Methodenartikel

Generatie Parabiotic zebravis embryo's door Surgical Fusion of Developing Blastulae

DOI:

10.3791/54168

⸱

11 juni 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology/Oncology, Boston Children’s Hospital, 2Harvard Medical School, 3Division of Hematology, Department of Medicine, Brigham and Women’s Hospital, 4Harvard Stem Cell Institute, 5Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology, 6Howard Hughes Medical Institute, 7Division of Hematologic Malignancies, Dana-Farber Cancer Institute

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol geeft stap-voor-stap instructies over hoe je parabiotische zebravis-embryo's van verschillende genetische achtergronden kunt genereren. In combinatie met de ongeëvenaarde beeldvormingscapaciteiten van het zebravis-embryo biedt deze methode een uniek krachtig middel om cel-autonome versus niet-cel-autonome functies voor kandidaat-genen van belang te onderzoeken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chirurgische parabiosis van twee dieren van verschillende genetische achtergronden creëert een unieke scenario naar cel-intrinsieke versus cell-extrinsieke rollen voor kandidaat-genen van belang, migrerende gedrag van cellen en uitgescheiden signalen in verschillende genetische instellingen te bestuderen. Omdat parabiotic dieren een gemeenschappelijke circulatie, zal geen bloed of bloed overdraagbare factor van het ene dier worden uitgewisseld met zijn partner en vice versa. Aldus kunnen cellen en moleculaire factoren afgeleid van één genetische achtergrond worden onderzocht in de context van een tweede genetische achtergrond. Parabiosis van volwassen muizen wordt veelvuldig gebruikt voor onderzoek veroudering, kanker, diabetes, obesitas, en hersenontwikkeling. Meer recent is parabiosis zebravis embryo gebruikt om de ontwikkelingsbiologie van hematopoiese bestuderen. In tegenstelling tot muizen, de transparantie van zebravisembryo's maakt de directe visualisatie van cellen in de context parabiotic, waardoor het een uniek krachtige methode voor het onderzoeken fundamental cellulaire en moleculaire mechanismen. De bruikbaarheid van deze techniek wordt echter beperkt door een steile leercurve voor het genereren van de parabiotic zebravisembryo's. Dit protocol wordt stap voor stap methode voor het operatief smelten de blastulae twee zebravis embryo's van verschillende genetische achtergronden van de rol van kandidaatgenen plaats onderzoeken. Bovendien, de parabiotic zebravis embryo tolerant hitteschok, waardoor temporele regulatie van genexpressie mogelijk. Deze methode vereist geen geavanceerde set-up en heeft brede toepassingen voor het bestuderen van celmigratie, het lot specificatie, en differentiatie in vivo tijdens de embryonale ontwikkeling.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oprichting van genetische mozaïeken (chimaera's) tussen wild-type en genetisch gemodificeerde dieren is een gevestigde en klassieke strategie voor het onderzoeken van cel-intrinsieke versus cell-extrinsieke functies van kandidaatgenen 1-6. Blastula transplantatie in zebravis is op grote schaal gebruikt om chimeer embryo voor studies van cel-autonome 7-9 genereren. Afhankelijk van het weefsel van belang, maar het kan lastig zijn om voorspelbaar richten donorcellen het gewenste weefsel (bijvoorbeeld bloed) 1-3, 7-9. Muis genetici hebben lang gebruikt parabiotic chirurgische methoden om samengevoegde organismen te genereren ....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol werd goedgekeurd door het ziekenhuis Animal Care en gebruik Comite van Boston Children's. Dit protocol is een modificatie van een eerder gepubliceerde werkwijze 15.

1. Bereiding van reagentia (dagen of weken op voorhand)

  1. Bereid 1,5% agarose-beklede schalen. Voeg 1,5 g agarose tot 100 ml zebravis E3 medium in een erlenmeyer. Warmte, ontbinding van de agarose, en giet dan ongeveer 5 ml in diameter van 100 mm x 20 mm diep petrischaaltjes.
    Opmerking: Deze worden gebruikt voor dechorionation embryo's (stap 3.1) en de parabiotic chirurgie (stap 3,3). WINKEL agarose-beklede schalen bij....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Consistent met eerder gepubliceerde studies 15, parabiotic succesvolle fusie van zebravisembryo's afhankelijk van de staging en oriëntatie van de twee embryo en de concentratie van methylcellulose. Met slechts een paar eenvoudige, goedkope instrumenten, chirurgisch gefuseerd ontwikkelen blastulae werden gegenereerd die uitgroeide tot parabiotic embryo's met gedeelde omloop. Deze instrumenten omvatten een gemodificeerd Pasteur pipet, een 10 ml pipet pomp en hout behande.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parabiotic fusie is een krachtig hulpmiddel om cellulaire functies van kandidaatgenen onderzoeken bij volwassen muizen modellen en kippenembryo's 10-14 geweest. Meer recent heeft een blastula fusiemethode beschreven voor het genereren van samengevoegde zebravisembryo's 15. In het huidige protocol, zijn video-based tutorials gebruikt om aan te tonen en een betere beschrijving van de methode voor het maken van parabiotic zebravis embryo's van verschillende genetische achtergronden om tijd.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Julie R. Perlin voor de nuttige opmerkingen over het manuscript. D.I.S. wordt ondersteund door subsidies van de American Society of Hematology, de Cooley's Anemia Foundation en de NIH (K01DK085217 en R03DK100672). E.J.H. is een Howard Hughes Medical Institute Fellow van de Helen Hay Whitney Foundation. B.L. is een Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow. B.W.B. wordt ondersteund door een Irvington Fellowship van het Cancer Research Institute en een Young Investigator Award van de Conquer Cancer Foundation of ASCO. L.I.Z. wordt ondersteund door subsidies van de NIH (R01CA103846, P01HL032262 en R01HL04880), de Taub Foundation for MDS Research, ....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Methyl celluloseSigmaM0387
Individuele componenten voor E3/HCR:Voor 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4
NaCl (Natriumchloride)Sigma-AldrichS9888
KCl (Kaliumchloride)Sigma-AldrichP9541
CaCl2 (Calciumchloride dihydraat)Sigma-Aldrich223506
MgSO4 (Magnesiumsulfaat heptahydraat)Sigma-Aldrich230391
Hepes (1M ) bufferoplossingThermoFisher15630-080
NaamBedrijfCatalogusnummer
Antibiotica:
Pen/Strepgibco by Life technologies15140-120
Ampicilline natriumzoutSigma Life ScienceA0166
Kanamycine sulfaat uit Streptomyces kanamyceticusSigma Life ScienceK1377
NaamBedrijfCatalogusnummer
50 mg/ml Pronase uit Streptomyces griseusRoche11459643001
Capillaire glazen gebruikt voor naalden (Capillary Glass & Filaments)Sutter InstrumentITEM#: BF 100-50-10
Priknaalden met houten handvattenFisher ScientificS07894
Glazen Pasteur-pipettenFisherbrand13-678-20A
10 ml pipetpompen (groen) (Pipette Pump Pipettor)Novatech InternationalF37898-0000
Kunststof petrischalen met een diameter van 100 mm / 20 mm diep (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, MET VENTILATIE,
ZWAAR ONTWERP, 15 STUKS/ZAK )		Greiner Bio-one664102
Dextran, Cascade Blue, 10.000 MW, anionisch, lysine fixeerbaarThermoFisherD-1976
PTU. werkconcentratie is 0,003% (50x is 0,15%). voor 500 ml, 0,75 g N-fenylthioureumSigma-AldrichP7629
Tricaine (poeder) (Tricaine methaansulfonaat, Tricaine-S)Western Chemical IncMS 222
LMP-agarose (Ultrapure LMP-agarose)Invitrogen16520100
Kunststof transferpipet (alleen de brede uiteinde vind ik)Fisherbrand137115AM
Glazen bodem 6-well platen gebruikt voor beeldvormingMatTekP06G1.5-20-F
Kunststof western gel laadtip vastgemaakt aan het uiteinde van een dissectienaald met houten handvat (GELoader tips)Eppendorf22351656
glasdeksels, dia's en vacuümvet als montage voor een rechtopstaande microscoop:
Vacuümvet ( Dow Corning® hoog vacuüm siliconenvet
kleurloos, gewicht 5,3 oz (buis) )		Dow CorningZ273554
GlaasdekselsCorning Life Sciences2960-244

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zon, L. I., Orkin, S. H. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
  2. Dzierzak, E., Speck, N. A. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Chirurgische fusie in het blastula stadiumparabiosis van zebravisembryo sontwikkelingsbiologie van de hematopo secelmigratiestudiesconfocale microscopie beeldvorminghittestuurgestuurde genexpressietransgene zebravisembryo spositionering van embryo s met methylcellulosehechten met glazen naalden

Gerelateerde artikelen