Methodenartikel

Karakteriseren Multiscale mechanische eigenschappen van hersenweefsel met behulp van Atomic Force Microscopy, Impact Inspringen en reometrie

DOI:

10.3791/54201

⸱

6 september 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Materials Science and Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 4Department of Neurology, The F.M. Kirby Neurobiology Center, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een reeks technieken om de visco-elastische mechanische eigenschappen van de hersenen te karakteriseren op micro-, meso- en macro-schalen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het ontwerpen en ingenieur materialen geïnspireerd op de eigenschappen van de hersenen, of mechanische simulant of voor weefselregeneratie studies moet het hersenweefsel zelf goed gekarakteriseerd in verschillende lengte- en tijdschalen. Zoals vele biologische weefsel, hersenweefsel vertoont een complexe, hiërarchische structuur. In tegenstelling tot de meeste andere weefsels, hersenen zeer lage mechanische stijfheid, met kleine elastische moduli E in de orde van 100s van Pa. Dit lage stijfheid uitdagingen te stellen karakterisatie van belangrijke mechanische eigenschappen. Hier tonen we verschillende mechanische karakterisatie technieken die zijn aangepast aan de elastische en viscoelastische eigenschappen van gehydrateerde, compliant biologische materialen zoals hersenweefsel op verschillende lengteschalen en beladingsgraad meten. Aan de microschaal, voeren wij kruip-compliance en kracht ontspanning experimenten met atomic force-microscoop ingeschakeld inspringen. Aan het MesosCale, voeren we invloed inspringen experimenten met behulp van een slinger op basis van geïnstrumenteerde indringlichaam. Aan de macroschaal, voeren wij parallelle plaat reometrie om de frequentie afhankelijke shear elasticiteitsmoduli kwantificeren. We bespreken ook de uitdagingen en beperkingen in verband met elke methode. Samen de technieken geeft een grondige mechanische karakterisatie van hersenweefsel die kunnen worden gebruikt om een ​​beter begrip van de structuur van de hersenen en bio ingenieur geïnspireerd materialen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De meeste zachte weefsels bestaande uit biologische organen zijn mechanisch en structureel complexe, van lage stijfheid in vergelijking met gemineraliseerd bot of gemanipuleerde materialen, en vertonen niet-lineaire en tijdsafhankelijke vervorming. In vergelijking met andere weefsels in het lichaam, hersenweefsel opmerkelijk overeenstemming met elastische moduli E in de orde van 100s van 1 Pa. Hersenweefsel vertoont structurele heterogeniteit met verschillende en in elkaar grijpende grijze en witte stof regio's die ook functioneel verschillen. Begrip hersenweefsel monteurs helpen bij de ontwikkeling van materiaal en rekenmodellen de reactie van de hersenen tijdens verwonding bootsen, voorspelling van mechanische schade te vergemakkelijken, en maken engineering van beschermende strategieën. Bovendien kunnen deze gegevens worden gebruikt om ontwerpdoelen voor weefselregeneratie te beschouwen en structurele veranderingen in hersenweefsel die worden geassocieerd met ziekten zoals multiple sclerose en autisme beter te begrijpen. Here, we beschrijven en demonstreren verschillende experimentele benaderingen die ter beschikking van de visco-elastische eigenschappen van mechanisch compliant weefsels, waaronder hersenweefsel te karakteriseren zijn, op micro-, meso- en macro-schaal.

Aan de microschaal, voerden we kruip-compliance en dwingen ontspanning experimenten met atomic force microscope (AFM) -enabled inspringen. Typisch wordt ingeschakeld AFM-indentatie gebruikt om de elastische modulus (of momentane stijfheid) van een monster 2-4 schatten. Echter, kan hetzelfde instrument ook gebruikt worden om microschaal visco-elastische (tijd- of rate-afhankelijk) eigenschappen 5-10 meten. Het principe van deze experimenten weergegeven in figuur 1, is een AFM vrijdragende sonde in het hersenweefsel inspringen, handhaven een bepaalde grootte van de kracht of indrukking diepte en de overeenkomstige veranderingen in inspringen diepte en kracht respectievelijk meten tijd. Met deze gegevens kunnen we de kruip comping berekenenLiance J C en ontspanning modulus G R, respectievelijk.

Voor deze mesoschaal, voerden we experimenten effect inkeping in vloeistof ondergedompeld omstandigheden die de weefselstructuur en hydratatie op peil te houden, met behulp van een slinger gebaseerde geïnstrumenteerde nanoindenter. De experimentele opstelling is weergegeven in figuur 2. Aangezien de slinger in aanraking met het weefsel, sondeverplaatsing wordt geregistreerd als functie van de tijd totdat de oscillerende slinger komt te rusten in het weefsel. Uit de resulterende gedempte harmonische oscillerende beweging van de sonde, kunnen we de maximale penetratiediepte xmax, energiedissipatie capaciteit K en dissipatie kwaliteitsfactor Q (dat betrekking heeft op de snelheid van energiedissipatie) van het weefsel 11,12 berekenen.

Voor deze macroschaal, gebruikten we een parallelle plaat rheometer de frequentieafhankelijke shear elastische moduli kwantificerenaangeduid als de opslagmodulus G 'en de verliesmodulus G ", van het weefsel. Bij dit type reometrie, berekenen we een harmonische hoekige stam (en overeenkomstige afschuifhoek) op bekende amplitudes en frequenties en meet de reactionele koppel (en bijbehorende shear stress) , zie figuur 3. uit de verkregen amplitude en faseverschuiving van het gemeten koppel en geometrische variabelen van het systeem, kunnen we berekenen G 'en G "bij toegepaste frequenties van belang 13,14.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ethiek Verklaring: Alle experimentele protocollen werden goedgekeurd door het Comité van Boston Children's Hospital Animal Research en voldoen aan de National Institutes of Health Guide voor de zorg en het gebruik van proefdieren.

1. Mouse Brain Tissue Acquisition Procedures (voor-AFM ingeschakeld inspringen en de impact inspringen)

  1. Bereid een ketamine / xylazine mengsel aan de muizen verdoven. Combineer 5 ml ketamine (500 mg / ml), 1 ml xylazine (20 mg / ml) en 7 ml 0,9% zoutoplossing.
  2. Injecteren muis (Ras: TSC1; Syn-Cre; plp-eGFP; Leeftijd: p21; Geslacht: Man of Vrouw) met 7 pi per gram lichaamsgewicht van de ketamine / xylazine oplossing.
  3. Zodra de muis is volledig verdoofd, zoals aangetoond door een gebrek aan respons tot teen en de staart knijpt, euthanaseren de muis door onthoofding met behulp van grote dissectie schaar.
  4. Verwijder de schedel door het kappen van het midden met behulp van kleinere dissectie schaar. Beginnend bij de kleine hersenen, remove stukken van de schedel met behulp van gebogen pincet. Na verwijdering van de schedel, verwijder de hersenen met behulp van een platte spatel om de hersenen te heffen, te beginnen bij het cerebellum en plaats de hersenen op een petrischaal. Verwijder het cerebellum van de hersenen met behulp van een scheermesje.
  5. Als u een hele brein voor invloed inspringen testen op verse weefsel, overdracht van de hersenen in een ronde bodem buis met CO 2-onafhankelijke voedingsbodem voor volwassen zenuwweefsel op ijs en ga verder met hoofdstuk 4. Anders ga verder met stap 1.6 voor het snijden van procedures.
  6. Pas de vibratome instellingen een snelheid van 0,7 mm / sec, een trilfrequentie van 70 Hz en een plakdikte van 350 urn. Omringen de vibratome gerecht met ijs. Plaats een schar van superlijm op de vibratome plaat en monteer de hersenen, zodat coronale plakken kan worden gesneden, met de hersenen gericht op eerst door de dorsale zijde snijden.
  7. Vul het vibratome schaal met voldoende Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) om alleen onderdompelen hersenen. verhogende schotel op de vibratome, zodat het blad is gewoon ondergedompeld in de DPBS.
  8. Druk op start om te beginnen met het snijden van coronale hersenen secties 350 micrometer dik.
  9. Penselen gebruikt om schade aan het weefsel te voorkomen, dragen de hersenen segmenten van de vibratome DPBS bad en een ronde bodem buis met CO 2-onafhankelijke voedingsbodem voor volwassen neuraal weefsel op ijs en voeren metingen aan vers weefsel in 48 uur. Om te beginnen-AFM ingeschakeld inspringen experimenten, ga dan naar hoofdstuk 3.

2. Pig Brain Tissue Acquisition Procedures (voor rheologie)

  1. Zorg voor een sagittally gesneden varkens half hersenen binnen ~ 1 uur van het offer van een plaatselijke slager. Leg de helft van de hersenen van de CO 2-onafhankelijke voedingsbodem voor volwassen zenuwweefsel, en op te slaan op het ijs.
  2. Gebruik een scheermesje of scalpel tot een ~ 5 mm dik coronale hersenen slice en opslaan van CO 2-onafhankelijke voedingsbodem te maken voor volwassen zenuwweefsel. Zorg ervoor dat de slice surface zo vlak mogelijk. Gebruik voorzichtig zijwaartse bewegingen met scheermes / scalpel tijdens het snijden.
  3. Store varken hersenweefsel van de CO 2-onafhankelijke voedingsbodem voor volwassen zenuwweefsel op ijs en het uitvoeren van metingen reometrie (deel 5) op verse weefsel binnen 48 uur.

3. Atomic Force Microscope-enabled Inspringen

  1. Bereid 60 mm diameter Petri (P60) gerechten met een mossel afgeleide bioadhesieve volgens de instructies van de fabrikant.
    1. Bereid een voorraad van neutrale bufferoplossing bestaande uit 0,1 M natriumbicarbonaat in steriel water met een optimale pH van 8,0. Filter-steriliseren (0,2 micron) natriumbicarbonaat buffer en bewaar bij 4 ° C.
    2. In een laminaire stroming kap, meng een oplossing van 6,25% mossel afgeleide bioadhesieve en 3,125% NaOH in natriumbicarbonaat buffer.
    3. Pipetteer 100 ul van de bio-hechtende oplossing van 3.1.2 op een 60 mm diameter Petri (P60) schaal en gebruik pipettip sol verspreidenution in een cirkel met een diameter 3-5 cm.
    4. Laat P60 gerechten ontdekt in laminaire stroming kap en laat oplossing droog (~ 30 min). Was de schotels 1x met PBS en 2x met steriel water. Laat gerechten drogen aan de lucht in laminaire stroming kap en op te slaan in een afgesloten plastic zak bij 4 ° C gedurende maximaal 1 maand.
  2. Kalibreren van de AFM en de set-up hersenen monster in de AFM.
    OPMERKING: Volg de AFM kalibratie-instructies volgens de fabrikant.
    1. Zorgvuldig laden van een AFM sonde met een nominale veerconstante van 0,03 N / m en 20 urn diameter borosilicaat kralen in de houder probe.
    2. Kalibreer de veerconstante en inverse optische hefboom gevoeligheid (InvOLS) van de AFM cantilever met behulp van de thermische tune methode 15,16.
      Opmerking: Als de veerconstante van een AFM sonde berekend moet constant blijven bij herhaald gebruik. Toch zal de cantilever InvOLS moeten worden gekalibreerd telkens wanneer de laser wordt uitgelijnd met de cantilever. Bovendien, kalibratiemoeten worden uitgevoerd op een substraat verschillende orde van grootte stijver dan de cantilever, zoals polystyreen.
    3. Schakel de fasen gemonteerde verwarming en ingestelde temperatuur op 37 ° C.
    4. Monteer de hersenen slice op de P60 gerechten bereid in paragraaf 3.1.
      1. Giet een 350 urn dikke plak hersenen, en de CO 2-onafhankelijke medium uit de rondbodemkolf een P60 schaal bekleed met de mossel afgeleide bioadhesieve.
      2. Door voorzichtig kantelen van de P60 schotel, plaats de hersenen segment in het midden van de schaal. Eventueel langzaam pipet medium van een handmatige pipet een slice hersenen die vouwen vertonen of beter de hersenen segment in het midden van de schaal ontvouwen.
      3. Haal al het papier met behulp van een P1000 pipet (niet de stofzuiger niet te gebruiken).
      4. Plaats de deksel op P60 schaal en laat de hersenen slice hechten gedurende 20 min.
    5. Verwijder de AFM hoofd, zet de hersenen slice gemonteerd in de P60schotel op het AFM podium, en voeg ~ 2 ml voorverwarmd CO 2-onafhankelijke medium.
    6. Voeg voorzichtig een druppel materiaal op de AFM sonde te beschermen tegen breken door oppervlaktespanning wanneer deze wordt neergelaten in de media rond de hersenen slice.
    7. De positie van de AFM hoofd op het podium, en beginnen met het verlagen van de kop tot hij wordt ondergedompeld in de media.
    8. Met behulp van de top-view CCD-camera, de positie van de laser op de cantilever.
      OPMERKING: De richting van de laser op de cantilever enigszins veranderd door het verschil in brekingsindex van lucht en medium.
    9. Wacht 5 min voor de cantilever aan te passen aan worden ondergedompeld in een warme vloeistof, moet u de spiegel aanpassing aan een gratis afbuiging van 0 V.
    10. Voer een thermische spectrum op de AFM probe volgens de instructies van de fabrikant 16. Gebruik de pasvorm van de eerste thermische piek te herberekenen InvOLS de AFM sonde in media.
    11. Met de optische microscoop,Beweeg de sample fase zodanig dat de hersenen regio van belang onder de AFM sonde.
      NB: Het corpus callosum wordt donker verschijnen als het is ondoorzichtiger dan de omringende grijze stof. De cortex is superieur aan het corpus callosum.
    12. Reset de spiegel aanpassing aan een gratis afbuiging van 0 V.
    13. Op de Sum en doorbuiging Meter in de AFM software, klikt u op "Engage" aan de AFM hoofd grijpen.
    14. Met behulp van de positie draaiknop op de AFM hoofd, laat de kop tot contact tussen de cantilever en sample wordt gemaakt.
  3. (Optioneel) Desgewenst meet de elastische modulus van het monster, zoals eerder beschreven 4,17,18.
  4. Gedrag kruip naleving experimenten.
    1. Construct een toegepaste kracht functie in de software-functie editor. De kracht functie bestaat uit een 0,1 sec oprit naar een setpoint van 5 nN en houd deze gedurende 20 seconden, gevolgd door een 1 sec helling naar beneden om een ​​uitgeoefende kracht van 0 NN.
      1. Op de Inspringen Master Panel, onder de inkeping methode, selecteer "Load" voor Indenter Mode; "N" voor units; en "Function editor" voor Indenter Function.
      2. In de functie editor op Segment Parms Panel, maak een toegepaste kracht functie segment dat begint bij 0 nN, eindigt bij 5 nN, met een tijd van 0,1 sec. Klik op "Insert ->".
      3. Voor het volgende segment, zet begin tot 5 NN, einde aan 5 NN, en de tijd tot 20 sec. Klik op 'Invoegen ->. "
      4. Voor het laatste segment, zet begin tot 5 NN, einde aan 0 NN, en de tijd tot 1 sec. Klik op "Tekenen" en sluit het venster Function Editor.
    2. Op de Force Tab van de Master Panel, vink "indringlichaam ramp na trigger" en stel de uitgeoefende kracht functie te activeren na het bereiken van een trigger punt van 0,1 V.
    3. Klik op "Single Force" op de bodem van de Force Tab van de Master Panel, die de geconstrueerde uitgeoefende kracht functie creep naleving zal leiden.
    4. Na deenkele kracht inspringen is voltooid, verhogen van de AFM hoofd, zodat het geen contact met het monster en vervolgens opnieuw grijpen de kop en re-zero gratis afbuiging.
    5. Verplaats het monster etappe naar een nieuw gebied van belang te vinden, en laat de AFM hoofd om contact te maken. LET OP: De AFM hoofd moet worden teruggetrokken uit het monster oppervlak wanneer het monster stadium wordt verplaatst. Doet u dit niet kan leiden tot schade aan de delicate AFM cantilever.
    6. Herhaal stappen 3.4.3-3.4.5 totdat de gewenste hoeveelheid data is verzameld.
  5. Gedrag kracht ontspanning experimenten.
    1. Construct een aangebrachte inkeping functie in de software uitgever functie. Het inspringen functie bestaat uit een 0,1 sec oprit naar een setpoint van 3 micrometer en houd deze gedurende 20 seconden, gevolgd door een 1 sec helling naar beneden om een ​​inkeping diepte van 0 micrometer.
      1. Op de Inspringen Master Panel, onder de inkeping methode, selecteer "Inspringen" voor Indenter Mode; "M" voor units; en "; Function editor "voor Indenter Function.
      2. In de functie editor op Segment Parms Panel, maak een toegepaste kracht functie segment dat begint bij 0 um, eindigt bij 3 urn, met een tijd van 0,1 sec. Klik op "Insert ->".
      3. Voor het volgende segment, zet begin tot 3 urn, einde aan 3 urn, en de tijd tot 20 sec. Klik op 'Invoegen ->. "
      4. Voor het laatste segment, zet begin tot 3 urn, einde aan 0 urn, en de tijd tot 1 sec. Klik op "Tekenen" en sluit het venster Function Editor.
    2. Op de Force Tab van de Master Panel, vink "indringlichaam ramp na trigger" en stel de uitgeoefende kracht functie te activeren na het bereiken van een trigger punt van 0,1 V.
    3. Klik op "Single Force" op de bodem van de Force Tab van de Master Panel, die de geconstrueerde toegepast inspringen functie kracht ontspanning zal leiden.
    4. Nadat het enkele kracht inspringen is voltooid, verhogen van de AFM hoofd, zodat hetuit contact met het monster en vervolgens opnieuw grijpen de kop en opnieuw neutrale stand.
    5. Verplaats het podium om een ​​nieuw gebied van belang te vinden, en laat het hoofd om contact te maken.
    6. Herhaal stap 5,3-5,5 totdat de gewenste hoeveelheid gegevens is verzameld.
  6. Concluderen experimenten en clean-up.
    1. Na het sluiten van experimenten, verhogen van de AFM hoofd en haal hem uit de steekproef.
    2. Gebruik een laboratorium tissue om overtollige vloeistof voorzichtig te verwijderen zonder het aanraken van de cantilever.
    3. Reinig de AFM cantilever houder met een kleine hoeveelheid ethanol. Heeft de gevoelige elektronica niet bloot op de cantilever houder ethanol. Verwijder de AFM cantilever en plaats in een opslagcontainer.
    4. Gooi het hersenweefsel monster door het volgen van de juiste bioveiligheid protocollen.
  7. Met behulp van MATLAB, berekenen kruip compliance en dwingen ontspanning moduli behulp indringlichaam geometrie, volgens de oplossing verkregen door Lee en Radok 1960 19.
    1. Bereken kracht F en inspringen diepte figure-protocol-1 van de gegevens over de positie z cantilever doorbuiging d en veerconstante, k c

      figure-protocol-2 en figure-protocol-3 .
    2. Zoek het contactpunt langs de inkeping curve met behulp van de in Lin et al. 20 beschreven algoritme.
    3. Definieer een venster van belang voor gegevensanalyse. Het venster van belang is het gebied waar ofwel kracht (kruip compliance) of inkeping diepte (voor force relaxatie) op een gewenste waarde blijft behouden (bijv Region 3 zoals getoond in Figuur 1C, D).
    4. Kruip naleving experimenten Bereken het experimentele kruip naleving modulus, J c (t), in reactie op een stapbelastingn 1 "src =" / files / ftp_upload / 54201 / 54201eq4.jpg "/>:
      figure-protocol-4 ,
      waarbij H (t) de Heavyside stapfunctie en R de straal van de bolvormige sonde.
    5. Voor werking ontspanning experimenten, bereken de experimentele kracht relaxatie modulus, G R (t), als reactie op een stap diepte inspringen figure-protocol-5 :
      figure-protocol-6 .

4. Impact Inspringen

  1. Kalibreer de geïnstrumenteerde nanoindenter en pas standaardinstellingen om dynamische effect experimenten op gehydrateerde hersenweefsel in staat volgens de instructies van de fabrikant.
    1. Monteer een sferische sonde door te schuiven naar de slinger met een pincet.
    2. Lijm een ​​gesmolten kwarts monster op het monster post, die wordt geschroefd in de translationelestadium.
    3. Ga naar het kalibratie menu en selecteer "Liquid Cell." Volg de instructies van de software om contact met het gesmolten kwarts monster te maken.
    4. Selecteer "Normal" voor de Indenter Type en gebruik de standaard waarde van 0,05 mN voor de Indenter Load. Klik op "Doorgaan" om de kalibratie uit te voeren voor de normale indringlichaam configuratie.
    5. Verplaats de monstertafel weer minstens 5 mm. Monteer de hefboomarm, waardoor de probe worden neergelaten in de cryostaat en herhaal de cryostaat calibratie in de nieuwe configuratie door "Liquid Cel" voor Indenter type. Klik op 'Doorgaan' om de Liquid Cell Calibration Factor te verkrijgen.
    6. Activeer de Liquid Cell software-optie door te gaan naar het menu Experiment en het selecteren van "Speciale opties." Gebruik de nieuwste kalibratie waarde.
    7. Verhoog de condensator plaatruimte wat zal leiden tot een grotere maximale meetbare diepte die nodig is bij het testen higHLY compliant materialen.
      1. Onder het menu Systeem, selecteer "Onbeveiligde Settings" en "Machine Parameters" om de slinger testbelasting tarief, nul belasting tarief, en standby-ramp te compenseren tot 0,5 mN / sec, 0,1 mN / sec, en 3 V, respectievelijk te wijzigen.
      2. Met een sleutel, draai de drie moeren dat de condensator plaatruimte de klok in kleine stappen te controleren.
      3. Na elke compleet met de klok mee beurt, selecteer "Bridge Box Adjustment" onder het menu Onderhoud en het verkrijgen van een goede slinger test, die vereist het verplaatsen van de contra-gewicht weg van de slinger.
      4. Herhaal stappen 4.1.7.2-4.1.7.3 totdat de geschatte diepte kalibratie leest een waarde van 70.000 nm / V of hoger.
    8. Plaats een nieuwe aanslag aan de onderzijde van de pendel die kan worden in- en uitgeschakeld via een voeding. Trek de oorspronkelijke aanslag zitten achter de slinger om een ​​mogelijke obstructie van de slingerbeweging te verwijderen en zorgen voor hogerebotsingssnelheden alsmede hogere penetratie diepte in conforme monsters.
    9. Laat het kabinet om thermisch evenwicht te bereiken (duurt ongeveer 1 uur).
    10. Terwijl het kabinet in evenwicht, ga terug naar het menu Systeem en selecteer "Onbeveiligde Settings" en "Machine Parameters." Stel de diepte kalibratie (DCAL) contact snelheid tot 1 pm / sec, de primaire inspringen contact snelheid tot 3 um / sec, en de ultra lage belasting contact snelheid tot 1 pm / sec.
    11. Onder de kalibratie menu, maakt u eerst een grondige kalibratie in deze nieuwe configuratie.
    12. Schakel de voeding voor de elektromagnetische en zet deze op 10 V. Ga naar het menu Experiment en selecteer "Impact" en "Adjust Impulse Displacement." Volg de software-instructies (automatische prompts) naar de swing afstand van de slinger te kalibreren.
  2. Monteer de muis hersenweefsel in de vloeistof cel.
    1. Na het oogsten van de hele hersenen van step 1.5, op te slaan onmiddellijk de CO 2-onafhankelijke voedingsbodem voor volwassen zenuwweefsel media op ijs.
    2. Wanneer het effect inspringing installatie volledig voltooid voorzichtig overdracht van de hersenen in een petrischaal met CO 2-onafhankelijke medium. Snijd de hersenen in het 6 mm dikke secties met platte oppervlakken aan beide zijden.
    3. Hechten de plakjes weefsel aan de aluminium monster post met een dun laagje cyanoacrylaat kleefmiddel.
    4. Schuif de vloeistof cel over de tweede O-ring op het monster post, en vul de vloeistof cel met 5 ml van de CO 2-onafhankelijke medium om het weefsel volledig onder te dompelen. Dit monster bericht wordt vervolgens zorgvuldig gemonteerd op de translationele podium in de geïnstrumenteerde nanoindenter.
  3. Meet het effect respons van het hersenweefsel.
    1. Verwijder indien nodig de sferische sonde en vervang deze door de sonde van belang zonder het verwijderen van de hefboomarm.
    2. Onder het menu Systeem, selecteer "OnbeveiligdeInstellingen "en" Machine Parameters. "Verander de primaire gevolgen contact snelheid tot 5 pm / sec.
    3. Met het monster bad lage (-z richting) en op afstand van de slinger (+ x-richting), beweegt in de -x richting tot de punt van de hefboomarm juist boven het bad is gelegen. Bewegen in de + z-richting totdat de punt volledig is ondergedompeld in het bad en voor het monster.
    4. Met de monstertafel besturingsvenster, maakcontact zorgvuldig en vervolgens terug de fase van het monsteroppervlak met ongeveer 30 urn.
    5. Onder het menu Experiment, klikt u op "Impact" voor het opzetten van een impact experiment. Kies een specifieke impuls belasting die rechtstreeks verband houden met de daaruit voortvloeiende botssnelheid op basis van de kalibratie swing afstand. Voer de geplande experiment.
    6. Wanneer de slinger terug en het monster oppervlak blijft om te verhuizen naar het meetvlak, draai de onderste aanslag uitschakeling.
    7. Let op als de slinger Doorzendoptiesard om de impact van het monster. De verplaatsing van de sonde als functie van de tijd wordt geregistreerd door de software.
    8. Wanneer het xyz podium verschijnt, zet u de aanslag weer aan.
    9. Herhaal stap 3,4-3,8 zoveel mogelijk verschillende ladingen en locaties testen als nodig.
  4. Analyseer de verworven verplaatsing tegen de tijd respons van de slinger met behulp van aangepaste MATLAB scripts om de maximale penetratie diepte x max, energiedissipatie capaciteit K, en dissipatie Q-factor te bepalen. 11
    1. Ga naar het menu Analyse en de gegevens te exporteren in een tekstbestand.
    2. Neem de tijdsafgeleide van de verplaatsing profiel snelheid als functie van de tijd te verkrijgen. Stel nul verplaatsing als aanspreekpunt x o1.
      OPMERKING: Impact snelheid v in de maximale snelheid onmiddellijk voorafgaand aan contact xmax overeenkomt met de vervorming waarbij de probe.snelheid daalt eerst tot nul. x O2, wat overeenkomt met x r, is de gewenste positie om contact met de vervormde monster in de volgende cyclus hervatten. Rebound snelheid v out is de snelheid verplaatsing x r.
    3. Definieer K (unitless) de afgevoerde energieniveau van het monster genormaliseerd door de som van de teruggewonnen en afgevoerd monster energie tijdens de eerste slag cyclus. Bereken K gebaseerd op de intrinsieke eigenschappen van de slinger 21 (zoals rotatie stijfheid en demping), o1 x, x max, x r, vin en VOUT.
      . OPMERKING: Voor meer informatie kan men het werk van Kalcioglu et al, 2011 te raadplegen.
    4. Omdat verplaatsing kan worden omschreven als een gedempte harmonische oscillerende beweging, past een exponentiële verval functie om de maxima van de displaatsing versus tijd curve.
    5. Bereken Q (unitless) zoals π vermenigvuldigd met het aantal cycli dat nodig is voor de oscillatie amplitude afneemt met een factor e. Een hogere Q-waarde betekent een lagere energierekening dissipatievermogen.

5. Reologie

  1. Opzet en kalibreer de reometer volgens de instructies van de fabrikant.
    1. Initialiseer de reometer door het openen van het apparaat / bedieningspaneel. Op het tabblad control panel, klikt u op "initialiseren."
    2. Monteer de 25 mm diameter meting plaat (PP25) en het thermisch systeem.
    3. (Optioneel) Als u slip tussen rheometer platen en het weefsel te verminderen, uitgesneden lijm schuurpapier schijfjes die overeenkomen met de vorm van de bovenste plaat rheometer en houden het schuurpapier om de bovenste en onderste plaat.
    4. Maak contact tussen de bovenste en onderste plaat door te klikken op "set zero gap" op het bedieningspaneel.
    5. Nul de normale krachtopnemer door clicking "reset normale kracht."
    6. Uitvoeren van een inertie-test door het openen van het tabblad Service op het bedieningspaneel, te klikken op "meetsysteem," en vervolgens op "inertie test". Noteer de oude en de nieuwe inertie. Controleer of de traagheid binnen het toegestane limiet voor de probe, zoals vermeld door de fabrikant.
  2. monster lading in rheometer.
    1. Na het oogsten van het weefsel en het snijden van een coronale deel van het varken hersenen om dikte ~ 5 mm, op te slaan op het ijs van de CO 2-onafhankelijke medium.
    2. Plaats de hersenen tussen de twee platen. Verwijder grote waterdruppels van de bovenste en onderste oppervlak van het monster om slippen te voorkomen, maar niet uitdrogen van de steekproef.
    3. Sluit langzaam de meetplaat tot de plaat volledig in contact met het bovenoppervlak van het weefsel en de gemeten normaalkracht consistent 0.01 mN na 5-10 min ontspanningsperiode.
      1. In het configuratiescherm, voert u achtereenvolgens lagere hoogten in de meting positie en klik op "meetpositie" om langzaam de meting plaat.
      2. Wanneer binnen een millimeter van contact met het weefsel, laat de meetplaat in stappen van 0,1 mm tot de plaat volledig in contact met het bovenoppervlak van het weefsel. Zorg ervoor dat de gemeten-normale werking is constant op 0,01 mN na een 5-10 min ontspanning periode.
      3. Noteer het aanvankelijke gemeten normale kracht. Herhaalde metingen moeten worden genomen op hetzelfde drukspanningen / stammen.
    4. Knip het monster met een plastic blad indien het monster de diameter van de plaat boven. Pipetteer een klein volume (~ 1-2 ml) van medium aan de randen van het monster om het weefsel te hydrateren.
    5. (Optioneel) Laat de thermische kap. Op het bedieningspaneel, de temperatuur tot 37 ° C en klik op "set".
  3. Voer een amplitude sweep aan de lineaire visco-elastische gebied van het materiaal (dat wil zeggen, de shear vaststammen waarbij G 'en G' 'constant) bij een frequentie van belang (bijvoorbeeld 1 rad / sec).
    1. Selecteer "file / new". Onder de tab gel selecteer "Amplitude sweep: LVE-range." Selecteer venster en klik op "Meting 1:. Amplitude sweep" Dubbelklik op de oscillatie vak. Voer de begin- en eindwaarden stam (bijvoorbeeld 0,01 tot 105), de frequentie (bijvoorbeeld 1 rad / sec) en het aantal punten per decade (bijvoorbeeld 6 punten / ontleding). Selecteer "OK" en klik op te starten. "
    2. Herhaal deze procedure voor een aantal segmenten met herhaalde proeven om consistentie van het lineair elastische bereik te garanderen. De axiale samendrukking van het monster moet constant tussen de monsters blijven.
  4. Voer een frequentiezwaai van het weefsel op een rek in het lineaire visco-elastische bereik van het weefsel (bijvoorbeeld 1% rek) 22, en een frequentiebereik van belang (bijvoorbeeld 0,1-100 rad / sec).
    1. Klik "File / new" en onder het tabblad gel selecteer "Frequency vegen." Klik op venster / Meting 1: Frequentie sweep. Dubbelklik op de oscillatie vak. Voer de frequentie bereik (0,1 tot 100 rad / sec), de stam (bijvoorbeeld 1% rek) en het aantal punten per decade (bijvoorbeeld 6 punten / ontleding). Selecteer "OK" en klik op "start" om de frequentie sweep te starten.
  5. Herhaal frequentie sweep (stap 5.4) in duplo of drievoud.
  6. Bekijk de gegevens die automatisch worden berekend en door de rheometer uitgevoerd: G 'en G "als functie van de frequentie (frequentie sweep) of afschuifspanning (amplitude sweep). OPMERKING: G' en G '' worden berekend uit (maximaal het monster ) reactionele torque amplitude T '0 en rotatieverplaatsing hoek (of afbuighoek) figure-protocol-7 En faseverschuivingVergelijking 1 "src =" / files / ftp_upload / 54.201 / 54201eq9.jpg "/>, of reactie van het monster op het toegepaste oscillerende stam (Figuur 3):
    figure-protocol-8
    figure-protocol-9
    waarin R en h de straal en hoogte van het monster.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 4 toont representatieve inkeping en kracht versus tijd responsen (figuur 4B, E) kruip compliance en dwingen relaxatie experimenten, aangezien een uitgeoefende kracht of indrukking diepte (figuur 4A, D), respectievelijk. Met deze gegevens en de geometrie van het systeem, kan de kruip naleving J c (t) en dwingen ontspanning moduli G R (t) worden berekend voor verschillende gebieden van de hers...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elke techniek in dit document meet verschillende facetten van de mechanische eigenschappen hersenweefsel's. Creep naleving en stress ontspanning moduli zijn een maat voor tijdsafhankelijke mechanische eigenschappen. De opslag en verliesrekening moduli vertegenwoordigen rate-afhankelijke mechanische eigenschappen. Impact inspringen meet ook snelheid-mechanische eigenschappen, maar in de context van energie dissipatie. Bij het karakteriseren van weefsel mechanische eigenschappen, zijn beide AFM-enabled inspringen en r...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We erkennen de steun van dit werk door de National Multiple Sclerosis Society en Simons Center for the Social Brain. BQ erkent steun van het U.S. National Defense Science & Engineering Graduate Fellowship programma.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
XylazineLloyd Laboratoriedvoorschrift geneesmiddel
KetamineAnaSed Injectionsvoorschrift geneesmiddel
Vibratome (Vibrating blade microtome)LeicaVT1200
Hibernate-A MediumGibcoA1247501CO2-onafhankelijk zenuwmedium voor volwassen weefsel
Atomic Force Microscope, MFP-3D-BIOAsylum Research-
Petri Dish HeaterAsylum Research-
AFM Probe, 0.03 N/m, 10 µm radius borosilicate sphereNovascanPT.GS
Cell-TakCorning354240uit schelpen afgeleid bio-adhesief
Sodium BicarbonateSigma-AldrichS5761alternatieve leveranciers kunnen worden gebruikt
Sodium Hydroxide, 1 NSigma-Aldrich59223Calternatieve leveranciers kunnen worden gebruikt
Instrumented Indenter, NanoTest VantageMicro Materials Ltd.-sondetip moet worden gemaakt (stalen platte pons, 1 mm diameter, 4-5 mm lengte)
NanoTest Liquid CellMicro Materials Ltd.-
Parallel Plate Rheometer MCR501Anton-Parr-
PP25 Anton-Parr-platte meetplaat met een diameter van 25 mm
Adhesive SandpaperMcMaster-Carr4184A48alternatieve leveranciers kunnen worden gebruikt
Loctite 4013 Instant AdhesiveHenkel20268alternatieve leveranciers kunnen worden gebruikt

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van Dommelen, J. A. W., Hrapko, M., Peters, G. W. M. Mechanical Properties of Brain Tissue: Characterisation and Constitutive Modelling. Mechanosensitivity of the Nervous System. , 249-281 (2009).
  2. Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (54), e2911(2011).
  3. Peaucelle, A. AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317(2014).
  4. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497(2013).
  5. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. dM., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21, 445101(2010).
  6. Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. Creep function of a single living cell. Biophysical Journal. 88 (3), 2224-2233 (2005).
  7. Lu, H., Wang, B., Ma, J., Huang, G., Viswanathan, H. Measurement of creep compliance of solid polymers by nanoindentation. Mechanics Time-Dependent Materials. 7 (3/4), 189-207 (2003).
  8. Cheng, L., Xia, X., Scriven, L. E., Gerberich, W. W. Spherical-tip indentation of viscoelastic material. Mechanics of Materials. 37, 213-226 (2005).
  9. Kalcioglu, Z., Qu, M., Van Vliet, Multiscale characterization of relaxation times of tissue surrogate gels and soft tissues. 7th Army Science Conference Proceedings. , (2010).
  10. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. D., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation microscopy: Imaging local stress in cells. Journal of Biomechanics. 43 (2), 349-354 (2010).
  11. Kalcioglu, Z. I., Qu, M., et al. Dynamic impact indentation of hydrated biological tissues and tissue surrogate gels. Philosophical Magazine. 91 (7-9), 1339-1355 (2011).
  12. Kalcioglu, Z. I., Ra Mrozek, R. a, Mahmoodian, R., VanLandingham, M. R., Lenhart, J. L., Van Vliet, K. J. Tunable mechanical behavior of synthetic organogels as biofidelic tissue simulants. Journal of Biomechanics. 46 (9), 1583-1591 (2013).
  13. Janmey, P. A., Georges, P. C., Hvidt, S. Basic rheology for biologists. Methods in Cell Biology. 83, 3-27 (2007).
  14. Miller, K., Kurtcuoglu, V. Biomechanics of the Brain. , Springer Science & Business Media. (2011).
  15. Lévy, R., Maaloum, M. Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods. Nanotechnology. 13 (1), 33-37 (2002).
  16. Fuierer, R. Basic Operation Procedures for the Asylum Research MFP-3D Atomic Force Microscope. MFP-3D Procedureal Operation "Manualette". , Asylum Research. (2006).
  17. Elkin, B. S., Ilankovan, A., Morrison, B. Age-dependent regional mechanical properties of the rat hippocampus and cortex. Journal of Biomechanical Engineering. 132, 011010(2010).
  18. Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation. Journal of Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).
  19. Lee, E. H., Radok, J. R. M. The Contact Problem for Visooelastic Bodies. Journal of Applied Mechanics. 27 (3), 438-444 (1960).
  20. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
  21. Constantinides, G., Kalcioglu, Z. I., McFarland, M., Smith, J. F., Van Vliet, K. J. Probing mechanical properties of fully hydrated gels and biological tissues. Journal of Biomechanics. 41 (15), 3285-3289 (2008).
  22. Shen, F., Tay, T. E., et al. Modified Bilston Nonlinear Viscoelastic Model for Finite Element Head Injury Studies. Journal of Biomechanical Engineering -- Transactions of the ASME. 128 (5), 797-801 (2006).
  23. van Dommelen, J. aW., vander Sande, T. P. J., Hrapko, M., Peters, G. W. M. Mechanical properties of brain tissue by indentation: Interregional variation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 3 (2), 158-166 (2010).
  24. Rother, J., Nöding, H., Mey, I., Janshoff, A. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open biology. 4 (5), 140046(2014).
  25. Du, P., Lu, H., Zhang, X. Measuring the Young's Relaxation Modulus of PDMS Using Stress Relaxation Nanoindentation. Symposium DD - Microelectromechanical Systems - Materials and Devices III. 1222 (c), (2009).
  26. Elkin, B. S., Morrison, B. Viscoelastic properties of the P17 and adult rat brain from indentation in the coronal plane. Journal of Biomechanical Engineering. 135, 114507(2013).
  27. Brands, D. W., Bovendeerd, P. H., Peters, G. W., Wismans, J. S., Paas, M. H., van Bree, J. L. Comparison of the dynamic behavior of brain tissue and two model materials. 43rd Stapp Car Crash Conference Proceedings. , 313-320 (1999).
  28. Hrapko, M., van Dommelen, J. A. W., Peters, G. W. M., Wismans, J. S. H. M. Characterisation of the mechanical behaviour of brain tissue in compression and shear. Biorheology. 45 (6), 663-676 (2008).
  29. Pogoda, K., Chin, L., et al. Compression stiffening of brain and its effect on mechanosensing by glioma cells. New Journal of Physics. 16 (7), 075002(2014).
  30. Peters, G. W. M., Meulman, J. H., Sauren, A. A. H. J. The applicability of the time/temperature superposition principle to brain tissue. Biorheology. 34 (2), 127-138 (1997).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Brain Tissue CharacterizationAtomic Force MicroscopyImpact IndentationRheometryViscoelastic PropertiesMechanical CharacterizationCreep ComplianceForce RelaxationFrequency SweepHydrated Tissue

Gerelateerde artikelen