG concentraties te detecteren. De resultaten gaven aan dat verdere fixatie van de invangantilichamen vereist voor reproduceerbaarheid. Het silaan techniek werd met succes gebruikt voor aminefunctionele groepen te introduceren aan de cellulose papierschijven 34. De concentratie van APS beïnvloedt de immobilisatie van antilichamen. Derhalve werd de hoeveelheid APS .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd financieel ondersteund door het Ministerie van Onderwijs, Singapore, via de Translational and Innovation Grant (MOE2012-TIF-2-G-009).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Cellulose filter paper, Grade 1 (medium flow filter paper) | GE Healthcare Pte Ltd Singapore | 1001 110 | |
| Cellulose filter paper, Grade 113 (Fast flow filter paper) | Sigma-Aldrich, Singapore | 1113-320 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Singapore | G6257 | Grade II, 25% in H2O |
| Surfactant | Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore | P2287 | |
| Bovine serum album | Sigma-Aldrich, Singapore | A2153 | |
| Skimmed milk powder | Louis François | Verpakt door Kitchen Capers, Singapore | |
| Tris base | Promega | H5135 | |
| Sodium periodate | Merck | 106597 | |
| Na2HPO4 | Merck | 106585 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| NaCl | CALBIOCHEM | 567441 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| HCl | Merck | 100317 | |
| phosphate buffer saline (PBS) | N/A | N/A | PBS, bevattend 137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.0 mmol/L Na2HPO4 en 1.5 mmol/L KH2PO4, wordt bereid met water en aangepast tot pH 7.4 met 0.1 mol/L NaOH of 0.1 mol/L HCl |
| Acetone | Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore | 9005-68 | |
| Mengsel van TMB en waterstofperoxide oplossing | 1-Step ultra TMB-ELISA oplossing, Thermo Scientific Pierce | 34029 | 1 L |
| Konijn anti-menselijk IgG-FITC | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2278 | |
| Peroxidase geconjugeerd geit anti-konijn IgG | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2030 | |
| Affiniteit gezuiverde geit anti-Muis IgG-Fc coating antilichaam | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131A | |
| Muis referentie serum | Bethyl Laboratories, Inc | RS10-101-5 | 9.5 mg/ml |
| HRP geconjugeerd geit anti-muis IgG-Fc detectie antilichaam | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131P | |
| Apparatuur | |||
| Fourier transform infrarood spectrofotometer | Shimadzu IR Prestige-21 | N/A | |
| Fluorescentie moleculaire imager | Pharos FXTM plus moleculaire imager, Bio-Rad, Singapore | N/A | |
| Oven | NUVE FN500 | N/A | |
| Turbo mixer VM-2000 | MYC LTD | N/A | |
| ImageJ | RGB, gratis download | N/A |
Referenties
- Curtis, K. A., Rudolph, D. L., Owen, S. M. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). J. Virol. Methods. 151 (2), 264-270 (2008).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
