Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Site Gericht spin labeling en EPR spectroscopische Studies van pentamere Ligand-ionkanalen

10.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54127

⸱

4 juli 2016

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, Case Western Reserve University, 2School of Medicine, Case Western Reserve University

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft methoden voor door de gebruiker bepaalde spinlabeling en reconstituur van pentamere ligand-gebonden kanalen voor studies met Elektronen Paramagnetische Resonantie. Dit protocol kan worden aangepast voor elk membraaneiwit. De hier beschreven reconstituurmethode kan ook worden gebruikt voor patch-clamp metingen van macroscopische en enkele-kanaalstromen in een gedefinieerd lipidensysteem.

Samenvatting

Ionenkanaal gating is een stimulus-gedreven orkestratie van eiwitbewegingen die leidt tot overgangen tussen gesloten, open en gedessensibiliseerde toestanden. Fundamenteel voor deze overgangen is de intrinsieke flexibiliteit van het eiwit, die kritisch wordt gemoduleerd door de samenstelling van membraanlipiden. Om de structurele basis van kanaalfunctie beter te begrijpen, is het noodzakelijk om eiwitdynamica in een fysiologische membraanomgeving te bestuderen. Elektron Paramagnetische Resonantie (EPR) spectroscopie is een belangrijk hulpmiddel om conformationele overgangen tussen functionele toestanden te karakteriseren. In vergelijking met NMR en röntgenkristallografie is de informatie die uit EPR wordt verkregen intrinsiek van lagere resolutie. Echter, in tegenstelling tot andere technieken, is er in EPR geen bovengrens aan het moleculair gewicht van het eiwit, zijn de monstervereisten aanzienlijk lager en, belangrijker nog, het eiwit wordt niet beperkt door de krachten van het kristalrooster. Daarom is EPR uniek geschikt voor het bestuderen van grote eiwitcomplexen en eiwitten in gereconstitueerde systemen. In dit artikel zullen we algemene protocollen bespreken voor plaatsgerichte spinlabeling en membraanreconstitutie met behulp van een prokaryotisch proton-gegatterde pentamere Ligand-Gegatterde Ionenkanaal (pLGIC) uit Gloeobacter violaceus (GLIC) als voorbeeld. Er zal een combinatie van steady-state Continuous Wave (CW) en Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR benaderingen worden beschreven die een complete kwantitatieve karakterisering van kanaaldynamica mogelijk maken.

Inleiding

In de afgelopen tien jaar is de structurele begrip van pentamere-Ionotrope receptor (pLGIC) gegroeid in sprongen en grenzen, als gevolg van massa's met een hoge resolutie structuren van een aantal leden van de familie. Belangrijke factoren die tot de huidige ontwikkelingen op het gebied omvatten de ontdekking van prokaryote pLGIC kanalen 1-3 belangrijke vooruitgang in eukaryote membraan eiwitexpressie 4-6 en enorme doorbraken in structuurbepaling benaderingen. 7 Deze structuren een duidelijke consensus de totale bescherming van de driedimensionale architectuur van pLGIC. Echter, twee belangrijke gebieden die lijken te achter parcours zijn de functionele karakterisering van deze kanaal voorbereidingen en de mechanistische beschrijving van het kanaal functie.

Gating conformationele veranderingen zijn complex en komen dus op 60 een afstand langs de lengte van het kanaal en deze overgangen worden uitgebreid gemoduleerd doormembraanlipiden. Met name negatieve lipiden, cholesterol en fosfolipiden blijkt de functie van pLGIC 8-11 moduleren. Hoewel de precieze rol van deze lipide bestanddelen in kanaal functie nog onbekend is, zou een volledige moleculaire begrip van gating vereist het bestuderen van deze kanalen in hun eigen omgeving. Site-Directed Spin Labeling (SDSL) en elektronen paramagnetische resonantie (EPR) spectroscopie zijn de technieken van de keuze voor het bestuderen van eiwit dynamiek in opgeloste systemen. EPR spectroscopie wordt niet beperkt door de molecuulgrootte (volgens NMR) of optische eigenschap van het monster (volgens fluorescentiespectroscopie), waardoor aldus metingen van volledige lengte constructen opgelost in lipide natieve omstandigheden. De techniek is zeer gevoelig en heeft een relatief lage eisen monster (in de pico-mol bereik). Beide aspecten maken de techniek zeer geschikt voor het bestuderen van grote membraaneiwitten die moeilijk in te drukken in milligramhoeveelheden.

Het gebruik van EPR spectroscopie gecombineerd met plaatsgerichte spin labeling werd ontwikkeld door Wayne Hubbell en collega's, en is aangepast voor het bestuderen van verschillende types eiwit. 12-24 EPR gegevens werden gebruikt om secundaire structuren te onderzoeken, veranderingen in het eiwit conformatie, membraan-insteekdieptes en eiwit-eiwit / eiwit-ligand interacties.

De werkwijze omvat cysteïne vervanging op posities plaats door plaatsgerichte mutagenese. Sitespecifieke labeling waarborgen, is het noodzakelijk om natieve cysteïnes te vervangen door een andere aminozuur (bijv. Serine) een cysteïne-less sjabloon. Verreweg de meest populaire spinlabel een thiol-specifieke MTSL: (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate die hecht aan het eiwit via een disulfidebinding brug. Door de hoge specificiteit, relatief kleine omvang (iets groter dan tryptofaan) en flexibaarheid van het linkergebied, heeft deze spinlabel aangetoond uitstekende reactiviteit zelfs met een begraven cysteïne. Voorts tot de reactiviteit te maximaliseren, de markeringsreactie van het eiwit wordt uitgevoerd in de detergens gesolubiliseerde vorm uitgevoerd. Na afscheiding van de overmaat vrije spin-label door gelpermeatiechromatografie, wordt het eiwit opgelost in liposomen of bilaag nabootsen systemen gedefinieerde lipidesamenstelling. In het algemeen wordt cysteine ​​mutagenese goed verdragen in de meeste delen van het eiwit en de betrekkelijk geringe omvang van de spin-probe geeft vrijwel geen storing van de secundaire en tertiaire structuren. Opdat de modificatie vastgehouden wildtype functies kunnen het gemerkte en geregenereerde kanalen worden bestudeerd door de patch-clamp metingen.

Het gemerkte-functioneel eiwit wordt vervolgens onderworpen aan spectroscopische metingen, die in wezen bevatten drie hoofdtypen informatie: 12,14,15,20,22,23,25-27 spin-probe dynamica van lineshaap analyse; toegankelijkheid van de sonde te paramagnetische ontspanning agenten; en afstand distributie. 27 EPR afstanden worden gemeten door twee verschillende benaderingen. De eerste is gebaseerd op de Continuous Wave (CW) techniek, waarbij spectrale verbreding gevolg van dipolaire interacties tussen spin-labels (in de 8-20 Å afstandsbereik). Wordt gebruikt om de afstand te bepalen 28,29 De tweede is een gepulste EPR methode waar afstand metingen tot 70 Å. 30-34 kan worden verlengd in Double Electron Electron Resonance (herten), oscillaties in de spin-echo amplitude worden geanalyseerd om afstanden en de afstand distributies te bepalen. Hier de spin echo gemoduleerd op de frequentie van de dipool interactie. Samen worden deze parameters gebruikt om eiwit topologie, secundaire structurele elementen, en eiwit-conformationele veranderingen te bepalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Site mutagenese en Cys Mutaties

  1. Klonering en mutagenese
    OPMERKING: GLIC wildtype (wt) 35 heeft een natieve cysteïne (C27), die is gemuteerd naar serine-cysteïne een minder achtergrond te maken. Cysteïne mutaties worden geïntroduceerd op de cysteïne-less achtergrond door plaatsgerichte mutagenese onder toepassing van primers die een cysteïne codon voeren op de gewenste positie 36.
    1. Meng 5 ui 10x reactiebuffer, 1 pi 100 ng / ul cysteine-loze GLIC matrijs DNA 35, 0,5 pl elk van 40 pM forward en reverse primer 36, 1 pl dNTP's (100 mM), en 41 pl gedeïoniseerd water . Pipetteer het monster een paar keer om het goed te mengen, centrifugeren (6000 rpm) en tot slot voeg 1 pl DNA polymerase.
    2. Stel de thermo-cycler het volgende protocol:
      1. Denaturatie bij 95 ° C gedurende 4 min.
      2. Denaturatie bij 95 ° C gedurende 30 sec.
      3. temperening bij 55 ° C gedurende 1 min.
      4. Verlenging bij 68 ° C gedurende 10 min (ongeveer 1 minuut per kb plasmide lengte).
      5. Herhaal stap 1.1.2.2 - 1.1.2.4 voor 18 cycli.
      6. Een laatste verlenging bij 68 ° C gedurende 10 minuten.
      7. Houden temperatuur op 4 ºC
        OPMERKING: Uitgloeitemperatuur is berekend op basis van de primer Tm.
    3. Voeg 1 pl DpnI aan het reactiemengsel, grondig mengen door pipetteren en spin down (6000 rpm) gedurende 1 min. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C.
  2. transformatie
    1. Dooi E. coli competente cellen op ijs. Aliquot 30 pi cellen in een 14 ml steriele transformatie buis en voeg 1 pl gedigereerde DNA aan de cellen. Meng door op de zijde van de buis. Incubeer gedurende 20 min op ijs.
    2. Plaats de buis in een 42 ° C waterbad gedurende 45 seconden en zet hem weer op ijs gedurende 2 minuten. Voeg 400 ul steriele SOC media en schud de cellen in een Incubator bij 37 ° C gedurende 1 uur.
    3. Plaat 100 ul van cellen op LB-platen bevattende kanamycine (50 uM) en 1% glucose. Incubeer de platen O / N bij 37 ºC.
    4. Oogst van een enkele kolonie van de plaat en inoculeren in 5 ml O / N kweken die LB / kanamycine media. Incubeer de cultuur O / N (~ 16 uur) bij 37 ° C in een incubator shaker.
    5. Uittreksel DNA van de O / N kweek door minipreparation 37. Kwantificeren van de opbrengst van DNA onder toepassing van een spectrofotometer door het meten van de absorptie bij 260 nm golflengte. 200 ng / ul - de concentratie moet ~ 100 zijn. Bevestigen de aanwezigheid van de mutatie door middel van standaard recombinant DNA-sequencing strategieën 38,39.

2. GLIC Expressie en zuivering

  1. transformatie
    1. Volgens de in paragraaf 1.2 beschreven, transformatie 30 pi competente cellen C43 met 1 ui (100-200 ng / ul) van het plasmide dat het gen dat codeert voor GLIC samen met een Human Rhinovirus (HRV) -3C proteasesplitsingsplaats (Voor de plasmide en gensequentie, wordt verwezen naar de aanvullende tekst) 35 (vanaf stap 1.2.5).
    2. Plaat 100 ul van cellen op LB-agar platen die 1% glucose en 50 ug / ml kanamycine, en incubeer ze O / N (= 16 uur) bij 37 ° C in een incubator.
    3. Controleer visueel voor kolonies en ervoor zorgen dat ze niet over-geteeld of tonen de aanwezigheid van satelliet-kolonies. Onmiddellijk dichten van de platen met parafilm en op te slaan bij 4 ºC.
  2. Het opzetten van O / N-culturen en de voorbereiding van de groei media
    1. Sla een geïsoleerde kolonie middels lus enten draad en over in een 100 ml steriele kolf die 20 ml Luria Broth (LB) medium aangevuld met steriele 1% glucose en 50 ug / ml kanamycine. Incubeer hen O / N (= 16 uur) bij 37 ° C in een schudinrichting bij 250 rpm.
    2. Autoclaaf 900 ml Terrific Broth (TB) media (zie Media en Buffer Composition) in 2.8L Fernbach glasflessen voor de bacteriecultuur in stoom cyclus bij 121 ° C gedurende 20 min.
  3. Het opzetten van grote groei culturen
    1. Voeg 100 ml steriel kaliumfosfaatbuffer (Zie Media en Buffer Samenstelling) aan de geautoclaveerde TB media. Voeg steriele glucose (0,2% eindconcentratie), kanamycine (50 ug / ml) en 10 ml van de O / N kweek. Incubeer bij 37 ° C in een schudinrichting bij 250 rpm.
    2. Controleer de extinctie bij golflengte 600 nm (OD 600) met behulp van een densitometer of spectrofotometer uur totdat 0,5 (~ 2 uur) bereikt. Op dit moment beperken de snelheid 150 rpm en laat de temperatuur tot 18 ° C. Controleer de OD 600 elke 30 min totdat zij tot 0,8 (~ 1 uur).
    3. Voeg 50 ml glycerol en verder schudden van de kweek tot de OD 600 bereikt 1,0-1,2 (~ 15-30 min).
      NB: Onder deze omstandigheden, het duurt ongeveer een uur voor de kweek tot 18 ºC bereiken vanaf 37 ºC. Het is important dat glycerol wordt toegevoegd aan de kweek na afkoeling tot 18 ° C.
    4. Induceren van de cellen met 200 pM IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) en opnieuw de shaker naar 250 rpm en incubeer verder gedurende 16 uur bij ~ 18 ° C.
  4. Protein Purification
    1. Controleer of de OD 600 eind 16 hr ~ 16 - 18. Oogst de cellen in 1,0 L centrifuge flessen door het draaien bij 8500 xg, 4,0 * C gedurende 15 minuten. Decanteer het supernatant en wegen van de fles met de celpellet. Bereken het gewicht van de pellet door het aftrekken van het gewicht van de lege fles van het totale gewicht.
      OPMERKING: De verwachte gewicht celpellet is ~ 30 - 35 g / l. Hoewel moet worden opgemerkt dat er kan variabiliteit in het eindgewicht OD 600 en celpellet in mutanten.
    2. Resuspendeer de bacteriële pellet in 150 ml ijskoude buffer A (100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7,4) per 1.0 L van de cultuur. Voeg DNase I (100 ug / ml) en proteae remmers (fenylmethylsulfonylfluoride (1 mM), leupeptine (2,0 gg / ml), aprotinine (2,0 ug / ml) en pepstatine A (1 ug / ml)).
    3. Homogeniseren van de cellen door ze door een cel disrupter in een 4,0 ºC koude kamer. Herhaal het proces drie keer zo dat de meeste bacteriën gelyseerd. Centrifugeer de cellen bij 14.000 xg gedurende 15 min en de supernatant pipet uit en in een schone centrifugebuis. Gooi de pellet, die niet-gelyseerde cellen en inclusielichamen bevat.
    4. Centrifugeer de supernatant bij 168.000 xg gedurende 1 uur. Scheid voorzichtig de bovenstaande zonder verstoring van het membraan pellet.
    5. Verzamel de membraan pellet van 1 liter cultuur en resuspendeer in Buffer A (aangevuld met 10% glycerol) tot een eindvolume van 50 ml. Voeg 0,5 g n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) aan de membraansuspensie en nutate gedurende 2 uur bij 4,0 ° C.
    6. Na membraan oplossen, verwijderen cel puin van het lysaat door centrifugatie bij 168.000 xg gedurende 1 uur. In de tussentijd bereiden amylose hars. Overdracht 3 ml hars met een pipet in een lege polypropyleen chromatografiekolom. Was de hars door het passeren van 10 volumes bed van water 3 keer en dan met 10 bed volumes buffer A die 0,5 mM DDM.
    7. Na centrifugeren, verwijder voorzichtig de supernatant met behulp van een pipet overgebracht in een schone 50 ml conische buis. Voor ladingsgewijze binding, voeg vooraf geëquilibreerd amylosehars de conische buis. Bind het geëxtraheerde eiwit amylosehars door Tuimelschijfmeter het mengsel gedurende 2 uur bij 4,0 ° C.
    8. Leid de gehele suspensie door een chromatografie kolom en verzamel het doorstroomkanaal. Laat vervolgens de gehele verzamelde doorstroom op de hars een tweede keer om binding te maximaliseren.
    9. Pass 10 bedvolumes buffer A met 0,5 mM DDM, 0,5 mM tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP) en 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) om ongebonden eiwitten te verwijderen.
    10. Elueer het GLIC eiwit met 10 ml Buffer A met 40 mM maltose naast 0,5 mM DDM en 0,05 mM TCEP. TCEP voorkomt oxidatie van cysteïne zijketens. Verzamel de gehele eluaat.
    11. Concentreer het geëlueerde eiwit middels centrifugale concentrator (Molecular Weight Cut-off = 50 KDa) tot 4-6 mg / ml en voeg HRV-3C protease (200 ug per 10 mg eiwit) en geïncubeerd O / N bij 4,0 ° C.
      OPMERKING: Ga na de voltooiing van protease digestie door uitvoering van de monsters aan SDS-PAGE-gel (zie stap 2.5.5 en figuur 1).
  5. Site-Directed Spin-labeling
    1. Voeg ongeveer 100 pi 200 mM voorraad (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) MTSL 40 in DMSO en bewaar de voorraad bij -20 ° C in 25 pi aliquots.
    2. Gebruik de-protease verteerde monster voor spin-labeling met MTSL. Voeg 10-voudige molaire overmaat van MTSL spin-label (GLIC monomeer: ​​MTSL in 01:10 molverhouding). Incubeer op ijs gedurende 1 uur. Voeg een tweede schot van spin-label op een 5-voudige molaire overmaatverhouding en incubeer gedurende nog een uur.
      OPMERKING: Bij begraven posities (met klein spin labeling, hieronder beschreven), een 30 maal molaire overmaat van spin label wordt toegevoegd en het eiwit wordt gedurende 6 uur.
    3. Passeert het monster een op grootte-uitsluiting Fast Protein Liquid Chromatography kolom (FPLC) die vooraf geëquilibreerd met buffer A en 0,5 mM DDM voor het gesplitste MBP en de overmaat vrije spin-label van GLIC pentameren scheiden. Verzamel 1 ml fracties in totaal 30 ml elutie. Verzamel de fracties die GLIC pentameren (figuur 1). Volg de instructies van de fabrikant om de FPLC draaien.
    4. Bepaal de concentratie van het monster met een spectrofotometer door het meten van de absorptie bij 280 nm golflengte. Molaire extinctiecoëfficiënt en het geschatte molecuulgewicht van GLIC monomeer 49.850 M-1 cm-1 en 36.380 Da, respectievelijk. Concentreer de eiwitoplossing met een centrifugale concentrator (MolecularWeight Cut-off = 50 KDa) tot een uiteindelijke concentratie van ~ 8-10 mg / ml en plaats het op ijs. Het monster is nu klaar voor reconstitutie.
    5. Als extra kwaliteitscontrole om ervoor te zorgen dat de voorbereiding is biochemisch homogeen, lopen een vermindering van (1,0% β-ME) SDS-PAGE gel.
      OPMERKING: De Coomassie gekleurde gel moet een enkele band zien bij ~ 33 kDa die overeenkomt met de GLIC monomeer (figuur 1).
    6. Voor de spin-gelabelde mutanten vermoedelijk vertonen dipolaire verbreding onder-etiket van de monsters in de aanwezigheid van 41 diamagnetische label. Incubeer het geëlueerde eiwit met 0,1-voudige MTSL en incubeer op ijs gedurende 1,0 uur. Daarna voeg 20-voudige molaire overmaat diamagnetische label (1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methaan thiosulfonate.
      OPMERKING: De diamagnetische reagens hier gebruikte iso-sterische de paramagnetische label met dezelfde labeling chemie.
    7. Incubeer het monster op ijs gedurende 2 uur. Passeert het monster door een size uitsluitingschromatografie kolom die vooraf is geëquilibreerd met buffer A en 0,5 mM DDM als in stap 2.5.3.
  6. Efficiëntie van spin labeling
    1. Spin label rendement wordt gedefinieerd als de verhouding van de spin-label concentratie de concentratie van cysteïne zijketen (GLIC-monomeer). Om de efficiëntie van spin label van het monster te bepalen, wordt de geïntegreerde intensiteit van het monster vergeleken met een standaard van bekende concentratie met een kalibratie plot. Maak oplossingen van een EPR standaard (zoals 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxyl: TEMPO) in verschillende concentraties (10-250 uM) door oplossen in water.
    2. Meet de EPR signaal voor elk van deze oplossingen en het gebied onder de curve (dubbele integratie van het EPR-signaal) voor elke concentratie te bepalen (zoals beschreven in stap 6.1). Genereer een ijkcurve door de gemeten gebied als functie van de TEMPO concentratie en het aanbrengen met een rechte lijn.
      LET OP: Het zijneen onder een derivaat EPR signaal is een betere beschrijving van de spectrale intensiteit dan de piek tot piek amplitude. Integratie van de eerste afgeleide EPR signaal het absorptiespectrum, zullen een tweede integratie dan geeft het oppervlak onder het absorptiespectrum (die evenredig is met de spin concentratie). Zorgen voor een constante basislijn zowel in lage-veld en hoge veldgebied van het spectrum.
    3. Meet de concentratie van de spin-gelabelde eiwit in het detergens met een spectrofotometer (zoals in stap 2.5.4). Nu is het meten van de EPR-signaal van het monster en dan bepalen het gebied van de dubbele integraal van de EPR signaal volgende stappen in paragraaf 6.1. Via de kalibratie plot, het gehalte aan het label dat overeenkomt met de gemeten EPR signaal. Bereken de spin labelingsefficiëntie de molverhouding van spin label en eiwitconcentratie.

3. GLIC Reconstitutie in Asolectin Membranen

  1. liposoompreparaat
    1. Spoel een schone 25 ml rondbodemkolf met 5 ml chloroform en droog de ​​kolf in een stroom N2 gas in de zuurkast. Overdracht 10 mg asolectin (soja polaire extract 25 mg / ml voorraad in chloroform) in de kolf en droog de ​​lipiden onder een continue stroom N2-gas.
      NB: De keuze van de lipiden voor reconstructie is gebaseerd op bevindingen uit experimenten in hoofdstuk 4.
    2. Wanneer de chloroform verdampt, de kolf in een vacuum gedurende 1 uur tot volledige droging. Voeg 1 ml van buffer A reconstitutie aan de gedroogde lipide en vortex de kolf krachtig aan de lipide pellet krijgen suspensie.
    3. Kleine unilamellaire blaasjes te bereiden, ultrasone trillingen de lipide suspensie in een koude badsonicator tot de vesicle oplossing min of meer doorschijnend en geen klonten ontstaan ​​(ongeveer 10 - 15 min). Aan dit mengsel toevoegen DDM tot een eindconcentratie van 4 mM en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
  2. Reconstitutie
    1. Voeg het gezuiverde eiwit uit stap 2.5.4 aan de lipide mengsel.
      OPMERKING: Het eiwit tot lipideverhouding afhankelijk van het type experiment. Voor macroscopische stroommetingen, een 1: 10.000 verhouding gebruikt. Voor EPR studies wordt reconstitutie uitgevoerd bij een hogere eiwit lipideverhouding (1: 2500) om het signaal te maximaliseren. Het is eerder aangetoond dat deze concentraties geen zijdelingse aggregatie waargenomen 42.
      OPMERKING: Typische werkhoeveelheid van GLIC voor EPR is ~ 1 mg, hoewel gebaseerd op de positie gesondeerd, zouden kleinere hoeveelheden zo goed.
    2. Incubeer het monster bij 4 ° C gedurende 1 uur met zachte rotatie verdun vervolgens het monster tot 15 ml met buffer A.
      OPMERKING: Deze stap brengt de concentratie reinigingsmiddel onder de kritische micellaire concentratie (CMC).
    3. Verwijder de zeepresten in de suspensie door het toevoegen van polystyreen korrels (met hydrofobe poriën die val wasmiddel). Voeg 80 mg van het reinigen van de kralen en incubeer de liposome schorsing O / N op een nutator bij 4 ºC.
      1. De korrels gebruiksklaar te maken, weeg ~ 100 mg en overbrengen naar een 50 ml conische buis. Voeg 10 ml van methanol, schud krachtig, spin down de kralen bij 8.000 xg gedurende 2 minuten, en giet de methanol. Herhaal dit proces van methanol Was driemaal. Herhaal dit met 30 ml gedeïoniseerd water, driemaal wassen.
    4. De volgende dag, dragen de liposoom naar een 25 ml buis ultracentrifuge toepassing van een kolom filter om de korrels te verwijderen en het monster verder te verdunnen tot 25 ml. Centrifugeer de monsters bij 168.000 xg gedurende 2 uur. Giet het supernatant en resuspendeer de pellet met 100 pl Buffer B.

4. Bepaal Optimale Lipid Compositie voor Reconstitutie door FRET

  1. Gebruik een fluorescentie-energieoverdracht (FRET) gebaseerde bepaling om het membraan preparaat dat het eiwit handhaaft monodisperse bepalen.
  2. Zuiver gew GLIC (met de inheemse cysteïne, C27) van de volgende stappen in paragraaf 2. Label beschreef het eiwit op een 10: 1 (label / monomeer) molverhouding met ofwel fluoresceïne-maleïmide of tetramethylrhodamine-maleïmide met behulp van stappen in paragraaf 2.5.
  3. Na in paragraaf 3.2 om de oplossing te bereiden drie monsters per lipidesamenstelling te testen, eerste, fluoresceïne-gelabelde GLIC in een molaire verhouding van 1:. 1500 (pentameer: ​​lipide) tweede-rhodamine gemerkte GLIC in een molverhouding van 1: 1500 (pentameer: ​​lipide). Ten derde, meng wasmiddel oplosbaar fluoresceïne en rhodamine gemerkt GLIC (1: 1 molverhouding). Reconstrueren dit mengsel in 1: 750 (pentameer: ​​lipide) ratio.
    LET OP: We gebruikten drie lipide-systemen: asolectin, POPC: POPG (3: 1 molverhouding) en E. coli polaire extract. Het eiwit lipide reconstitutie verhouding in het FRET experiment hoger zijn dan bij EPR metingen (1: 750 in relatie tot 1: 1500 voor EPR studies).
  4. Verdundhet liposoom suspensie (de lichtverstrooiing signaal te verminderen; ~ 5 ul in 995 pl Buffer A), dan pipet het monster in een kwarts cuvet en plaats deze in een fluorimeter.
  5. Stel de golflengte excitatie bij 490 (die overeenkomt met de absorptiemaxima van de donor: fluoresceïne). Volgens de instructies van de fabrikant, nemen de emissiespectra van 500 nm tot 660 nm.
    LET OP: Voor de fluoresceïne-gelabelde GLIC sample, zie je een piek bij 518 nm (overeenkomend met fluoresceïneemissie) zonder piek bij 572 nm (overeenkomend met rhodamine emissie). Voor de-rhodamine gemerkte GLIC sample, zul je niet een piek te zien bij 518 nm, maar in plaats daarvan bij 572 nm als gevolg van directe excitatie van rhodamine bij 490 nm. Voor het monster dat zowel fluoresceïne en rhodamine labels, een afname in fluoresceïne piekintensiteit en een corresponderende toename van rhodamine piek is een FRET signaal dat waarschijnlijk een indicatie van laterale aggregatie van het eiwit op het membraan.
  6. bewaken van deamplitude van rhodamine emissie bij 572 nm op verschillende tijdstippen (0-24 uur) opname op elk uur gedurende de eerste 6 uur en vervolgens na O / N incubatie (Figuur 2). Voor elk interval, het meten van de fluorescentie-intensiteit bij 572 nm (voor rhodamine: Ia) en 518 nm (voor fluoresceïne: Id). Trek de bijdrage van directe rhodamine activering (monster 2 in stap 4.3) van Ia (IAC). Bepaal de FRET-ratio Iac / (IAC + Ib). Vergelijk FRET op verschillende tijdstippen en in verschillende lipide composities.
    Opmerking: Als controle uitvoeren stap 4,5 en 4,6 voor detergent gesolubiliseerd monsters en vergelijkt de emissiespectra voor uit gereconstitueerde liposomen. Gebruik een equimolair mengsel van gemerkt eiwit in detergens (beschreven in stap 4,3) en verdund in buffer A aangevuld met 0,5 mM DDM. Verwacht wordt dat detergens monsters minimale FRET signaal tonen.

5. Functionele Metingen door Patch-clamp Recordings

  1. Bereid proteoliposomes voor patch-clamp metingen op precies dezelfde manier als voor EPR studies (paragraaf 3.1).
    LET OP: Echter, past het eiwit: lipide-ratio op basis van de aard van de meting moet worden verricht (Single-channel vs Macroscopische opnames). Flash-bevriezen de proteoliposomen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C tot gebruik. Typisch, reconstrueren GLIC in 1: 10.000 eiwit: lipide (molverhouding) voor macroscopische stromen en 1: 50.000 molverhouding voor single-channel opnames.
  2. Dooi liposomen op ijs. Spoel een schone glasplaatje met water en ethanol en droog volledig. Plaats een 10 ul druppel van het proteoliposoom in het midden van de schuif en droog O / N in een exsiccator bij 4 ° C onder vacuüm.
  3. Re-hydraat gedroogde proteoliposomen door toevoeging van 20 pl buffer B (150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,0) en plaats de dia in een petriplate bovenop een vochtig filterpapier. Bedek de plaat en laat de rehydratie verlopen gedurende ongeveer 2 uur.
    OPMERKING: Dit proces yields gigantische multi-lamellaire liposomen die bevorderlijk zijn voor patch uit zijn.
  4. Trek patch pipetten van dunwandige borosilicaatglas haarvaten (~ 1-2 micrometer tip diameter) met behulp van de fabrikant aanbevolen instelling op de pipet trekker. Heat-polish met behulp van een brand-smeden tot een weerstand van 1,5 - 2MΩ wanneer gevuld met Buffer B.
  5. Vul de opname kamer met buffer B met behulp van een pipet en bevestig de Ag / AgCl aardelektrode. Met behulp van een 2 pi pipet tip voorzichtig los van de liposomen van de rand en overdracht 1 pl van de schorsing voor de opname kamer. Wacht een paar minuten voor de liposomen om zich te vestigen op de bodem.
  6. Vul het patch-pipet met Buffer B met behulp van een niet-metalen injectienaald en monteren op de versterker hoofd-podium. Identificeer een enkele geïsoleerde blaasje te patchen. Breng een lichte positieve druk om te voorkomen dat de patch-pipet verstopt raakt, en steek de punt in de opname kamer.
  7. Solliciteer testpulsen aan de pipet resistant metennvu en te compenseren voor de pipet spanning te compenseren. Benader het blaasje, en wanneer contact wordt gemaakt, breng dan een lichte onderdruk om trek het blaasje tegen de patch pipet om een ​​gigaohm afdichting te vormen.
  8. Bewaken van de weerstand van de pipet gedurende het gehele proces. Zodra de gigaohm afdichting is gevormd, trekken de pipet voorzichtig uit de buurt van het liposoom om een ​​inside-out patch vormen. Schakel de test puls.
  9. Stel de holding potentiaal -100 mV, en pas een pH puls. Lage pH werd verkregen met 10 mM natriumcitraat buffer C (150 mM NaCl, 10 mM citraat, pH 3,0). (Figuur 3)
    OPMERKING: Opnames worden gemaakt met een sampling frequentie van 10 kHz voor macroscopische en 40 kHz voor single channel metingen.

6. EPR Metingen

  1. Continuous-Wave EPR spectroscopie
    1. Breng de liposoom suspensie van stap 3.2 in een 200 ui buis en pellet de monsters met behulp van een centrifuge. Gooi de supernatant en monster is klaar voor EPR metingen.
      OPMERKING: EPR metingen is het belangrijk om zoveel buffer van het liposoom monster mogelijk te verwijderen. Aangezien waterige monsters absorberen de elektrische deel van de magnetron resulteert in verwarming en minder gevoelig.
    2. Om buffer uitwisseling uit te voeren, overdracht 20 ul van liposoom pellet met behulp van een pipet om een ​​microfugebuis. Voeg 180 ul buffer D (100 mM NaCl, 10 mM citraat, pH 3,0) en incubeer bij 42 ° C waterbad gedurende 5 min. Centrifugeer het monster, de bovenstaande vloeistof met een pipet en herhaal het proces drie keer om volledige bufferuitwisseling waarborgen.
      LET OP: Als alternatief kan de buffer uitwisseling worden gemaakt door het onderwerpen van de monsters aan meerdere vries / dooi cycli.
    3. Gasdoorlatend plastic haarvaten zijn geschikt voor het meten van zowel de spectrale lijn-vormen en solvent toegankelijkheid. Tik op de capillaire op het ingehulde proteoliposoom om het monster binnen te trekken en sluit het uiteinde met bot was.
      NIETE: Typisch sample volumes zijn ~ 5 pl en een wenselijke spin-concentratie van 150 uM. Als het doel is om lijn vormen alleen te meten, kan men gebruik maken van 0,4 mm OD kwarts capillaire buizen. Indien nodig kan een pipet worden gebruikt voor het vullen van het monster in het capillair.
    4. Bedien de spectrometer
      1. Voer CW-EPR metingen bij RT (292-297 K) op een X-band spectrometer uitgerust met een diëlektrische resonator volgens de fabrikant handleiding.
      2. Zet het water chiller, voeding, en een magnetron brug console. Laat het systeem thermisch evenwicht gedurende ongeveer 30 minuten voordat de opname. Open de acquisitie software.
      3. Steek de monsterbus / capillair in de resonator, ervoor te zorgen dat het gedeelte van de buis gevuld met het monster is in het centrum van de resonator holte. Tunen van de resonator volgens de instructies op de spectrometer handleiding.
      4. Noteer de eerste afgeleide absorptiespectrum door veld sweep opeen incident microgolfvermogen van 1,0 mW, een modulatiefrequentie van 100 kHz en een sweep breedte van 100 G. Bepaal de optimale stroom voor het experiment door middel van een progressieve power verzadiging experiment waarbij de piek-tot-piek hoogte van de eerste afgeleide CW EPR signaal wordt gemeten als functie van de vierkantswortel van het invallende microgolfvermogen.
        OPMERKING: Bij lagere magnetron krachten, de intensiteit van het signaal neemt toe met de vierkantswortel van het vermogen zolang het evenwicht van de bevolking spintoestanden niet beïnvloed. Echter, als de stroom verder wordt verhoogd, de spin-rooster relaxatie kan niet langer handhaven evenwicht Verschil populatie van beide spintoestanden en de signaalamplitude gaat plateau of "verzadiging". Voorbij dit punt, kan het signaal amplitude daadwerkelijk afneemt met toenemende macht in acht te wijten aan populatie-inversie van spin verzadigt. Bovendien, voor verbrede spectra met uitgebreide vleugels, waar een welomschreven flat basislijn is niet vilijk, het uitbreiden van de sweep breedte 150-200 G tot gebied te voorkomen.
      5. Begin met behulp van een modulatie-amplitude van 1,0 G.
        LET OP: Deze waarde is sample-afhankelijk en aangepast aan de lage frequentie ruis in het signaal te verlagen. Indien een te grote waarde wordt gebruikt, kan het verstoren of het signaal verbreden.
      6. Stel de tijd constant en de omschakeling tijd om 20,48 msec, vegen de tijd om 20.97 sec, en op 1024 punten.
        OPMERKING: De tijdconstante is ook gebaseerd op het monster en aangepast te filteren hoogfrequente ruis.
      7. Na de eerste scan, ligt het middenveld in het midden van het EPR-signaal en kies sweepbreedte zodat het spoor omvat het signaal en voldoende basislijn aan weerszijden.
        OPMERKING: Ook, het verbeteren van de signaal / ruisverhouding, verhoging van het aantal scans basis van de sterkte van het EPR-signaal. Inclusief sweep breedte en het aantal punten
      8. Meet de toegankelijkheid van de spin-label om botsingen ontspannende agenten O 2 of ethylenediaminediacetic zuur (Niedda) met behulp van de macht verzadiging protocollen 27 beschreven in stap 6.1.4.4.
        LET OP: Bereid Niedda zoals eerder 26 beschreven.
      9. Perfuseren eerst het monster in de holte met N2 gedurende 5 minuten (te spoelen O 2). Meet de spectra voor elke magnetron macht tussen 5 - 35 dB in stappen van 3 dB met een sweep breedte van 30 G.
      10. perfuseren dan het monster in de holte met lucht gedurende 10 min en meet de spectra op verschillende magnetron vermogens (5-35 dB in stappen van 3 dB) als in stap 6.1.4.9.
      11. Incubeer 20 ui liposoom pellet met 180 pl 50 mM Niedda (in Buffer B of Buffer D) in een 42 ° C waterbad gedurende 5 min. Centrifuge het monster en de bovenstaande vloeistof met een pipet. Laad het monster in het capillair en plaats het in de resonator holte. Herhaal stap 6.1.4.9.
        LET OP: Het principe achter het experiment is dat de interactie met paramagnetische relaxing agenten door middel van Heisenberg spin-uitwisseling zou verzadiging van het signaal en de populatie-inversie te voorkomen. Wateroplosbare en vetoplosbare Niedda moleculaire O 2 worden gebruikt als reporters voor water (zowel bulk als intraprotein balkons) en membraan blootgestelde posities op het eiwit.
  2. Analyse gegevens:
    LET OP: De analyse van de EPR-gegevens omvat de volgende stappen: 14,22,23,25-27
    1. Bereken de mobiliteit van de spin probe (AH o -1), als het omgekeerde van de centrale lijn breedte van de eerste afgeleide absorptiespectrum. AH o -1 weerspiegelt de bewegings vrijheid en de dynamiek van de sonde.
    2. Bereken de toegankelijkheid parameter (П), hetgeen een schatting van de toegankelijkheid van de sonde naar andere paramagnetische botsing ontspannende middelen, middels hieronder beschreven stappen.
      LET OP: Interactie van de spin-probe met paramagnetische ontspannende agentenverhoogt de spin-rooster ontspanningsgraad (T 1) van het nitroxide door Heisenberg spin-uitwisseling. 27
      1. Schat de toegankelijkheid parameter (П) van stroom verzadigingsexperimenten (6.1.4.8) waarin de verticale piek-tot-piek amplitude van de middellijn van de eerste afgeleide EPR spectrum wordt gemeten bij verschillende microgolfenergie. 25 Plot de amplitude van het signaal als functie van de vierkantswortel van het microgolfvermogen en past de volgende vergelijking 27.
        figure-protocol-1
        OPMERKING: waarbij A de amplitude van het signaal is een maat voor de homogeniteit van de verzadiging van de resonantielijn (gewoonlijk tussen 0,5 en 1,5), I is een schaalfactor, P het incident kracht en de staat voor de waarde waarbij de eerste afgeleide amplitude helft van de onverzadigde waarde.
  3. Bereken AP 1/2 als het verschil P 1/2 waarden met (O 2 of Niedda) en afwezigheid (geperfuseerd met N2) van paramagnetische ontspannende middelen. Bereken de toegankelijkheid parameter (П) met de formule:
    figure-protocol-2
    LET OP: Waar P 1/2 referentie en AH o verwijzing zijn de helft van de maximale kracht verzadiging waarde en de centrale lijn breedte, respectievelijk voor de referentie-standaard (zoals DPPH (2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl)) 27.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Biochemische karakterisering van Spin gelabelde GLIC Mutants

Na de hierboven beschreven protocol zou levert doorgaans GLIC MBP-fusie-eiwit in het traject van 10 - 12 mg / l cultuur. Hoewel deze waarde kan variëren in verschillende mutanten, in het bijzonder voor functies begraven in het eiwit, kan de opbrengst aanzienlijk worden aangetast. In deze gevallen kan het kweekmedium volumes vereisen schaalvergroting....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

EPR spectroscopie heeft zich bewezen als een ongeëvenaarde structurele aanpak in het kwantificeren van conformationele veranderingen in membraaneiwitten in een near-native omgeving. Deze aanpak stelt ons in staat een kijkje in de moleculaire details van eiwitten dynamiek die in hoge resolutie structuren worden verduisterd van X-ray kristallografie en Cryo-elektronenmicroscopie. Het is echter belangrijk om het technische beperkingen van deze benadering die de algemene toepasbaarheid beïnvloeden andere systemen en ook rek...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We zijn erg dankbaar voor de huidige en voormalige leden van de Chakrapani lab voor kritisch lezen en opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health subsidie ​​(1R01GM108921) en de American Heart Association (NCRP Wetenschapper Development Grant 12SDG12070069) en SC.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations
10x PfuUltra HF reaction bufferAgilent Technologies600380-52
dNTPSNew England BioLabs Inc‎N0447L10 mM each dNTP
pfu Ultra DNA polymeraseAgilent Technologies600380-512.5 U/ul
DPNINew England BioLabs Inc‎R0176S20,000 U/ml
XL10 GOLDAgilent Technologies200314
SOC mediaNew England BioLabs Inc‎B9020S
KanamycinFisher ScientficBP905
LB mediaInvitrogen127957084
Miniprep kitQIAGEN27106
C43 competent cellsLucigen60446
Expression and Purification
GlucoseFisher ScientficD16
TryptoneFisher BioreagentsBP1421-500
Yeast extractAmrescoJ850
GlycerolFisher BioreagentsBP229
K2HPO4Amresco0705
K2HPO4Amresco0781
IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside)Gold BiotechnologyI2481C25
Trizma BaseSigma Life ScienceT1503
NaClSigma-AldrichS7653
DNase ISigma Life ScienceDN25
PMSFAmrescoM145
LeupeptineAmrescoJ580
PepstatinAmrescoJ583
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside)AnatraceD310S
Amylose resinNew England BioLabs Inc‎E8021L
TCEPAmrescoK831
EDTAFisher ScientficBP118
MaltoseAcros Organics329915000
Superdex 200 GLGE Healthcare17-5175-01
Empty polypropylene Chromatography columnBioRad731-1550
Site-Directed Spin Labeling
MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) MethanethiosulfonateToronto Reaserch chemicals IncO873900
(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonateToronto Reaserch chemicals IncA167900
DMSOJ.T. Baker9224-01
Reconstitution
Asolectin lipidAvanti polar lipids Inc541602C
Biobeads (Polystyrine beads)Bio Rad152-3920
MethanolFisher chemicalsA413
FRET
Fluorescein-maleimideThermoFisher ScientificF-150
Tetramethylrhodamine-maleimideThermoFisher ScientificT-6027
POPCAvanti polar lipids Inc850457C
POPGAvanti polar lipids Inc840457C
E.coli polar lipid extractAvanti polar lipids Inc100600C
HEPESSigma Life ScienceH3375
EPR measurement
TPX plastic capillariesBrukerER221
EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid)Aldrich158186
Ni(OH)2Aldrich283622

Referenties

  1. Tasneem, A., Iyer, L. M., Jakobsson, E., Aravind, L. Identification of the prokaryotic ligand-gated ion channels and their implications for the mechanisms and origins of animal Cys-loop ion channels. Genome Biol. 6, 4(2005).
  2. Hilf, R. J., Dutzler, R. X-ray structure of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 452 (7185), 375-379 (2008).
  3. Bocquet, N., et al. X-ray structure of a pentameric ligand-gated ion channel in an apparently open conformation. Nature. 457 (7225), 111-114 (2009).
  4. Hibbs, R. E., Gouaux, E. Principles of activation and permeation in an anion-selective Cys-loop receptor. Nature. 474 (7349), 54-60 (2011).
  5. Miller, P. S., Aricescu, A. R. Crystal structure of a human GABAA receptor. Nature. 512 (7514), 270-275 (2014).
  6. Hassaine, G., et al. X-ray structure of the mouse serotonin 5-HT3 receptor. Nature. 512 (7514), 276-281 (2014).
  7. Du, J., Lu, W., Wu, S., Cheng, Y., Gouaux, E. Glycine receptor mechanism elucidated by electron cryo-microscopy. Nature. , (2015).
  8. Sunshine, C., McNamee, M. G. Lipid modulation of nicotinic acetylcholine receptor function: the role of neutral and negatively charged lipids. Biochim Biophys Acta. 1108, 240-246 (1992).
  9. Fong, T. M., McNamee, M. G. Correlation between acetylcholine receptor function and structural properties of membranes. Biochemistry. 25 (4), 830-840 (1986).
  10. daCosta, C. J., Baenziger, J. E. A lipid-dependent uncoupled conformation of the acetylcholine receptor. J Biol Chem. 284 (26), 17819-17825 (2009).
  11. Criado, M., Eibl, H., Barrantes, F. J. Functional properties of the acetylcholine receptor incorporated in model lipid membranes. Differential effects of chain length and head group of phospholipids on receptor affinity states and receptor-mediated ion translocation. J Biol Chem. 259 (14), 9188-9198 (1984).
  12. Hubbell, W. L., Lopez, C. J., Altenbach, C., Yang, Z. Technological advances in site-directed spin labeling of proteins. Curr Opin Struct Biol. 23 (5), 725-733 (2013).
  13. Columbus, L., Hubbell, W. L. A new spin on protein dynamics. Trends Biochem Sci. 27 (6), 288-295 (2002).
  14. Hubbell, W. L., Cafiso, D. S., Altenbach, C. Identifying conformational changes with site-directed spin labeling. Nat Struct Biol. 7 (9), 735-739 (2000).
  15. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19 (11), 1549-1561 (2011).
  16. Bordignon, E. Site-directed spin labeling of membrane proteins. Top Curr Chem. 321, 121-157 (2012).
  17. Klare, J. P., Steinhoff, H. J. Spin labeling EPR. Photosynth Res. 102 (2-3), 377-390 (2009).
  18. Drescher, M. EPR in protein science : intrinsically disordered proteins. Top Curr Chem. 321, 91-119 (2012).
  19. Perozo, E., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Liu, Y. S., Sompornpisut, P. EPR approaches to ion channel structure and function. Novartis Found Symp. 245, 146-158 (2002).
  20. Fanucci, G. E., Cafiso, D. S. Recent advances and applications of site-directed spin labeling. Curr Opin Struct Biol. 16 (5), 644-653 (2006).
  21. Sahu, I. D., McCarrick, R. M., Lorigan, G. A. Use of electron paramagnetic resonance to solve biochemical problems. Biochemistry. 52 (35), 5967-5984 (2013).
  22. Hubbell, W. L., McHaourab, H. S., Altenbach, C., Lietzow, M. A. Watching proteins move using site-directed spin labeling. Structure. 4 (7), 779-783 (1996).
  23. Altenbach, C., Marti, T., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. Transmembrane protein structure: spin labeling of bacteriorhodopsin mutants. Science. 248 (4959), 1088-1092 (1990).
  24. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35 (24), 7692-7704 (1996).
  25. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56 (6), 1019-1033 (1992).
  26. Altenbach, C., Greenhalgh, D. A., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. A collision gradient method to determine the immersion depth of nitroxides in lipid bilayers: application to spin-labeled mutants of bacteriorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (5), 1667-1671 (1994).
  27. Altenbach, C., Froncisz, W., Hemker, R., McHaourab, H., Hubbell, W. L. Accessibility of nitroxide side chains: absolute Heisenberg exchange rates from power saturation EPR. Biophys J. 89 (3), 2103-2112 (2005).
  28. Rabenstein, M. D., Shin, Y. K. Determination of the distance between two spin labels attached to a macromolecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (18), 8239-8243 (1995).
  29. Altenbach, C., Oh, K. J., Trabanino, R. J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Estimation of inter-residue distances in spin labeled proteins at physiological temperatures: experimental strategies and practical limitations. Biochemistry. 40 (51), 15471-15482 (2001).
  30. Borbat, P. P., McHaourab, H. S., Freed, J. H. Protein structure determination using long-distance constraints from double-quantum coherence ESR: study of T4 lysozyme. J Am Chem Soc. 124 (19), 5304-5314 (2002).
  31. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172 (2), 279-295 (2005).
  32. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9 (16), 1895-1910 (2007).
  34. Jeschke, G., Wegener, C., Nietschke, M., Jung, H., Steinhoff, H. J. Interresidual distance determination by four-pulse double electron-electron resonance in an integral membrane protein: the Na+/proline transporter PutP of Escherichia coli. Biophys J. 86 (4), 2551-2557 (2004).
  35. Hilf, R. J., Dutzler, R. Structure of a potentially open state of a proton-activated pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 457 (7225), 115-118 (2009).
  36. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Conformational transitions underlying pore opening and desensitization in membrane-embedded Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 287 (44), 36864-36872 (2012).
  37. Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
  38. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  39. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  40. McHaourab, H. S., Kalai, T., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme: effect of side chain structure. Biochemistry. 38 (10), 2947-2955 (1999).
  41. Gross, A., Columbus, L., Hideg, K., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Structure of the KcsA potassium channel from Streptomyces lividans: a site-directed spin labeling study of the second transmembrane segment. Biochemistry. 38 (32), 10324-10335 (1999).
  42. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in a Prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287 (22), (2012).
  43. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287 (22), 18467-18477 (2012).
  44. Chakrapani, S., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of an isolated voltage-sensor domain in a lipid bilayer. Structure. 16 (3), 398-409 (2008).
  45. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the KvAP pore domain lacking the voltage sensing domain. Biophysical Journal. 88 (1), 19-20 (2005).
  46. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285 (5424), 73-78 (1999).
  47. Chakrapani, S., Sompornpisut, P., Intharathep, P., Roux, B., Perozo, E. The activated state of a sodium channel voltage sensor in a membrane environment. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (12), 5435-5440 (2010).
  48. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321 (5893), 1210-1214 (2008).
  49. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418 (6901), 942-948 (2002).
  50. Kim, M., Xu, Q., Murray, D., Cafiso, D. S. Solutes alter the conformation of the ligand binding loops in outer membrane transporters. Biochemistry. 47 (2), 670-679 (2008).
  51. Kazmier, K., Sharma, S., Islam, S. M., Roux, B., McHaourab, H. S. Conformational cycle and ion-coupling mechanism of the Na+/hydantoin transporter Mhp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), 14752-14757 (2014).
  52. Durr, K. L., et al. Structure and dynamics of AMPA receptor GluA2 in resting, pre-open, and desensitized states. Cell. 158 (4), 778-792 (2014).
  53. Borbat, P. P., et al. Conformational motion of the ABC transporter MsbA induced by ATP hydrolysis. PLoS Biol. 5 (10), e271(2007).
  54. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98 (6), 18-20 (2010).
  55. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142 (2), 331-340 (2000).
  56. Jeschke, G., et al. DeerAnalysis2006-a comprehensive software package for analyzing pulsed ELDOR data. Applied Magnetic Resonance. 30 (3-4), 473-498 (2006).
  57. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).
  58. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Structural basis for allosteric coupling at the membrane-protein interface in Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 289 (5), 3013-3025 (2014).
  59. Dellisanti, C. D., et al. Site-directed spin labeling reveals pentameric ligand-gated ion channel gating motions. PLoS Biol. 11 (11), e1001714(2013).
  60. Labriola, J. M., et al. Structural sensitivity of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel to its membrane environment. J Biol Chem. 288 (16), 11294-11303 (2013).
  61. Kinde, M. N., et al. Conformational Changes Underlying Desensitization of the Pentameric Ligand-Gated Ion Channel ELIC. Structure. 23 (6), 995-1004 (2015).
  62. Vasquez, V., Cortes, D. M., Furukawa, H., Perozo, E. An optimized purification and reconstitution method for the MscS channel: strategies for spectroscopical analysis. Biochemistry. 46 (23), 6766-6773 (2007).
  63. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Lett. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  64. Hanson, S. M., Francis, D. J., Vishnivetskiy, S. A., Klug, C. S., Gurevich, V. V. Visual arrestin binding to microtubules involves a distinct conformational change. J Biol Chem. 281 (14), 9765-9772 (2006).
  65. McCoy, J., Hubbell, W. L. High-pressure EPR reveals conformational equilibria and volumetric properties of spin-labeled proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1331-1336 (2011).
  66. Mobius, K., et al. Combining high-field EPR with site-directed spin labeling reveals unique information on proteins in action. Magn Reson Chem. 43, Spec no. 4-19 (2005).
  67. Lopez, C. J., Oga, S., Hubbell, W. L. Mapping Molecular Flexibility of Proteins with Site-Directed Spin Labeling: A Case Study of Myoglobin. Biochemistry. 51 (33), 6568-6583 (2012).
  68. Fleissner, M. R., et al. Site-directed spin labeling of a genetically encoded unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (51), 21637-21642 (2009).
  69. Lorenzi, M., et al. Tyrosine-targeted spin labeling and EPR spectroscopy: an alternative strategy for studying structural transitions in proteins. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (39), 9108-9111 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

EPR spectroscopiecontinue golf EPRdubbele elektron elektronresonantieeiwitzuiveringmembraanreconstitutieliposoompreparatiegelfiltratiechromatografiecentrifugale concentratie
Site Gericht spin labeling en EPR spectroscopische Studies van pentamere Ligand-ionkanalen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.