Oprichting van een High-throughput Setup voor het screenen van kleine moleculen die Moduleer c-di-GMP Signalering in Pseudomonas aeruginosa

Summary

Dit artikel beschrijft de high-throughput assay die met succes heeft bewezen grote bibliotheken van kleine moleculen te screenen op hun potentiële vermogen om cellulaire niveaus van cyclisch di-GMP manipuleren Pseudomonas aeruginosa, die een nieuw krachtig hulpmiddel voor antibacteriële geneesmiddelen en beproeving in.

Abstract

Bacteriële resistentie tegen traditionele antibiotica heeft onderzoek pogingen om nieuwe drug targets te identificeren in recent ontdekte regelgeving trajecten gereden. Regulerende systemen die intracellulaire cyclisch di-GMP (c-di-GMP) te gebruiken als een tweede boodschapper zijn een dergelijke klasse van het doel. c-di-GMP is een signaalmolecuul gevonden in bijna alle bacteriën die werkt aan een uitgebreid scala van processen te reguleren, waaronder resistentie tegen antibiotica, de vorming van biofilm en virulentie. Begrijpen hoe c-di-GMP signalering controles aspecten van antibiotica resistente biofilm ontwikkeling benaderingen voorgesteld waarbij verandering van de cellulaire concentraties van de nucleotide of verstoring van deze signaalroutes kunnen een verminderde biofilmvorming of verhoogde gevoeligheid van de biofilms antibiotica. We beschrijven een eenvoudige high-throughput bioreporter protocol op basis van groen fluorescerend eiwit (GFP), waarvan de expressie onder de controle van de c-di-GMP reagerende promotor CDRA, Snel screenen op kleine moleculen met het vermogen om c-di-GMP cellulair niveau in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) moduleren. Dit eenvoudige protocol kan ruim 3500 verbindingen screenen binnen 48 uur en het vermogen aan te passen aan verschillende micro- organismen.

Introduction

De snelle ontwikkeling van bacteriële resistentie tegen klinisch belangrijke antibiotica is een van de grootste problemen op dit moment geconfronteerd gezondheidswerkers wereldwijd. Dit falen van de traditionele antibiotica heeft nieuwe zoekopdrachten gereden voor de chemische stof die kunnen interfereren met bacteriële processen die betrokken zijn bij virulentie en progressie van de ziekte ^1. Eén zo'n regelgevend systeem dat gebruik maakt van de intracellulaire tweede boodschapper cyclisch di-GMP (c-di-GMP) heeft onlangs een doel met veelbelovende geldigheid ^2-4 is geworden. Vastgesteld is dat deze wereldwijde tweede messenger signaalmolecuul reguleert vele functies, waaronder antibiotica-resistentie, adhesie, biofilmvorming en de ziekte van ^2-4.

Het is nu duidelijk dat het cellulaire niveau van c-di-GMP in de bacteriële cel wordt gecontroleerd door synthese en degradatie waarbij twee moleculen GTP gebruikt om c-di-GMP synthetiseren door GGDEF-domein bevattende diguanylate cyclases (DGCs) whereas c-di-GMP afbraak wordt gekatalyseerd door fosfodiesterasen (PDE), die ofwel een EAL of een HD-GYP domein (beoordeeld in (3, 5)). Eiwitten die deze domeinen bevatten vaak andere signalerende domeinen, suggereert dat de activiteit omzet c-di-GMP direct of indirect wordt geregeld door signalen milieu- of cellulaire ^3,5. Bijgevolg c-di-GMP signaleringsfuncties voor de detectie van diverse omgevingsfactoren koppelen aan wijzigingen in bacteriële fenotype. c-di-GMP oefent zijn regulerend effect op bacteriën op het niveau van transcriptie, post-transcriptie en post- translatie door verschillende mechanismen ^4.

Een grote invloed van c-di-GMP in veel bacteriecellen in de bepaling van bacteriële lifestyle en vooral bij de bestrijding van overgangen tussen beweeglijke plankton cellen sessiele cellen gehecht aan oppervlakken of georganiseerd in de meercellige structuur van biofilms ^3,5. In het algemeen, hoge cellulaireniveaus van c-di-GMP geassocieerd met de vorming en sessility biofilm, terwijl lage niveaus cellulaire motiliteit bevorderen en virulentie factor synthese in veel bacteriële pathogenen ^3,5. Zo zou een meer gedetailleerde kennis van de werking van c-di-GMP signalering strategieën veroorloven voor de remming van de vorming van biofilm en de virulentie in bacteriële ziekteverwekkers. Dit is een moeilijke taak gezien het feit dat de meeste bacteriële genomen coderen talrijke eiwitten met GGDEF, EAL en / of HD-GYP domeinen (bijvoorbeeld P. aeruginosa heeft meer dan 40 eiwitten) en meerdere effectoren ^6,7.

Echter, zelfs met deze complexiteit, suggereert recent bewijs dat strategieën manipuleren c-di-GMP signalering kan worden ontwikkeld om zowel voorkomen antibiotische resistente infecties ontwikkelen of ze vatbaar voor het immuunsysteem of een efficiënte verwerking door gelijktijdige toediening van klassieke antibiotica ^2. In lijn met deze, is experimenteel aangetoond dat kunstmatige dalingvan intracellulaire c-di-GMP in in vitro -grown P. aeruginosa leidt tot verminderde biofilmvorming en verhoogde gevoeligheid voor antimicrobiële stoffen, terwijl P. -developed aeruginosa biofilms op siliconenimplantaten in de peritoneale holte van muizen, kan worden gedispergeerd op een soortgelijke wijze ^8-11.

Hier beschrijven we een high-throughput, fluorescentie gebaseerde reportertest kleine moleculen die overwogen cellulaire c-di-GMP niveaus moduleren P. screenen aeruginosa (Figuur 1). De test is gebaseerd op het meten van c-di-GMP cellulair niveau door een eerder ontwikkeld GFP reporter, waarvan de expressie wordt transcriptioneel gekoppeld aan de c-di-GMP-responsieve promotor Cdra ^12. Dit protocol beschrijft de methode voor expressie van het construct in de P. aeruginosa stam plaats, samengestelde plaat bereiding, cultuur enting in 384 putjes, groeiomstandigheden, zoals well als details met betrekking tot het verzamelen, beheren en analyseren (figuur 1). In het algemeen zal dit protocol onderzoekers helpen om potentieel te identificeren nieuwe verbindingen gericht c-di-GMP signalisatie in bacterie, en voor gebruik in het onderzoek gericht op het begrijpen van de biologie van P. aeruginosa.

Protocol

Opmerking: Procedure voor het kloneren en transformatie van het gezuiverde C-di-GMP reporterplasmide ¹² worden elders besproken.

1. Generatie van GFP Tagged c-di-GMP Reporter P. aeruginosa Strain

1. Inoculeer 5 ml lysogenie bouillon (LB) medium met een enkelvoudige kolonie van P. aeruginosa en incubeer overnacht bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm.
2. Overdracht 2 ml van de overnacht kweek in 200 ml vers LB-medium in een 1 L kolf en incubeer bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm.
3. Monitor optische dichtheid bij 600 nm (OD ₆₀₀₎ elke 30 minuten door een 1 ml monster uit de kolf en gaan met een spectrofotometer (zoals eerder beschreven ^12).
4. Wanneer de _OD600 0,3 bereikt - 0,5, plaats 40 ml van de kweek in een 50 ml conische centrifugebuis.
5. Pellet de cellen door centrifugeren bij 8000 rpm gedurende 10 min bij 4 ° C, verwijder het supernatant en re-schorten de cellen in 40 ml van ijskoude steriele, 300 mM sucrose oplossing.
6. Pellet de cellen een tweede maal door centrifugeren zoals beschreven in stap 1.5 en resuspendeer in 20 ml van ijskoude steriele, 300 mM sucrose oplossing.
7. Pellet de cellen een laatste keer door centrifugeren zoals beschreven in stap 1.5 en resuspendeer in 400 ul ijskoud, steriel, 300 mM sucrose oplossing.
   Opmerking: De celdichtheid op dit punt moet ongeveer 1 x 10 ¹¹ kolonievormende eenheden per milliliter (CFU / ml).
8. Koel de cellen op ijs gedurende 30 minuten, waarna ze klaar voor elektroporatie.
9. Voeg 1 pl van een 0,2 ug / ul pCdrA :: GFP plasmide ^{12 C} oplossing van 40 ui P. aeruginosa elektro-competente cellen boven bereid in een 1,5 ml microcentrifuge buis die vooraf gekoeld op ijs is. Meng de suspensie en over in een voorgekoeld, 2 mm elektrodenafstand, elektroporatie cuvet.
   Opmerking: pCdrA :: GFP ^C: pUCP22Not-P _Cdra -RBSII- GFP (Mut3) -T ₀ -T _1, Amp ^r GM ^r, die een fluorescerende uitlezing van het intracellulaire niveau van c-di-GMP in P. geeft aeruginosa stammen, werd ontwikkeld en gevalideerd door Rybtke et al. ^12.
10. Verwijderen van vocht aan de buitenkant van de cuvette met tissuepapier en plaats de cuvet in de monsterkamer van de elektroporator. Puls met een spanning van 2,5 kV, capaciteit van 25 uF en weerstand van 200 Ω.
11. Verwijder de cuvette en voeg 1 ml van LB medium. Vervolgens overbrengen van de cellen naar een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm.
12. Verspreid 10 ul, 50 ul en 100 ul aliquots van de kweek op steriele LB-agarplaten gesupplementeerd met ampicilline (bij een concentratie van 100 ug / ml) en incubeer de platen bij 37 ° C overnacht.
13. Bevestig het GFP-expressie (excitatiop 485 nm, emissie bij 520 nm) door het onderzoeken van de plaat onder een fluorescentiemicroscoop met een standaard GFP-kanaal en kies een enkele kolonie voor het enten van 5 ml LB. Incubeer overnacht zoals beschreven in stap 1.1. Meng 0,5 ml van de overnacht kweek met 0,5 ml 50% glycerol in een 2 ml met schroefdop gelast en bewaard bij -80 ° C.

2. Voorbereiding van de Starter Cultuur voor Enten

1. Twee dagen voordat het scherm, de plaat P. aeruginosa stam (dat de pCdrA :: GFP plasmide ^C) vanaf de -80 ° C moederplant een LB-agarplaat (aangevuld met ampicilline bij een concentratie van 100 ug / ml) door voorzichtig verspreiden de bacteriën op de plaat met een steriele inoculatie lus. Incubeer de plaat overnacht bij 37 ° C.
2. De avond voor de screening, het enten van een enkele kolonie van P. aeruginosa van de plaat in 10 ml LB-medium (aangevuld met ampicilline bij een concentratie van 100 ug / ml) in een tuen incubeer de voorkweek nacht bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm.
3. Op de dag van het scherm, stelt een subcultuur van de nacht voorkweek door eerst te verdunnen met vers LB-medium tot een OD ₆₀₀ van 1,0 en verdunning met 5% LB tot een OD ₆₀₀ van 0,04 (01:25 verhouding) .
   Opmerking: Het totaalvolume van het geënte medium afhankelijk van het aantal platen te testen. 5% LB gemaakt door verdunning 100% LB met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot de gewenste concentratie. Belangrijk is dat de media (5% LB) maakt constitutieve activering van pCdrA :: GFP ^C in P. aeruginosa.
4. Voeg een steriele magnetische roerstaaf in de houder en roer de kweek in minimale snelheid op een magnetische roerder gedurende 30 min bij kamertemperatuur, waardoor de bacteriën te acclimatiseren aan de media voordat ze worden gedispergeerd in 384 putjes.

3. Inoculatie en incubatie van de 384-well platen bevattendekleine Molecules

Opmerking: steriliteit en een goede aseptische technieken zijn van cruciaal belang voor de volgende stappen.

1. De positieve controle (100% remming) te bereiden, voeg 20 ul tobramycine sulfaat (25 mg / ml) tot 10 ml (voldoende voor maximaal 12 platen) van de subcultuur bereid in Stap 2,3 en meng voorzichtig. Pipetteer 40 ul van de positieve controlecultuur in putten A23 - P23 (figuur 2).
2. Met de negatieve controle (0% remming) te bereiden, voeg 30 pl dimethylsulfoxide (DMSO) tot 10 ml (voldoende voor maximaal 12 platen) van de subcultuur bereid in Stap 2,3 en meng voorzichtig. Pipetteer 40 ul van de negatieve controlecultuur in putten A24 - P24 (figuur 2).
3. Voor elk van de platen voorzien van de kleine moleculen, enten een volume van 40 ui van het verdunde overnachtcultures (in stap 2.3) in de putjes A1 - P22 (figuur 2).
   Opmerking: Dit kan worden bereikt door een vloeistofmanipulator robot. Door de heterogene eigenschappen van bacteriële culturen, is het belangrijk om een ​​continue en matig roeren bacteriën consequent verdeeld in de media, terwijl afgifte behouden blijven. Om dit te doen, blijf roeren de geacclimatiseerd cultuur uit stap 2.4 magnetisch tijdens het afgeven.
4. Dicht de platen met een luchtdoorlatend de afdichting en incubeer gedurende 6 uur bij 37 ° C.
   Opmerking: De luchtdoorlatende zegel is van cruciaal belang voor onveranderlijk voorwaarden in alle 384 waterputten te handhaven en de mogelijke ontwikkeling van zuurstof gradiënten te omzeilen over de plaat.

4. Meting van groei (OD ₆₀₀₎ en intracellulaire c-di-GMP niveau (GFP)

1. Ongeveer 30 minuten voor spectrofotometrische meting vooraf verwarmen de plaat lezer 37 ° C om condensatie te voorkomen.
2. Verwijder voorzichtig de luchtdoorlatende afdekplaatafdichting voor het lezen. Meet de optische dichtheid bij een golflengte van 600 nm met een instelling van 10 flitsen per putje eneen afwikkeling van de tijd van 0,2 sec.
3. Voorafgaand aan het meten van fluorescentie, maakt een automatische gain en focale correctie gebaseerd op goed A24 (negatieve controle) en stel de gain streefwaarde bij 75% (figuur 2).
   1. Van de plaat lezer control software, klikt u op start de meting en klik op de '' Focus en Gain Adjustment / Plate ID's 'tab'.
   2. Selecteer '' Focus Adjustment '' en '' Kanaal A '' aan de rechterkant op het raam.
   3. Selecteer '' Gain Adjustment '' en '' goed gekozen '', en typ in '' 75 '' als de '' Target waarde ''. Tot slot, kies goed A24 in de plaat lay-out alvorens te klikken op '' Start Adjustment ''. Zodra de aanpassing wordt uitgevoerd, klikt u op '' Start meting ''.
   4. Meet de fluorescentie van de GFP reporter bij een excitatie / emissie maxima van 485/520 nm met een instelling van 10 flitsen per put en een settling tijd van 0,2 sec.
4. Verzamel gegevens van alle platen onderzocht. Opmerking: Gegevens metingen worden automatisch opgeslagen als standaard door de plaat lezer besturingssoftware.
   1. Bekijk lezingen door te klikken op het pictogram "Mars" binnen de besturingssoftware voor de statistische analyse pakket te openen.
   2. Ophalen van gegevens door "dubbelklikken" op de nummerplaat van belang zijn voor toegang tot de gegevens voor de analyse.

5. Data Analysis

1. Evalueer de uniformiteit en reproduceerbaarheid van de test met gebruik robuuste z 'analyse, dat is de meest voorkomende metrics vermeld voor high-throughput screens. Bereken robuuste z 'met de formule:
   
   Wanneer MAD (mediaan absolute afwijking) is een schatting van de standaarddeviatie p de positieve controle (100% remming) en n is de negatieve controle (0% remming) voor zowel OD ₆₀₀ en GFP vaarden. Opmerking: Een test met een robuuste z "waarde (berekend voor zowel OD ₆₀₀ en GFP ruwe gegevens) groter dan of gelijk aan 0,5 wordt beschouwd als een uitstekende test.
2. Bereken% remming van groei volgens de formule:
   
   Waar Xi _OD600 is de geïtereerde OD ₆₀₀ waarde van elk monster ook. % Remming _OD600> 0, groeiremmer; % Remming _OD600 <0, groeibevorderende.
3. Beoordeel de% remming van het intracellulaire niveau van c-di-GMP met de formule (de verandering in fluorescentie-intensiteit arbitraire eenheden worden gecorrigeerd voor de wijziging in celdichtheid):
   
   Waar Xi _GFP is de geïtereerde GFP waarde van elk monster ook. % Remming _GFP> 0, c-di-GMP inhibitor; % &# 160; Remming _GFP <0, c-di-GMP promoter.
4. Stel een drempelwaarde voor een hit detectie bij 3 MAD van de mediaan (mediaan ± 3 MAD), berekend uit de steekproef belezen-outs van elke plaat, uitgaande van een normale verdeling van de data-punten. Opmerking: echter, kan een ± 50% remming cut-off geselecteerd als meer reproduceerbare en accurate dosering respons assays indien nodig.

Results

De hier beschreven benadering kan één onderzoeker gemiddeld 3500 verbindingen efficiënt en succesvol screenen binnen 48 uur. Een overzicht van de high-throughput screening protocol wordt geïllustreerd als een stroomschema in Figuur 1. Voor de huidige artikel hebben we onderzocht regel-of-five compliant verbindingsbibliotheek potentiële c-di-GMP modulerende verbindingen bij een eindconcentratie van 600 uM . Echter, er zijn vele in de handel verkrijgbaar geneesmiddel-achtige en niet-drug achtige verbinding stellen die kunnen worden gebruikt in de test. Deze sets kunnen be-bacteriën gericht verbindingen of willekeurig samengevoegde verbindingen, maar elke bibliotheek zou fysisch-chemische eigenschappen en kenmerken zoals toegewezen als de set hier gescreend, die polaire functionele groepen en meerdere stereogene centra hebben gehad gegrond. In dit protocol worden bacteriën geënt in de plaat met verbindingen, een antibioticum positieve controle en DMSO als vehikelcontrole, volgens de in figuur 2 layout. Figuur 3 toont de resultaten van de primaire screening geïllustreerd door een enkele bibliotheek plaat. Representatieve OD ₆₀₀ en GFP ruwe data worden weergegeven in figuur 3A en 3B, respectievelijk. Een kleurverloop heat map, met heet (rood) om af te koelen (groene) kleuren aangeven van laag naar hoog OD ₆₀₀ / GFP waarden, is toegepast op de put-waarden. De warmte kaarten werden in een spreadsheet-software wordt gegenereerd door het toepassen van een 3-Color schaal voorwaardelijke opmaak variërend van de laagste OD ₆₀₀ / GFP uitlezing tot de hoogste OD ₆₀₀ / GFP uitlezing. Lage OD ₆₀₀ en GFP waarden ten opzichte van de DMSO-negatieve controle overeenkomt met een remming van de groei en c-di-GMP niveaus respectievelijk, terwijl hoge waarden ten opzichte van de DMSO-negatieve controle respectievelijk corresponderen met een bevordering van de groei en c-di-GMP niveaus . De robuuste z 'waarden voor de OD ₆₀₀ en GFP are berekend volgens de formule die in het protocol (5,1). Aangezien beide boven 0,5 (0,694 en 0,761 respectievelijk), werd de test robuuste kwaliteit geacht en gegevens werden verder geanalyseerd. Het% remming van de groei (OD ₆₀₀₎ en intracellulaire c-di-GMP niveau (GFP) wordt berekend door het voor met het protocol (5,2, 5,3). Representatieve gegevens worden weergegeven in figuur 4A en 4B respectievelijk. Een kleurverloop heat map, met heet (rood) om af te koelen (groene) kleuren aangeven van laag naar hoog remming%, werd toegepast op de put-waarden. Een scatter plot van de% inhibitie _{(OD600 / GFP)} uit afzonderlijke putjes op basis van het primaire scherm wordt uitgezet in Figuur 5A en 5B voor respectievelijk de OD ₆₀₀ en GFP data. A ± 50% cut-off (aangegeven met stippellijnen) is geselecteerd voor hit detectie. Potentiële treffers op basis van deze cut-off worden aangegeven met rode stippen. Twee typen verbindingen plaats kan worden discerned van de test. Treffers die in figuur 5A zijn verbindingen die de groei van bacteriën te remmen, terwijl treffers die in figuur 5B zijn verbindingen die mogelijk in staat om intracellulaire niveaus van c-di-GMP moduleren bezitten. Twee verbindingen werden geïdentificeerd als representatief hits voor deze test. Dit zijn verbinding A, een potentiële groei remmer en verbinding B, een mogelijke c-di-GMP inhibitor. Verbinding A correspondeert goed F8 in figuren 3 en 4 en had een 72,5% remming van de groei. Er was een verwachte bijbehorende inhibitie in cyclische di-GMP niveaus. Verbinding B komt overeen met zowel K3 in figuren 3 en 4 en had een 61% remming van cyclisch di-GMP niveaus zonder verandering in groei. Selecteer hit verbindingen werden verder getest met een 10-punts dosis-respons assay met een hoge concentratie van 2 mM en tweevoudige verdunningsreeks. _IC50 waarden worden berekend op basis van de dosis-responscurves (Figuur 6A en B).

Figuur 1. Overzicht: High-throughput Setup voor het screenen van kleine moleculen voor hun potentieel om cellulair niveau van c-di-GMP in P. Moduleer aeruginosa. Dit overzicht toont een stap-voor-stap weergave van het protocol dat in deze test. Een bacteriële kolonie van P. aeruginosa wordt gedurende de nacht gekweekt in een LB starter cultuur. Zonder reagens dispenser worden de cellen geïnoculeerd in 384-putjes bevattende de geselecteerde verbindingen. De platen worden gedurende 6 uur, waarna de OD ₆₀₀ en GFP worden gemeten. Met behulp van deze read-outs, verbindingen die de cellulaire niveaus van c-di-GMP invloed kan worden geïdentificeerd. Klik hier om te bekijkengrotere versie van dit cijfer.

. Figuur 2. Een 384-wells plaat Map gebruikt voor de Small Molecule screeningstest De verbindingen uit de bibliotheek (lichtblauw) worden in porties verdeeld in putten A1 - P22. De "controle" (rood) bestaande uit een eindconcentratie van 50 ug / ml tobramycine sulfaat wordt toegevoegd aan putjes A23 - P23 en de "negatieve controle" (groen) met een eindconcentratie van 1% DMSO toegevoegd aan putjes A24 - P24. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Representatieve resultaten voor One 384-wells Screening Plate. Representative ruwe data is voor OD ₆₀₀ (A) en GFP (B). Een kleurverloop heat map, met warme (Red: OD ₆₀₀ = 0,65 of GFP = 250.000) om af te koelen (Groen: OD ₆₀₀ = 0,10 of GFP = 40.000) kleuren aangeeft laag naar hoge waarden, is toegepast op de put-waarden. Wells dat de lagere OD ₆₀₀ / GFP metingen ten opzichte van de DMSO negatieve controle hebben, zal de neiging om in het rood, terwijl putten die hogere OD ₆₀₀ / GFP metingen ten opzichte van de DMSO controle te hebben zal de neiging om in het groen. Klik hier voor een grotere weergave versie van deze figuur.

Figuur 4. Representatieve resultaten voor percentage remming berekend voor een 384-well plaat. De geanalyseerde% remming gegevens staan ​​voor beide OD ₆₀0 (A) en GFP (B) read-outs. Een kleurverloop heat map, met warme (Red: OD ₆₀₀ = -150% of GFP = -20%) om af te koelen (Groen: OD ₆₀₀ = 100% of GFP = 100%) kleuren aangeven van laag naar hoog remming waarden, is toegepast op de waarden goed. Kleine moleculen, die mogelijk de groei en intracellulaire remmen c-di-GMP zal de neiging om in het groen, terwijl kleine moleculen die mogelijk stimuleren van groei en intracellulaire c-di-GMP niveaus zal de neiging om in het rood. Klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.

Figuur 5. Representatieve Scatter Plots voor% remming _{(OD600 / GFP)} verkregen van elk getest Small Molecule. Elk klein molecuul wordt vertegenwoordigd door een punt en het% remming distributievoor elk van de OD ₆₀₀ (A) en GFP (B) uitlezingen weergegeven. A ± 50% cut-off is geselecteerd voor hit identificatie. Potentiële hits worden rood gemarkeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6. Representatieve resultaten van een dosis -. Response Assay twee verbindingen (potentiële groei remmer A en mogelijke c-di-GMP inhibitor B) geïdentificeerd van vorige schermen worden verder getest in een 10 punt dosis-respons assay met een hoge concentratie van 2 mM en tweevoudige verdunningsreeks. Montage van een vier-parameter logistische functie om de gegevens opleverden IC _50-waarden van 158 uM en 193 uM, respectievelijk. Please klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Om de behandeling van bacteriële infecties te verbeteren, is het duidelijk dat een beter begrip van bacteriële gedrag op moleculair regelgevingsniveau vereist. De hier beschreven werkwijze zal komen voor microbiologen, biochemici en artsen die willen kleine moleculen die de potentie te manipuleren of het cellulaire concentraties van c-di-GMP in bacteriën ontdekken zijn. De werkwijze maakt gebruik van een recent ontwikkelde GFP bioreporter cellulaire niveaus van c-di-GMP in P. bewaken aeruginosa ^12. Deze bioreporter is gevalideerd en belangrijker niet de groei van de gebruikte stam indien gekweekt in LB 5% in PBS beïnvloeden. Het gebruik van een hele-cel-scherm om kleine moleculen te identificeren die c-di-GMP niveau verandert in vivo overwint de grote problemen van doelgerichte geneesmiddelen qua molecule penetratie door de bacteriële membranen, met name door die van Gram-negatieve bacteriën . Belangrijk, tHij test blijkt zeer robuust als een robuuste z 'waarde consistent boven 0,5 werd waargenomen in alle schermen tot nu toe. Screening met dit protocol een aantal kleine moleculen die remmen en / of intracellulaire c-di-GMP niveaus in P. bevorderen onthullen aeruginosa. Bovendien is deze test ook het potentieel om bactericide of bacteriostatische verbindingen resulteert in een daling van de OD ₆₀₀ uitlezing identificeren.

Hoewel niet in het gedeelte protocol besproken, zijn er een aantal belangrijke overwegingen voor de voorbereiding van het experiment. Het is essentieel om in gedachten te houden dat de GFP bioreporter is gebaseerd op een plasmide. Hoewel het reporterplasmide bekend zeer stabiel te zijn P. aeruginosa kan verloren gaan voortdurend na-plating, vandaar de noodzaak om vers uitgeplaat stammen gebruiken in een -80 ° C glycerol voorraad en controle fluorescentie expressie kritisch. Het is ook zeer waardevol voor uniforme groei te handhaven gedurende het schermaangezien eventuele schommelingen in deze voorwaarden domino-effect op het scherm zou kunnen hebben. Dit omvat het maken van bepaalde dat media en antibiotica premade in batch en gebruikt in de loop van het scherm. Bacterieculturen niet groeien (gebaseerd op de OD ₆₀₀ read-outs) op een uniforme wijze is een veel voorkomend probleem voor de meeste high-throughput screens van deze aard. Dit kan te wijten zijn aan effecten of afgeven van een niet homogeen bacteriekweek in de platen rand. Voor de eerste, zorg ervoor dat een gas-doorlatende afsluiting wordt gebruikt tijdens de incubatie is van vitaal belang. Terwijl de laatstgenoemde, de priming vloeistofhandler buis met een volume van de kweek ten minste drie maal het dode volume van de buis zelf wordt aanbevolen. Het is cruciaal om de magnetische roerder bij minimumsnelheid tijdens het afgeven houden. Tijdens het monitoren en opslag van de 384-putjesplaten voor consistente groei in de loop van de experimenten voorop, een situatie te vermijden is het stapelen van platen tijdens incubatie als het un veroorzakengezocht zuurstofgradiënten waardoor een scheef in het groeipatroon. Het is ook belangrijk dat de DMSO als vehikel gebruikt als negatieve controle geen negatieve invloed op groei van de stam van belang. Veel van deze problemen geassocieerd met groei kan worden voorkomen door het uitvoeren van een mock scherm met de bacteriestam plaats voorafgaand aan screening. Interpretatie van gegevens verdient ook aandacht besteed dat c-di-GMP remming resultaten worden berekend door de verandering in willekeurige fluorescentie-intensiteit eenheden die moeten worden gecorrigeerd voor de verandering in de cel dichtheid. Daartoe verschillende wiskundige formules beoordelen de gegevensuitvoer uit deze dienen ook te worden overwogen. Bijvoorbeeld kan een verbinding weergegeven als een C-di-GMP inhibitor maar eigenlijk remmend of vice versa, waarbij voorzichtige interpretatie van geïdentificeerde hits.

Er zijn verschillende nadelen en beperkingen die in de gang van dit moet worden beschouwdhigh-throughput-cel-gebaseerde scherm. Bijvoorbeeld, de bio-reporter functies op een indirecte maat van cellulaire c-di-GMP niveaus met behulp van een fluorescente probe waarvan de detectie eigenschappen verloren zou kunnen gaan door kleine moleculen die in een scherm. Een tangentiële probleem is dat de celgebaseerde assay geeft geen informatie over het mechanisme achter veranderingen in de niveaus van intracellulaire c-di-GMP. Daarom moeten belangrijke observaties uit experimenten worden bevestigd met een high-performance vloeistofchromatografie-massaspectrometrie benadering, die wordt beschouwd als de "gouden standaard" methode voor het meten van intracellulaire c-di-GMP fluctuaties in bacteriën. Bovendien kan onze procedure alleen informatie over het gedrag van bacteriën gekweekt in vitro bacteriële cellen die in het kader van de gastheer (in vivo) hun activiteiten snel te wijzigen door deze omgeving. Bovendien is het verbruik van een GFP bioreporter verstaan ​​het scherm geen rekeninghoudend met de fysiologische toestand van de bacteriecellen. Echter, kan het protocol worden aangepast aan microscopisch onderzoek van afzonderlijke putjes in de loop van het scherm.

Zelfs met deze overwegingen en beperkingen Dit high-throughput assay is nog een robuuste scherm kleine moleculen die interfereren met de intracellulaire c-di-GMP niveaus. Aangezien vele microbiële species waaronder veel bacteriële pathogenen werden bestudeerd om de modulatie van intracellulaire c-di-GMP niveaus kenmerkend zouden ons protocol worden toegepast op diverse bacteriesoorten en uitgebreid tot de studie van complexere multispecies bacteriën modellen. De test kan eenvoudig worden geoptimaliseerd voor andere bacteriële species door het veranderen van de kweekomstandigheden gebruikt of kan worden aangepast aan andere uitgangen lezen met verschillende bioreporters. Verschillende incubatietijden kunnen worden toegepast, afhankelijk van de groeifase van belang. Wanneer echter opschalen of toenemende doorvoercapaciteit, is importan t in gedachten dat de bacteriën nog zal groeien tijdens de plaat voorbereidingen en uitlezen metingen te houden. Daarom wordt aanbevolen maximaal 15 platen screenen tegelijk met dit protocol. Bovendien gebruiken platen met meer dan 384 putjes wellicht niet toelaat uniforme groei, die verdere optimalisatie. Bij afbouw van het aantal platen, kan het beter zijn om handmatig te enten met behulp van een elektronische pipet in plaats van een liquid handling robot. Het is duidelijk dat het protocol kan worden gebruikt om kleine moleculen die biofilms dispergeren onderzoeken, aangezien anti-biofilm verbindingen interfereren met c-di-GMP signalering. Het protocol kan worden gesaneerd verschillende aspecten van bacteriële fysiologie begrijpen. Aangezien c-di-GMP signalering voorkomt in de meeste bacteriën, door het bestuderen van de fysiologie van deze organismen met dit protocol kunnen we verschillende chemische stimuli bepalen om te bepalen of hun werkingsmechanisme vereist c-di-GMP signalering.

_content "> Samenvattend, de robuustheid en veelzijdigheid van de benadering die in dit protocol zal de identificatie van chemische modulatoren van c-di-GMP signalering bij vele biologische systemen bevorderen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lysogeny Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022-1KG
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-1KG
Lysogeny Broth with Agar (Lennox)	Sigma Aldrich	L2897-1KG
Ampicillin sodium	Sigma Aldrich	A0166-25G
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516-1L
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4	Life technologies	10010-056
Tobramycin sulfate	Sigma Aldrich	T1783-100MG
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	276855-250ML
Genesys 10S UV-Vis spectrophotometer	Thermoscientific	840-208100
2 mm gap electroporator cuvette	Bio-Rad	1652092
BioRad GenePulser XCell electroporator	Bio-Rad	1652662
Leica Fluorescent Stereomicroscope	Leica Microsystems	MZ16FA
BRAND magnetic stirring bar, PTFE, cylindrical with pivot ring (sterilize by autoclaving before use)	Sigma Aldrich	Z328952-10EA
384-well, white-walled, clear-bottom plates	Greiner	781098
Multidrop Combi reagent dispenser	Thermo Scientific	5840300
Multidrop Combi tubing	Thermo Scientific	24073290
VIAFLO II 16-channel electronic pipette	Integra Biosciences	4642
100 ml sterile disposable reagent reservoirs	Fisher Scientific	12399175
AeraSeal air-permeable membranes	Sigma Aldrich	MKBQ1886
Pherastar plate reader (Software version: 4.00 R4, Firmware version: 1.13)	BMG Labtech	Pherastar FS