Detecteren Cortex Fragmenten Tijdens Bacteriële Spore Kiemkracht

Samenvatting

Hier beschrijven we een colorimetrische test om de aanwezigheid van reducerende suikers te detecteren tijdens de kieming van bacteriële sporen.

Samenvatting

Het proces van endosporekieming in Clostridium difficile, en andere Clostridia, blijkt steeds meer af te wijken van het model van sporenvormende bacteriën, Bacillus subtilis. Keiming wordt geactiveerd door kleine molecuulkiemstoffen en vindt plaats zonder de noodzaak van macromoleculaire synthese. Hoewel er verschillen bestaan tussen de mechanismen van sporekieming in soorten van Bacillus en Clostridium, is een gemeenschappelijke vereiste de hydrolyse van de peptidoglycaan-achtige cortex die het sporekern laat zwellen en rehydrateren. Na rehydratatie kan het metabolisme beginnen en dit leidt uiteindelijk tot de uitgroei van een vegetatieve cel. De detectie van gehydrolyseerde cortexfragmenten tijdens sporekieming kan moeilijk zijn en de aanpassingen aan de eerder beschreven assays kunnen verwarrend of moeilijk te reproduceren zijn. Dus, gebaseerd op ons recente rapport met behulp van deze assay, beschrijven we een stapsgewijs protocol voor de colorimetrische detectie van cortexfragmenten tijdens bacteriële sporekieming.

Inleiding

Endospores metabolisch sluimerende vormen van bacteriën die het mogelijk maken bacteriën te volharden in ongunstige omgevingen. In veel sporenvormende bacteriën wordt spore vorming geïnduceerd door ontbering nutriënten maar dit proces kan worden geregeld door veranderingen in pH, blootstelling aan zuurstof of andere belastingen ^1. Terwijl in hun metabolisch slapende spore vorm, bacteriën verzetten tegen UV-straling, uitdroging, hogere temperaturen en bevriezing ^2. Het grootste deel van de kennis over de sporulatie proces komt uit studies in het model organisme, Bacillus subtilis. De sporulatie begint met DNA replicatie en de vorming van een axiaal filament ^3,4. Een asymmetrisch septum verdeelt vervolgens de cel in twee ongelijke grootte compartimenten. Hoe groter compartiment, de moeder cel, overspoelt de kleinere compartiment, de forespore. Zowel de moeder cel en forespore coördineren genexpressie aan de spore en de moeder cel uiteindelijk lyseert rijpen, het loslaten van de dormant spore deze in het milieu ^1.

De spore structuur en samenstelling is geconserveerd in vele soorten bacteriën. De spore kern heeft een lager watergehalte dan de vegetatieve cel en is rijk aan dipicolinezuur (DPA) ^1,2. Tijdens spore vorming, is DPA gepompt in de spore kern in ruil voor water. Rondom de kern is een innerlijke spore membraan, waar in de meeste sporenvormende bacteriën, de receptoren die de kleine moleculen die de kieming (germinants) te stimuleren te herkennen zijn gelegen op ^2. Gelegen net buiten binnenste membraan van de spore is een laag van celwand peptidoglycan. Een gespecialiseerde peptidoglycaanlaag (cortex) omgeeft de celwand peptidoglycan en bestaat uit veel van dezelfde componenten als celwand peptidoglycan [alternerende N-acetylglucosamine (NAG) en N-acetylmuraminezuur (NAM)]. Echter, circa 50% van de NAM residuen in de cortex omgezet naar muramic-δ-lactam ^5,6 . Tijdens sporevorming worden deze muramic-δ-lactam residuen die door de spore cortex lytische enzymen (SCLEs), waardoor de cortex worden afgebroken (een proces dat cruciaal is kieming voltooid), maar niet de celwand. Rondom de cortex is een buitenste membraan en verschillende lagen van manteleiwitten ^2.

Beheersing van het proces van kieming is van cruciaal belang voor de sporenvormende bacteriën. Kieming wordt gestart wanneer ontkiemende receptoren interageren met hun respectievelijke germinants ^2. In veel sporenvormende bacteriën die germinants zijn aminozuren, suikers, nucleotiden, ionen of combinaties daarvan ^2. C. difficile sporevorming wordt geïnitieerd door combinaties van bepaalde galzuren [bv taurocholinezuur (TA)] en aminozuren (bijvoorbeeld glycine) ^7-10. Hoewel er verschillen tussen de C. difficile kieming route en de paden bestudeerd in andere sporenvormendebacteriën, zoals B. subtilis, voor alle is de absolute vereiste om de spore cortex degraderen om een vegetatieve cel te groeien van de gekiemde spore ^2,8. Cortex afbraak kan door de SCLEs CwlJ / SleB (zoals in B. subtilis) of SLEC (zoals in veel Clostridia). Cortex hydrolyse reduceert de beperking op de celwand en spore. Dit maakt volledige kern rehydratatie, een noodzakelijke stap reactiveren veel van de eiwitten die nodig zijn voor cellulaire metabolisme ^2.

Wanneer sporen ontkiemen kan de slapende spore verandert van een fase-heldere toestand naar een geleidelijk donkere toestand en dit proces worden gemeten door een verandering van de optische dichtheid (OD) bij 600 ¹¹ nm. Een eerdere rapport suggereert dat veel van deze verandering in OD door het vrijkomen van DPA uit de spore ^12. Tijdens onze recente studie hebben we getracht de timing van C. vergelijken difficile spore kieming en bewaakt derelease van DPA en cortex fragmenten ^9. Voor deze studie was het kritisch om de vrijlating van cortex fragmenten controleren zij begon te worden vrijgegeven door sporen ontkiemen.

De colorimetrische bepaling hier was gebaseerd op een werkwijze voor het detecteren van suikers met reducerende uiteinden ontwikkeld Ghuysen et al. ^13. Omdat andere protocollen zijn beschreven voor de detectie van reducerende suikers of ¹⁴ hebben die protocollen ¹⁵ gewijzigd, kan de literatuur over dit onderwerp verwarrend. Hier hebben we detail een stap-voor-stap werkwijze voor de colorimetrische detectie van reducerende suikers vrijgemaakt ontkiemt C. difficile sporen. Hoewel deze studie maakt gebruik van C. difficile sporen, de reducerende suikers vrijkomt bij de kieming van sporen van andere sporenvormende bacteriën kunnen worden gedetecteerd met dit protocol ^9,16,17.

Protocol

1. Het genereren van Monsters

1. Heat activeren C. difficile sporen bij 65 ° C gedurende 30 min en op te slaan op ijs.
   Opmerking: C. difficile sporen kunnen worden geproduceerd en gezuiverd zoals eerder beschreven ^7,9,10.
2. Bereid de kieming oplossing X + 1 ml waarbij X het aantal te nemen monsters tijdens de test.
   Opmerking: De kieming oplossing is specifiek voor de soort bacteriën Spore bestudeerd. Voor het bepalen van C. difficile sporevorming, gebruikten we een oplossing van 10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 100 mM glycine en 10 mM taurocholinezuur in gedeïoniseerd water.
3. Voor aanvang van de test opneming van een 1,0 ml monster van de kieming oplossing zonder sporen om te dienen als een blanco voor cortex fragment detectie.
4. Sporen toevoegen aan een OD ₆₀₀ van 3,0 ~ de kieming oplossing en vortex snel.
   Opmerking: Voor onze kieming studies in B. subtilis, gebruikten we dezelfde OD ₆00 sporen als voor C. difficile.
   Let op: Deze hoeveelheid sporen werkte goed voor het toezicht op cortex fragment vrijkomen tijdens C. difficile spore kieming. De hoeveelheid sporen die in deze test moet proefondervindelijk worden bepaald voor elke bacterie of stam.
5. Verwijderen van een 1,2 ml monster onmiddellijk na toevoeging van de sporen en centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 1 min bij 14.000 x g. Dit is het tijdstip nul.
6. Transfer 1,0 ml van de supernatant van het gecentrifugeerde monster naar een nieuwe buis voor daaropvolgende cortex fragmentanalyse.
   Opmerking: Als DPA moeten worden gecontroleerd, verwijdert een aparte 100 gl monster voor de detectie van DPA in de oplossing gebruik van een test gebaseerd op terbium fluorescentie ^9,18,19.
7. Bevries de verzamelde monster bij -80 ° C.
8. Herhaal de stappen 1,4 en 1,5 op regelmatige afstanden totdat alle tijdstippen voltooid.
   Let op: Als gevolg van de tijd die nodig is voor centrifugeren en bemonstering, tijdstippen minder theen 2 min uit elkaar waren niet mogelijk tijdens onze procedure, zodat onze sampling intervallen waren eenmaal per 2 min gedurende 14 min.
9. Als een positieve controle op reducerende suikers detectie en kwantificering, de volgende hoeveelheden N-acetylglucosamine (nmol): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 en 5000. Bereid deze monsters tegelijk als cortex monsters en langs de cortex monsters zodat de standaardcurve gegenereerd door de kiemende sporen gegevens relevant is.
10. Immers tijdstip monsters worden verzameld, lyofiliseren de monsters.
    Let op: We gevriesdroogd onze monsters in 2 ml schroefdop buizen.

2. Het meten van Cortex Fragments

1. Resuspendeer gevriesdroogde monsters in 120 gl 3 N HCl gesupplementeerd met 1% fenol en 0,5% β-mercaptoethanol.
2. Breng de geresuspendeerde monsters tot 2 ml schroefdop buizen.
   Opmerking: Voor reproduceerbaarheid, zorgen voor al het gevriesdroogde monster wordt gesuspendeerd en overgebracht.
3. Incubeer de monsters in een recirculerend waterbad bij 95 ° C gedurende 4 uur.
4. Na incubatie, plaatst de monsters op ijs totdat ze zijn cool.
5. Neutraliseer de monsters met 120 ui 3 M NaOH.
6. Voeg 80 pl van een verzadigde natriumbicarbonaatoplossing en 80 pi van een 5% oplossing van azijnzuuranhydride aan elk monster en vortex.
7. Incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
8. Breng de monsters terug naar de 95 ° C waterbad gedurende precies 3 minuten.
   Opmerking: Deze stap is tijd gevoelig en langere tijden kunnen downstream signaal ontwikkeling beïnvloeden.
9. Verwijder monsters uit het waterbad en koelen op ijs.
10. Voeg 400 ul van 6,54% K ₂ B ₄ O ₇ · 4H ₂ O aan elke buis en vortex.
11. Incubeer de monsters in een recirculerend waterbad bij 95 ° C gedurende precies 7 min.
    Opmerking: Deze stap is tijd gevoelig en langere tijden kunnen downstream signaal ontwikkeling beïnvloeden.
12. Verwijderende monsters en plaats op ijs gedurende 5 minuten.

3. Kleur reagens

1. Terwijl de monsters op ijs (stap 2.12), de voorbereiding van de kleur reagens. Los op 0,320 g p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB; Ehrlich's reagens) in 1,9 ml ijsazijn.
   Opmerking: Het reagens, temperatuur en lichtgevoelig en moet niet van tevoren.
2. Na het DMAB volledig oplost, voeg 100 ul van 10 N HCl en vortex.
3. Voeg 5 ml ijsazijn en vortex.

4. colorimetrische reactie

1. Breng 100 pi van elk monster gekoeld cortex een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis.
2. Voeg 700 ul van vers bereide kleurenoplossing aan elk monster.
3. Geeft de monsters over te brengen naar een 37 ° C waterbad en incubeer gedurende precies 20 min.
4. Transfer 200 ul van elk monster een duidelijke 96-well plaat.
5. Kwantificeren van de monsters bij 585 nm op een bordlezer. De monsters moeten beginnen bij een gele kleur en een positieve reactie zal verschuiven naar paars. Hoe meer cortex aanwezig, hoe dieper de paarse kleur.

Resultaten

Tabel 1 toont typische resultaten met behulp NAG normen. De gegevens worden gebruikt om een standaardcurve te genereren. Tabel 2 toont typische resultaten van een assay kieming kieming buffer gesupplementeerd met 100 mM glycine en 10 mM TA (-kiemen bevorderen omstandigheden) of 100 mM glycine alleen (niet-kiemende omstandigheden). Aangezien TA, C. difficile sporen niet ontkiemen en er weinig verandering in de aanwezigheid van fragmenten cortex i...

Discussie

Bij stimulatie, sporen het kiemproces ondergaan verliezen hun resistentie eigenschappen zonder de noodzaak voor macromoleculaire synthese. Wanneer spore kieming wordt geactiveerd, de spore kern releases DPA in ruil voor water ^2. Door de hoge DPA gehalte van de slapende spore, de spore kern onder hoge osmotische druk en de gespecialiseerde peptidoglycaan, cortex, helpt voorkomen dat de kern van zwelling door zich vermoedelijk als een belemmering voor uitbreiding ^2.

De hi...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2.0 ml screw cap tube	USA scientific	1420-3700
p1000 Eppendorf pipet	Eppendorf
p200 Eppendorf pipet	Eppendorf
p20 Eppendorf pipet	Eppendorf
100 - 1,250 μl pipet tips	VWR	89079-486
1 - 200 μll pipet tips	VWR	89079-458
N-acetyl-D-glucosamine	Sigma	A3286-25G
Hydrochloric Acid - 10 N	BDH-Aristar	BDH3032-3.8LP
Acetic Anhydride	Alfa Aesar	L04295
Sodium Bicarbonate	BDH	BDH0280-500G
Potassium Tetraborate tetrahydrate	Alfa Aesar	39435
Sodium Hydroxide	BDH	BDH8019-500G
4-(Dimethylamino)benzaldehyde	Sigma	156477-100G
Saturated Phenol	Fisher	BP1750-400
2-Mercaptoethanol	Aldrich	M6250-100ML
SpectraMax M3	Molecular Devices
Acetic Acid, Glacial	BDH	BDH3098-3.8LP
Heated, Circulating Water Bath	VWR Scientific	Model 1136
Microtest 96	Falcon	353072	96 well clear tissue culture plates
Culture tubes	VWR	89000-506
Lyophilizer
Heat Blocks
Vortex Machine