Ontwikkeling van een Meercellige Driedimensionale Organotypische model van het menselijk darmslijmvlies geteeld onder Microgravity

Summary

Cellen groeien in een driedimensionale (3-D) milieu vormen een duidelijke verbetering ten opzichte celkweek in 2-D omgevingen (bijvoorbeeld kolven of schalen). Hier beschrijven we de ontwikkeling van een meercellige 3-D model van het organotypische menselijke darmslijmvlies gekweekt onder microzwaartekracht door roterende-wall-vat (RWV) bioreactoren.

Abstract

Omdat cellen groeien in een driedimensionale (3-D) omgeving hebben het potentieel om vele gaten van celkweek in 2-D omgevingen (bijv., Kolven of schalen) te overbruggen. In feite wordt algemeen erkend dat cellen gekweekt in kolven of schotels neiging te de-differentiëren en verliest speciale functies van het weefsel waarvan ze zijn afgeleid. Momenteel zijn er in hoofdzaak twee types van 3-D kweeksystemen waarbij de cellen worden gezaaid in steigers nabootsen van de natieve extracellulaire matrix (ECM): (a) statische modellen en (b) modellen met bioreactoren. De eerste doorbraak was de statische 3-D modellen. 3-D-modellen met bioreactoren zoals de draaiende-wall-vat (RWV) bioreactoren zijn een meer recente ontwikkeling. Het originele concept van de RWV bioreactoren ontwikkeld aan NASA Johnson Space Center in de vroege jaren 1990 en wordt beschouwd als de beperkingen van statische modellen overwinnen zoals de ontwikkeling van hypoxische, necrotische kernen. De RWV bioreactoren kunnen omzeilen this probleem op door vloeistofdynamica dat efficiënte diffusie van voedingsstoffen en zuurstof toe. Deze bioreactoren bestaan ​​uit een rotator basis die dient ter ondersteuning en draaien twee verschillende formaten kweekvaten die verschillen door hun beluchting brontype: (1) traagdraaiende Laterale Vessels (STLVs) met een coaxiaal oxygenator in het centrum, of (2 ) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) met zuurstof via een platte, siliconenrubber gas overdracht membraan. Deze schepen toelaten efficiënt gas overdracht terwijl het vermijden van de vorming van bubble en de daaruit voortvloeiende onrust. Deze omstandigheden leiden tot een laminaire stroming en minimale dwarskracht die modellen verminderde zwaartekracht (microzwaartekracht) in het kweekvat. Hier beschrijven we de ontwikkeling van een meercellige 3-D model van het organotypische menselijke darmslijmvlies uit een intestinale epitheliale cellijn en primaire humane lymfocyten, endotheelcellen en fibroblasten gekweekt onder microzwaartekracht door de RWV bioreactor. </ P>

Introduction

De eerste doorbraak in de opbouw van een 3-D model werd gemeld in het begin van 1980 Toen men verschillende types van de steiger (bijv., Laminine, collageen type I, collageen IV, en fibronectine) en cocktails van groeifactoren te verbeteren onderzoeken cel-tot-cel en ECM interacties van "statische" 3-D modellen ^1-7. Sindsdien is het grootste probleem van deze modellen zijn beperkingen bij de overdracht van voedingsstoffen en zuurstof in het medium en weefselconstructen ^8. In tegenstelling tot cellen in de in vivo omgeving met een constante stroom van voedingsstoffen en zuurstof uit aangrenzende netwerken van bloedvaten ontvangt....

Protocol

Ethiek statement: Alle bloedmonsters werden verzameld uit vrijwilligers die deelnamen aan protocol nummer HP-00.040.025-1. De Universiteit van Maryland Institutional Review Board goedkeuring van dit protocol en toestemming gegeven voor de inzameling van bloedmonsters van gezonde vrijwilligers voor de studies in dit manuscript. Het doel van deze studie werd uitgelegd aan vrijwilligers, en alle vrijwilligers gaven geïnformeerd ondertekende toestemming voor de bloedafname.

Opmerking: Zie tabel 1 voor middelgrote supplement voorbereiding. Zie tabel 2 voor de bereiding van de 3-D kweekmedia.

1. Voorbereiding....

Results

Eerder hebben we een meercellige 3-D model van het organotypische menselijke darmslijmvlies bestaat uit een intestinale epitheliale cellijn en primaire humane lymfocyten, endotheelcellen en fibroblasten gekweekt onder microzwaartekracht ²⁴ (figuur 1) ontworpen. Fibroblasten en endotheelcellen werden ingebed in een matrix collageen I verrijkt met extra darm kelder membraaneiwitten ⁴⁵ (bijv., Laminine, collageen IV, fibronectine en hepa.......

Discussion

In dit manuscript beschrijven we de ontwikkeling van een bioengineered model van het menselijke darmslijmvlies omvat veelvouden celtypen waaronder primaire humane lymfocyten, fibroblasten en endotheelcellen, alsook intestinale epitheliale cellijnen ^24. In deze 3-D-model, worden de cellen gekweekt in een collageen-rijke extracellulaire matrix onder microzwaartekracht omstandigheden ^24.

Zoals eerder beschreven, de belangrijkste kenmerken van dit model zijn: (i)

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor	Synthecon	RCCs-4DQ	For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available.
Disposable 50 ml-vessel	Synthecon	D-405	Box with 4 vessels
HCT-8 epithelial cells	ATCC	CCL-244
CCD-18Co Fibroblasts	ATCC	CRL-1459
Human Umbilical Vein Endothelial Cells	ATCC	CRL-1730	HUVEC
Fibroblast Growth Factor-Basic	Sigma	F0291	bFGF
Stem Cell Factor	Sigma	S7901	SCF
Hepatocyte Growth Factor	Sigma	H1404	HGF
Endothelin 3	Sigma	E9137
Laminin	Sigma	L2020	Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Vascular Endothelial Growth Factor	Sigma	V7259	VEGF
Leukemia Inhibitory Factor	Santa Cruz	sc-4377	(LIF
Adenine	Sigma	A2786
Insulin	Sigma	I-6634
3,3',5-triiodo-L-thyronine	Sigma	T-6397	T3
Cholera Toxin	Sigma	C-8052
Fibronectin	BD	354008	Isolated from human plasma
apo-Transferrin	Sigma	T-1147
Heparin	Sigma	H3149
Heparan sulfate  proteoglycan	Sigma	H4777	Isolated from basement membrane of mouse  Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Collagen IV	Sigma	C5533	Isolated from human placenta
Heat-inactivated fetal bovine serum	Invitrogen	10437-028
D-MEM, powder	Invitrogen	12800-017
10% formalin–PBS	Fisher Scientific	SF100-4
Bovine type I collagen	Invitrogen	A1064401
Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	MT25-052-CI
Sodium pyruvate	Invitrogen	11360-070
Gentamicin	Invitrogen	15750-060
Penicillin/streptomincin	Invitrogen	15140-122
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081
Hepes	Invitrogen	15630-080
Ham's F-12	Invitrogen	11765-054
Basal Medium Eagle	Invitrogen	21010-046	BME
RPMI-1640	Invitrogen	11875-093
Endothelial Basal Medium	Lonza	CC-3156	EBM-2
Endothelial cell growth supplement	Millipore	02-102	ECGS