Het creëren van Sub-50 Nm nanofluidic Knooppunten in PDMS microfluïdische chip via Self-assemblageproces van colloïdale deeltjes

Samenvatting

We stellen een eenvoudige zelfassemblerende techniek voor van silica colloïdale nanodeeltjes om een nanofluïdische kruising te creëren tussen twee microkanalen in polydimethylsiloxaan (PDMS). Met behulp van deze techniek werd een nanoporeuze parelmembraan met een poriegrootte tot ~45 nm gebouwd binnen een microkanaal en toegepast op elektrokinetische preconcentratie van DNA-monsters.

Samenvatting

Polydimethylsiloxaan (PDMS) is het heersende bouwmateriaal microfluïdische inrichtingen maken vanwege het eenvoudige vormen en lijmen en transparantie. Door de zachtheid van het PDMS materiaal, is het echter moeilijk te gebruiken voor het bouwen PDMS nanokanalen. De kanalen hebben de neiging om gemakkelijk instorten tijdens plasma binding. In dit artikel geven we een verdamping gedreven zelfassemblage methode silica colloïdale nanodeeltjes nanofluidic kruispunten maken met sub-50 nm poriën tussen twee microkanalen. De poriegrootte en de oppervlaktelading van de nanofluidic junctie instelbaar door eenvoudig de colloïdale silica korrelgrootte en oppervlak functionalisering buiten het samengestelde microfluïdische apparaat in een flesje voor de zelf-assemblageproces. Met de zelfassemblage van nanodeeltjes met een korrelgrootte van 300 nm, 500 nm en 900 nm, was het mogelijk om een ​​poreus membraan te vervaardigen met een poriegrootte van 45 nm ~, ~ 75 nm tot ~ 135 nm. onder elektrischal potentieel, deze nanoporeuze membraan geïnitieerd ion concentratie polarisatie (ICP) fungeren als een kation-selectief membraan DNA door ~ 1700 keer concentreren binnen 15 min. Deze niet-lithografische proces nanofabricage opent een nieuwe kans om een ​​afstembare nanofluidic knooppunt voor de studie van nanoschaal transportprocessen van ionen en moleculen in een PDMS microfluïdische chip bouwen.

Inleiding

Nanofluidics is een opkomende onderzoeksgebied van μ TAS (Micro Totaal Analyse Systems) om biologische processen of transport verschijnselen van ionen en moleculen in de lengte schaal van 10 ¹ te bestuderen - 10 ² nm. Met de komst van de nanofluidic hulpmiddelen zoals nanokanalen kan transportprocessen van moleculen en ionen worden bewaakt met uiterste nauwkeurigheid en gemanipuleerd, indien nodig, door gebruik functies die alleen in deze lengteschaal voor scheiding en detectie beschikbaar zijn. Een van ^1,2 deze karakteristieke nanoschaal kenmerken is een hoge verhouding van oppervlak bulk lading (of Dukhin nummer) in nanokanalen dat een lading onbalans kan veroorzaken en initiëren ion concentratie polarisatie (ICP) tussen de nanokanaal en microkanaal. ³

Een gemeenschappelijke inrichting platform voor het bestuderen van fenomenen nanofluidic bestaat uit twee microkanaal systeem verbonden door een reeks nanokanalen als knooppunt. ^4-6 Het materiaal voor het bouwen van zulke nanofluidic inrichting het silicium vanwege de hoge stijfheid die het kanaal voorkomt instorten tijdens verlijmingsprocessen. ⁷ echter silicium inrichting fabricage vereist dure maskers en aanzienlijke hoeveelheid verwerking in de cleanroom. ^{8- 10} Vanwege het gemak van fabricage inrichting met vormen en plasma binden, polydimethylsiloxaan (PDMS) is algemeen geaccepteerd als bouwmateriaal voor microfluïdische en zou een ideaal materiaal voor nanofluidics ook. Echter, de lage Young's modulus rond 360-870 kPa, maakt het PDMS kanaal gemakkelijk opvouwbaar tijdens plasma binding. De minimale verhouding van de nanokanaal (breedte diepte) minder dan 10 te zijn: 1, wat betekent dat de vervaardiging van PDMS apparaten via standaard fotolithografie extreem moeilijk wordt indien de nanokanaal diepte moet zijn dan 100 nm, waarbij een kanaalbreedte minder dan de huidige limiet van photolithOGRAFIE ongeveer 1 micrometer. Om deze beperking te overwinnen, zijn er pogingen gedaan om nanokanalen in PDMS met behulp van niet-lithografische methoden zoals die zich uitstrekt tot scheuren te starten met een gemiddelde diepte van 78 nm ¹¹ of te vormen rimpels na plasmabehandeling te creëren. ¹² instortende een PDMS kanaal met mechanische druk toegestaan ​​een nanokanaal hoogte zo laag als 60 nm. ¹³

Hoewel deze zeer inventieve niet-lithografische methoden toegestaan ​​gebouw nanokanalen onder 100 nm in de diepte, de dimensionele beheersbaarheid van het nanokanaal fabricage vormt nog steeds een obstakel voor een brede acceptatie van PDMS als bouwmateriaal voor nanofluidic apparaten. Een ander kritiek probleem van de nanokanaaltjes, hetzij in silicium of PDMS, is het oppervlak functionalisering in het geval er behoefte is om de oppervlaktelading op de kanaalwand voor het manipuleren van ionen of moleculen veranderen. Nadat het apparaat de montage door middel van binding, de nanokanalen zijn uiterst moeilijk tebereiken voor oppervlakte functionalisatie als gevolg van de diffusie beperkt transport. Om een nanoschaal kanaal met een hoge dimensionele trouw en facile oppervlak functionalisering te creëren, kan de zelf-assemblage methode om colloïdale deeltjes veroorzaakt door verdamping ^14-16 in microfluïdische apparaten een van de veelbelovende benaderingen. Naast de beheersbaarheid van poriegrootte en oppervlak bezit, is er ook de mogelijkheid om af te stemmen de grootte van de poriën in-situ bij het ​​gebruik van colloïdale deeltjes bekleed met polyelektrolyten door het regelen van temperatuur, ¹⁷ pH, ^18,19 en ionensterkte. ¹⁸ Door deze voordelen, heeft de zelfassemblage werkwijze colloïdale deeltjes reeds toepassing gevonden voor electrochromatografie, ²⁰ biosensoren, ²¹ eiwitconcentratie ²² en scheiding van eiwitten en DNA in microfluïdische. ^14,23 in deze studie, opgesteld we dit zelfassemblage methode om een te bouwen elektrokinetische voorconcentrering apparaat inPDMS een nanofluidic overgang tussen twee microkanalen vereist. ²⁴ De fundamentele mechanisme achter de elektrokinetische concentratie is gebaseerd op ionenconcentratie polarisatie (ICP). ²⁵ Gedetailleerde beschrijving van fabricage en assemblage stappen is bij het ​​volgende protocol.

Protocol

1. Voorbereiding van de silica Colloïdaal Bead Schorsingen

1. Voorbereiding van de 300 nm en 500 nm silica kraal suspensies
   1. Vortex de silica kraal voorraadsuspensie (10% w / v in water) gedurende 30 sec. om een ​​homogene suspensie te verkrijgen. Pipetteer een totaal van 600 ui voorraad suspensie in een 1,5 ml buis en centrifugeer het op 2600 g gedurende 1 min.
   2. Vervanging van de supernatant met 400 ui 1 mM natriumfosfaatbuffer (PB, pH 7,0).
   3. Schorsen de silica korrels in een eindconcentratie van 15% in 1 mM natriumfosfaat bij pH 7,0 met vortexen.
2. Oppervlak te functionaliseren 500 nm silica carboxyl kralen met poly (allylamine hydrochloride, PAH), en poly (natrium styreensulfonaat, PSS) polyelektrolyten
   1. Suspendeer 0,1 g 500 nm silicapareltjes met carboxylgroep met 10 ml 1 M NaCl (pH 7,0) gedurende 1% (w / v) kralensuspensie.
   2. Bereid 0,4% PAH (MW 65K) in 1 M NaCll door het oplossen van 300 pl van de stock oplossing (20% w / v in water) in 15 ml 1 M NaCl. Bereid 0,9% PSS (MW 70K) in 1 M NaCl-oplossing door het oplossen van 0,18 g PSS in 20 ml 1 M NaCl oplossing. Vortex beide oplossingen gedurende 1 min. de polyelektrolyten volledig op te lossen.
   3. Voeg 200 gl PAH oplossing van 9,8 ml 1% carboxyl silica korrels in een 15 ml buisje met een positief geladen polyelektrolyt laag op siliciumoxideparels met carboxyl functionele groep deponeren. Vortex de parelsuspensie gedurende 1 min. en incubeer het op een buis rotator gedurende 60 minuten. bij kamertemperatuur.
   4. Centrifugeer de suspensie bij bead 1801 xg gedurende 1 min. en afwassen de ongebonden PAH vijfmaal met 10 ml DI water. Na elke centrifuge en verwijdering van het supernatant werden de korrels dichtgepakte op de bodem van de buis. Breek de kraal massa door krachtig pipetteren met 2 ml gedeïoniseerd water voor het toevoegen van 8 ml DI water zodat de korrels kunnen worden geresuspendeerd en gewassen voorafgaand buiten naar de volgende stap centrifuge.
   5. Volgende stappen in 1.2.3 en 1.2.4 PSS bekleding op een negatief geladen laag afzetten op de korrels. Resuspendeer de kralen in 9,8 ml 1 M NaCl voor de PSS afzetting na het verwijderen DI water supernatant van de 5 ^e wasstap van 1.2.4.
      1. Gebruik dezelfde krachtige pipetteren stap middels 2 ml van 1 M NaCl te doorbreken de kraal massa onderin de 15 ml buis en voeg 8 ml van 1 M NaCl. Voeg 200 ul PSS oplossing 9,8 ml van de silica korrels afgezet met een enkele laag PAH. Na vortexen gedurende 1 min. en incubatie gedurende 60 min. op de buis rotator, herhaal 5 wasstappen met DI-water.
      2. Meet de zeta potentiaal van de korrels voor en na elke polyelektrolyt bekleden met een dynamische lichtverstrooiing volgens het protocol van de fabrikant aan de polyelektrolyt opbrengprocedure correct is uitgevoerd verifiëren (zie tabel 1).
   6. Herhaal vijf wasstappen met DI-water na de enkelvoudige PSS laagdepositie en resuspendeer de kralen in 650 ui 1 mM natriumfosfaatbuffer met 0,05% Tween 20 (15% w / v) vóór gebruik in de microfluïdische apparaat om de vloeibaarheid te verbeteren.
3. Volg de hierboven beschreven procedure van 1.2.5 tot 1.2.6 van 500 nm siliciumoxideparels met aminefunctionele groep een enkele laag van PSS deponeren.

2. Fabricage van de PDMS microfluïdische chip

1. Microfabricage van het silicium meester
   1. Fabriceren het silicium meester voor PDMS molding met behulp van microfabrication technieken als volgt.
      1. Spin coat een 1 micrometer dunne fotoresist bij 4.000 toeren per minuut op een silicium wafer. Patroon van de laag met behulp van projectie lithografie (belichtingstijd 170 msec.) En etsen 700 nm diep en 2 micrometer breed vlak nanokanalen (optredend als nanotraps voor de silica korrels) met reactieve ionen etsen.
      2. Gebruik de volgende ets parameters om een etssnelheid van 3,5 nm / s te bereiken: CHF ₃ (45 sccm), CF ₄ (15 sccm), Ar (100 sccm), druk 100 mTorr, RF-vermogen 200 W.
   2. Spin de vacht van de tweede 1 micrometer dikke fotoresistlaag bij 2.000 tpm en het uitvoeren van een aanpassing aan de eerder gevormde nanotraps. Patroon de microkanalen via contact lithografie en door diepe reactief ionen etsen (DRIE) van silicium. Gebruik de DRIE parameters ²⁶ in tabel 2.
2. Fabricage van PDMS schimmel
   1. Silaniseren het silicium master met trichloorsilaan (50 ui) in een vacuüm pot O / N.
      LET OP: Tricholorosilane is een giftige en bijtende materiaal. gebruik het altijd in een chemische kap met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.
   2. Meng de basis verharder in 10: 1 verhouding en gegoten PDMS op de gesilaniseerde silicium meester en genezen bij 70 ° C gedurende 2 uur in een convectieoven.
   3. Verwijder de PDMS plaat van het silicium master met een mes en plasma bond het op een lege wafer met een plasma cleaner na plasma behandeling in een plasma reiniger voor 1 min. Bevestig tapes langs de rand om een ​​partitie lijn voor de volgende PDMS casting stap te markeren.
   4. Silaniseren het PDMS schimmel in een vacuüm pot met trichloorsilaan (50 pl) O / N.
   5. Zet PDMS (basis: verharder bij 10: 1 verhouding) op de gesilaniseerde PDMS mal en genezen bij 70 ° C gedurende 2 uur in een convectieoven.
3. Fabricage van de PDMS apparaat
   1. Verwijder de uitgeharde PDMS plaat uit de PDMS mal langs de scheidingslijn gemarkeerd met de tape.
   2. Punch reservoir gaten met 1.5 mm biopsie punch, schoon met een tape, spoelen met isopropylalcohol (IPA) en droog met stikstof.
   3. Plasma bond de PDMS apparaat op een 25 mm x 75 mm microscoop glaasje na plasmabehandeling in een plasma reiniger voor 1 min.
4. Ultrasonicate de kraal suspensie 60 min. in een ultrasoonbad voor het vullen. Pipetteer 10 ul kralensuspensie (300 nm niet-gefunctionaliseerde silicaadvertenties of 500 nm siliciumoxide carboxyl kralen met PAH-PSS lagen of 500 nm siliciumoxide amine kralen met een PSS-laag) in de inlaten 4 en 6 elkaar (zie figuur 1 A, B) onmiddellijk na plasma hechting van de PDMS chip een glazen substraat. Tik zachtjes op de PDMS chip met een pipet tip om de kraal verpakking te verbeteren.
   1. Na het vullen van de kraal levering kanalen, hebben betrekking op alle inlaten met uitzondering van 1 en 9 met tape. Lucht-drogen gedurende 3 uur en bewaar bij 4 ° C vóór gebruik. Figuur 2 geeft een stap-voor-stap schema van de colloïdale zelfassemblage proces.

3. Experiment voor Elektrokinetisch Concentratie van DNA

1. Vul de reservoirs 3, 7 met een bufferoplossing (10 ui 1 mM PB) en reservoir 5 met een DNA-monster (10 pl 10 nM in 1 mM PB) en moet een lichte onderdruk met een omgekeerde pipetpunt op reservoirs 2 , 8 en 10 aan de kanalen met de oplossing gevuld zonder luchtbellen (zie Figuur 1B).
2. Voeg 10 ul van 1 mM PB reservoirs 2 en 8 en 10 pl 10 nM DNA naar reservoir 10 om de druk te herstellen en wacht 5 minuten. om evenwicht te bereiken.
3. Plaats de Pt draden in reservoirs 3, 5, 7, 10.
4. Toepassen spanning over de junctie nanofluidic via een spanningsdeler verbonden met een meter en Pt draden. Eerste toepassing 30 V op reservoirs 5, 10 en GND op reservoirs 3, 7.
5. Verlaag de spanning tot 25 V op reservoir 10 ~ na 30 sec.
6. Gebruik een mechanische sluiter met een periodieke opening in elke 5 s tot fotobleken van het monster te minimaliseren bij het opnemen van de fluorescentiesignalen van het DNA.

Resultaten

Een elektrokinetische concentrator chip PDMS dat een zelf-geassembleerde nanofluidic overgang tussen twee microkanalen bevat is getoond in Figuur 1A). Het kanaal in het midden van de inrichting wordt gevuld met een DNA monsteroplossing en geflankeerd door twee bufferoplossing kanalen aan weerszijden via een 50 urn breed bead afgiftekanaal (Figuur 1B). De silica colloïdale suspensie wordt gevlogen in de kraal levering kanaal onmiddellijk na plasma binding...

Discussie

Naar aanleiding van de gemeenschappelijke apparaat ontwerp-regeling te nanofluidics studeren, verzonnen we een nanofluidic kruising tussen twee microfluïdische kanalen met behulp van de verdamping gedreven zelfassemblage van colloïdale nanodeeltjes in plaats van lithografisch patroonvorming een array van nanokanalen. Bij uitstroming de colloïdale deeltjes in de kraal afgiftekanaal een array van nanotraps met een diepte van 700 nm en een breedte van 2 pm op beide zijden van de hiel afgiftekanaal bij een totale breedte va...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Poly(Styrenesulfonic Acid) Sodium Salt	Polysciences	08772
Poly(allylamine) Solution	Sigma Aldrich	479144-5G
Silica Microsphere - 300 nm	Polysciences	24321
Silica Microsphere - 500 nm	Polysciences	24323
Silica Microsphere Carboxyl Functional - 500 nm	Polysciences	24753
Silica Microsphere Amine Functional - 500 nm	Polysciences	24756
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit	Dow Corning
Trichlorosilane	Sigma Aldrich	175552
Ultrasonic Cleaner	Branson	3510
Tube Rotator	VWR	10136-084
Vortex Mixer	WiseMix	VM-10
Microcentrifuge	VWR	Micro 1207
Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-001-HP
PDMS Mixer	Thinky	ARE-250
Oven	Thermo Scientific	PR305220M
Epi-fluorescence Microscope	Nikon	Eclipse Ti
CCD Camera	Andor	Clara
Platinum Electrodes	Alfa Aesar	43014
Source Meter	Keithley	2400
Digital Multimeter	Extech	410
Microscopy Glass Slides	Thermo Scientific	2951-001
Tween 20	Merck Millipore	822184
Sodium chloride	Fisher Scientific	7646-14-5
Sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	71505
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S3264
DNA	IDT		CAA CCG ATG CCA CAT CAT TAG CTA C
B-Phycoerythrin	Life Technologies	P-800
Dynamic light scattering system for Zeta Potential Measurement	Malvern	Zetasizer Nano S
Photoresist	Shipley	SPR700-1.0
Projection lithography	Nikon	NSR2005i9
Reactive Ion Etcher	Applied Materials	AME P5000
ICP deep reactive ion etcher	STS	STS-6"
Contact lithography	Electronic Visions	EV620
Photoresist Coater Developer	SSI	SSI 150
Non-contact surface profiler	Wyko	NT 9800