Primaire humane bronchiale epitheelcellen zijn moeilijk te transduceren. Dit protocol beschrijft de productie van lentivirussen en hun concentratie, evenals de optimale kweekcondities die nodig zijn om zeer efficiënte transductionen in deze cellen te bereiken tijdens differentiatie naar een pseudostratified epitheel.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Optimale Lentivirus Productie en Cultuur van de Cel voorwaarden die nodig zijn om succesvol te transduceren primaire humane bronchiale epitheelcellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In vitro kweek van primaire menselijke bronchiale epitheelcellen (HBE) cellen met lucht-vloeistof interfaces verschaft een bruikbaar model voor de processen van luchtwegen celdifferentiatie en functie te bestuderen. In de afgelopen jaren is het gebruik van lentivirale vectoren voor transgene levering werd een gangbare praktijk. Hoewel er meldingen van transductie van volledig gedifferentieerde epitheelcellen met bepaalde niet-HIV-pseudo-getypeerde lentivirussen, de algehele transductie efficiëntie is meestal minder dan 15%. Het protocol hier gepresenteerde een betrouwbare en efficiënte methode om lentivirussen produceren en primaire menselijke bronchiale epitheelcellen transduceren. Gebruik ongedifferentieerde bronchiale epitheelcellen, transductie in bronchiale epitheel groeimedia, terwijl de cellen hechten, met een multipliciteit van infectie factor 4 verschaft efficiëntie bijna 100%. Dit protocol beschrijft, stap voor stap, de bereiding en de concentratie snel titer lentivirale vectoren en the transductie proces. Het bespreekt de experimenten dat de optimale kweekomstandigheden vastbesloten om zeer efficiënte transductie van primaire menselijke bronchiale epitheelcellen te bereiken.
Inleiding
De ontwikkeling van replicatie-defecte, gepseudotypeerde lentivirussen (LV) voorziet onderzoekers met veilige en efficiënte methode om transgenen leveren in vitro 1. Vanwege hun lange-termijn expressie zouden deze LV ook worden gebruikt voor de afgifte van therapeutische middelen in vivo 2,3. De productie van LV vereist co-transfectie van menselijke embryonale nier (HEK) cellen met verschillende plasmiden: transfer vector, verpakking gag / pol, verpakking rev, en envelop vesiculaire stomatitis virus glycoproteïne (VSV-G) plasmiden. Derde generatie verpakkingssystemen geacht veiliger dan de tweede-generatie systemen, omdat het rev-gen wordt gecodeerd op een afzonderlijk inpak plasmide, waarbij de mogelijkheid van recombinatie tot een replicatie-competent lentivirus produceren verminderen. Hoewel de tweede generatie verpakkingssystemen op vijf maal hogere totale transductie eenheden, de splitsing van de oorspronkelijke virale genoom te creërende derde generatie systeem het niveau van transductie slechts minimaal 3,4 daalde.
Terwijl cellijnen makkelijker en efficiënter kunnen worden getransduceerd hebben onderzoekers hun focus primaire cellen verschoven, omdat deze representatiever in vivo weefsels 5,6. Echter, primaire cellen zijn ongevoelig voor transductie. Terwijl transductie van volledig gedifferentieerde epitheelcellen gemeld, is het totale rendement niet meer dan 15% 7.
hier beschreven is een protocol dat de productie van high-titer LVs maakt. Een stap-voor-stap benadering geschetst bijna 100% transductie in primaire HBE cellen bereiken. Meer specifiek protocol beschrijft de optimale kweekomstandigheden instrumentale slagen 3. In het kort worden HEK 293T-cellen getransfecteerd met de lentivirale expressievector pCDH de EF-1 promotor die expressie van versterkt groen fluorescenteiwit (eGFP) of mCherry, een rood fluorescerend eiwit, en een derde generatie verpakkingssysteem. LVs vrij in het medium worden verzameld 24 tot 72 uur later. De virusdeeltjes worden geconcentreerd met polyethyleenglycol (PEG), een gemakkelijke en eenvoudige methode van virale concentratie, voordat titer schatting met een p24 antigeen enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit. Vervolgens worden ongedifferentieerde primaire HBE cellen getransduceerd in proliferatiemedia (bronchiale epitheliale groeimedium of BEGM) 8, het vastmaken (na trypsine), bij een multipliciteit van infectie (MOI) factor 4, het toevoegen hexadimethrinebromide en incuberen gedurende 16 uur ( 's nachts). De cellen laat men daarna differentiëren. Aangezien het virale transgen tot expressie wordt gebracht op lange termijn (met de geschikte promoter, zie bespreking), zal expressie tijdens differentiatie worden gehandhaafd in een pseudo luchtwegepitheel of kan worden geïnduceerd (met een induceerbare promoter) na differentiatie.
Dit protocol is van groot belang voor onderzoekers die willen HBE primaire cellen gebruiken in plaats van cellijnen zijn en aan de andere moeilijk te transduceren celtypen kunnen zijn.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Fase 1: Culture of HEK 293T
- Bereid HEK cellen media (aangeduid als HEK media) door toevoeging van 10% (v / v) (v / v) foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine naar hoog glucose Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM).
- Coat een 10 cm weefselkweekplaat met collageen I. Mix 30 ul collageen I in 2 ml gedestilleerd water. Verspreid het mengsel op de schaal en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Verwijder het mengsel en laat de schotel drogen in een laminaire flowkast gedurende 15 minuten.
- Plaat HEK cellen op de gecoate schaal bij een dichtheid van 1 x 10 6 cellen in 10 ml HEK media en incuberen bij 37 ° C en 5% CO2.
- Wanneer HEK cellen 50-60% confluent (figuur 1a, 2-3 dagen na plating), ga dan naar fase 2. Visuele beoordeling van confluentie is voldoende. Geen kwantificatie nodig.
Opmerking: HEK cellen gekweekt in HEK media (zie hierboven). Wanneer ze confluentie bereiken, they kan worden gesplitst (bijvoorbeeld 1/5) of bevroren naar beneden voor later gebruik.
2. Fase 2: Productie en Concentratie van Lentivirussen (LVs) in HEK cellen
Opmerking: De protocollen moeten in overeenstemming met de institutionele en overheidsvoorschriften worden uitgevoerd onder BSL-2 + (enhanced BSL-2) omstandigheden in de Verenigde Staten.
- Transfecteren met een kalkafzetting procedure (lipofectamine en andere middelen transfectie niet zo efficiënt als de kalkafzetting procedure). Toepassing van een commerciële transfectie kit wordt aanbevolen om de reproduceerbaarheid te verzekeren, maar de procedure als volgt gewijzigd. Breng alle reagentia op kamertemperatuur. Dit is dag 0.
- Voor elke 10 cm schotel van HEK293 cellen, meng 4,5 ug envelop DNA pMD2-VSVG, 7,5 ug verpakking DNA pMDLg / pRRE, 3,75 ug DNA pRSV-rev, 10 ug DNA van lentivirale expressievector, 86 pi van een 2 M calcium-oplossing en steriel water in een 15 ml centrifugebuis een eindvolume van 700 gl(Deze laatste twee oplossingen worden in de commerciële transfectie kit).
- Druppelsgewijs, voeg 700 ul 2x HEPES gebufferde zoutoplossing (HBS, verschaft in de transfectie kit) terwijl vortexen (in de laminaire stroming kast) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten (stap 4 uitgevoerd tijdens het wachten).
- Tijdens het begin van de incubatietijd, stort 5 ul van de mix op een dia. Controleer de druppel onder een microscoop met een 10x objectief, gericht langzaam op en neer. Een fijn neerslag moet zichtbaar zijn, ter bevestiging van de calciumfosfaatprecipitatie werkwijze (figuur 1b).
- Stop de neerslag na 30 minuten door toevoeging van 10 ml van HEK cellen media en pipet op en neer om te mengen.
- Neem de schaal van HEK cellen uit stap 2,1-2,5, en verwijder het medium (dag 0). Voeg de oplossing uit stap precipitaat 2,5 voorzichtig en langzaam langs de rand van de schaal.
- Op de volgende dag (dag 1), te verwijderen en gooi het medium dat de neerslag en vervang deze wi 10 ml HEK medium. Controleer op de fijn neerslag onder de loep: het moet zichtbaar zijn in de schaal in lege ruimtes tussen de cellen (figuren 1c en d) zijn.
- Op dag 2, laat media met een spuit, filter door een 0,45 urn spuitfilter in een 15 ml centrifugebuis met 3,8 ml van een 40% polyethyleenglycol (PEG). Invertsuiker 5x te mengen en bewaar bij 4 ° C gedurende ten minste 24 uur (voor de PEG precipitaat te vormen, maar niet langer dan 5 dagen) totdat alle virus verzamelingen zijn voltooid.
- Herhaal stap 2.8 op dagen 3 en 4. Op dag 4 niet te vervangen door HEK medium maar te ontsmetten met 10% bleekmiddel en gooi de schotel.
- Centrifugeer de verzamelbuizen (gewoonlijk alle collecties samen op dag 5) bij 1650 xg gedurende 20 min bij 4 ° C om het virus pellet. Verwijder de supernatant en weer draaien bij 1650 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C voor het verzamelen en verwijderen van overgebleven PEG supernatant.
- RESUShang de pellet van elke buis in 200 ul van bronchiale epitheliale groeimedium (BEGM) zonder amfotericine B 8. bundelen hen en monster bij 200 pl. WINKEL virus bij -80 ° C. Aliquot een additionele 10 pi met de HIV-1 Gag (p24) antigeen ELISA analyse uit te voeren.
- Met behulp van een commerciële ELISA kit, voeren een p24 antigeen test volgens het protocol van de fabrikant. De test geeft een schatting van de virale p24 in pg / ml.
3. Fase 3: Cultuur Primair HBE Cells
- Plaat HBE cellen in 10 ml BEGM medium (met 100 gl amfotericine B als passage 0 cellen worden gebruikt om mogelijke verontreiniging te elimineren schimmel) bij een dichtheid van 1 x 10 6 cellen in een collageen I beklede 10 cm weefselkweekplaat. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2.
- Op de volgende dag, verwijder het medium en te vervangen door 10 ml BEGM (met 100 ul amfotericine B voor passage 0 cellen) voor een totaal van 4 dagen. Keer terug naar incubator.
- Na 4 days, gebruik dan alleen BEGM zonder amfotericine B. Change media om de andere dag.
- Wanneer cellen 80-90% confluent (Figuur 2a; ~ 7 dagen na plating), doorgaan met transductie (let op 3,5 voor de voorbereiding voordat transductie). Nogmaals, visuele beoordeling van confluentie volstaat. Geen kwantificatie nodig.
- Voorafgaand aan transductie, laag het permeabele ondersteuningsinbrengingen met een collageen IV 1/10 verdund met steriel gedestilleerd water. Voeg 200 ul aan elke insert en laten drogen 's nachts in de laminaire stroming kast.
4. Fase 4: Transductie van HBE Cells
- Verwijderen media, voeg 3 ml 0,1% trypsine in 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur in fosfaatgebufferde zoutoplossing (EDTA / PBS) en incubeer 5 min bij 37 ° C en 5% CO2. Controleer onder de microscoop (10X objectieve) om te zien of alle cellen worden losgemaakt. Zo niet terug naar de incubator gedurende nog 5 min.
- Als alle cellen zijn vrijstaand, voeg 3ml sojaboontrypsineremmer (SBTI 1 mg / ml), mengen en overbrengen naar een 15 ml centrifugebuis. Pellet de cellen door het draaien bij 460 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 3 ml BEGM en ga verder met het tellen.
- Resuspendeer HBE-cellen (nu passage 1 of P1) in een verhouding van 2 x 10 5 cellen per 12 mm een doorlaatbare drager insert in 400 gl BEGM (zie tabel 2). Extrapoleren deze cijfers zijn gebaseerd op de hoeveelheid doorlaatbare ondersteuningsinbrengingen die worden getransduceerd.
| Oppervlak | Oppervlakte | celgetal | Media | Volume (media) |
| 10 cm schaaltje | 52,7 cm 2 | 1 x 10 6 | BEGM | 10 ml |
| 12 mm filter | 1,13 cm 2 | 2 x 10 5 | BEGM | 400 gl |
| 24 mm filter | 4,52 cm 2 | 8 x 10 5 | BEGM | 800 pl |
Tabel 2: Media extrapolatie per celgetal.
- Met een multipliciteit van infectie (MOI) factor 4, voeg de juiste hoeveelheid virus aan de celsuspensie.
- Voeg hexadimethrinebromide een 2 ug / ml eindconcentratie.
- Verdeel 400 pi van het mengsel (BEGM, HBE cellen, virussen en hexadimethrinebromide) per doorlaatbare drager inzetstuk in het apicale compartiment en voeg 1 ml BEGM alleen het basolaterale compartiment. Incubeer overnacht bij 37 ° C en 5% CO 2. Altijd plaat HBE cellen zonder virus als controle en test puromycineselectie als toepasselijk.
- Op de volgende dag, remove apicale en basolaterale media, wassen met PBS, en beide compartimenten met air-vloeistof interface (ALI) media 8 vervangen.
- Wanneer de cellen confluent, verwijder apicale vloeistof (bekend als oprichting van een lucht-vloeistof interface). Ga door het veranderen van het medium (ALI) in het onderste compartiment om de andere dag, totdat zij volledige rijpheid te bereiken; gewoonlijk 3-4 weken later.
Opmerking: Als de lentivirale vector bevat een selectiegen zoals puromycine, kunnen cellen worden geselecteerd door toevoeging puromycine volgens een selectie concentratiecurve. Voor HBE cellen, heeft een concentratie van 1 ug / ml bepaald ideaal voor consistente selectie van getransduceerde cellen. Dit kan echter concentratie verschillen van andere cellen of voorwaarden en worden bepaald door het doden curves. Toevoeging van puromycine kan al één dag nadat het medium is vervangen door ALI media of hoger (2-3 dagen) om de volledige expressie van het selectiegen mogelijk. Zorg ervoor dat u puromycine toe te voegen aan een insert dat hzo niet getransduceerd. Puromycine kan worden toegevoegd totdat de cellen volledig zijn gedifferentieerd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 toont verschillende belangrijke stappen beoordelen cellen en oplossingen tijdens de transfectieproces. Figuur 1a toont de optimale samenvloeiing van HEK293T cellen voor transfectie voor virusproductie. Het is belangrijk dat de cellen gelijkmatig over de schotel zijn verdeeld. Figuur 1b toont het neerslag in een daling van de transfectie mengsel middels helderveld optiek en een 10X objectief. Naarmate de precipitaten eruit zandko...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het protocol hier geschetste verzekert bijna 100% transductie efficiëntie. Echter, er treden tijdens het proces van belang om dit doel te bereiken zijn. Bijvoorbeeld, tijdens het transfectieproces de aanwezigheid van neerslagen in de transductie mix (druppel) of in de schaal de dag na transductie (Figuren 1b en d) zijn zowel van toepassing voor goede transfectie. De afwezigheid van een neerslag of de aanwezigheid van agglomeraten kan te wijten zijn aan een weglaten van een van de transf...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken de Life Alliance Organ Recovery Agency van de Universiteit van Miami voor het verstrekken van de longen. Wij danken ook Dr. Lisa Künzi de DNA bereiding voor de in figuur 2B en 3-D, Dr. Ben Gerovac en Lisa Novak de mCherry virus gebruikt voor de experimenten in Figuren 3A tot C. experimenten Wij danken ook Gabriel Gaidosh uit de imaging faciliteit, afdeling Oogheelkunde aan de Universiteit van Miami.
Dit onderzoek is mede mogelijk gemaakt door subsidies van de NIH, de CF Foundation en de Flight Attendant Medical Research Institute aan Dr. Matthias Salathé.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| HEK293T/17 cellen | ATCC | CRL-11268 | |
| Foetaal bovien serum (FBS) | Sigma | 12306C | gebruik bij 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| Penicilline/Streptomycine (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | gebruik bij 1x |
| Collagene I | BD Biosciences | 354231 | verdun 1:75 in gedistilleerd water |
| Calphos | Clontech | 631312 | Transfectiekit met 2 M Calcium oplossing, 2x HEPES-gebufferde oplossing (HBS) en steriele H2O |
| Polyethyleenglycol 8000 | VWR scientific | 101108-210 | voorraad van 40% |
| Amphotericine B | Sigma | A9528 | gebruik bij 1x |
| Trypsine | Sigma | T4799 | |
| Sojaboon trypsine remmer | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12 mm | Corning | 3460 | |
| Collagene IV | Sigma | C7521 | verdun 1:10 in gedistilleerd water |
| Hexadimethrine broomide | Sigma | H9268 | voorraad van 2 mg/ml |
| Puromycine (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | gebruik bij 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | lentivirale expressievector |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | packaging DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | packaging DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | packaging DNA |
Referenties
- Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
- Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Jr Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors--design, biosafety, and production. Gene Ther. 12, 1089-1098 (2005).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnol. 13, (2013).
- Delenda, C. Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression. J Gene Med. 6 Suppl 1, S125-S138 (2004).
- Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Methods Mol Biol. 801, 65-74 (2012).
- Jordan, E. T., Collins, M., Terefe, J., Ugozzoli, L., Rubio, T. Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells. J Biomol Tech. 19, 328-334 (2008).
- Castillon, N., et al. Regeneration of a well-differentiated human airway surface epithelium by spheroid and lentivirus vector-transduced airway cells. J Gene Med. 6, 846-856 (2004).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. 107, 183-206 (2005).
- Gonzalez-Mariscal, L., et al. Role of calcium in tight junction formation between epithelial cells. Am J Physiol. 259, C978-C986 (1990).
- Bals, R., et al. Transduction of well-differentiated airway epithelium by recombinant adeno-associated virus is limited by vector entry. J Virol. 73, 6085-6088 (1999).
- Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17, 441-450 (2008).
- Davis, H. E., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 97, 159-172 (2002).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 341-347 (2013).
- Manzanares, D., et al. Functional apical large conductance, Ca2+-activated, and voltage-dependent K+ channels are required for maintenance of airway surface liquid volume. J Biol Chem. 286, 19830-19839 (2011).
- Schmid, A., et al. Real-time analysis of cAMP-mediated regulation of ciliary motility in single primary human airway epithelial cells. J Cell Sci. 119, 4176-4186 (2006).
- Unwalla, H. J., Ivonnet, P., Dennis, J. S., Conner, G. E., Salathe, M. Transforming growth factor-beta1 and cigarette smoke inhibit the ability of beta2-agonists to enhance epithelial permeability. Am J Respir Cell Mol Biol. 52, 65-74 (2015).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6, (2006).
- Schneiderman, S., Farber, J. L., Baserga, R. A simple method for decreasing the toxicity of polyethylene glycol in mammalian cell hybridization. Somatic Cell Genet. 5, 263-269 (1979).
- Schmid, A., et al. Soluble adenylyl cyclase is localized to cilia and contributes to ciliary beat frequency regulation via production of cAMP. J Gen Physiol. 130, 99-109 (2007).
- Manzanares, D., et al. Airway Surface Dehydration by Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) in Cystic Fibrosis Is Due to Decreased Function of a Voltage-dependent Potassium Channel and Can Be Rescued by the Drug Pirfenidone. J Biol Chem. 290, 25710-25716 (2015).
- Manzanares, D., et al. IFN-gamma-mediated reduction of large-conductance, Ca2+-activated, voltage-dependent K+ (BK) channel activity in airway epithelial cells leads to mucociliary dysfunction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L453-L462 (2014).
- Chen, X., et al. A soluble adenylyl cyclase form targets to axonemes and rescues beat regulation in soluble adenylyl cyclase knockout mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 51, 750-760 (2014).
- Ransford, G. A., et al. Pannexin 1 contributes to ATP release in airway epithelia. Am J Respir Cell Mol Biol. 41, 525-534 (2009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
