Deze stroom adhesietest een eenvoudige, high impact model van T-cel-epitheliale cel interacties. Een spuitpomp gebruikt om afschuifspanning te genereren en confocale microscopie neemt beelden voor kwantificering. Het doel van deze studies is om effectief te kwantificeren T-cel adhesie met behulp van stroom omstandigheden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Assay van Adhesie Under Shear Stress voor de Studie van T-lymfocyten-Adhesie Molecule Interacties
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Overall, T-cel adhesie is een kritische component van functie bijdraagt aan de verschillende processen van cellulaire rekrutering op plaatsen van ontsteking en interactie met antigeen presenterende cellen (APC) bij de vorming van immunologische synapsen. Deze twee contexten van T cel adhesie verschil is dat T-cel-interacties APC kan statisch worden beschouwd, terwijl T-cel-interacties bloedvat worden geconfronteerd met de schuifspanning die door circulatie zelf. T-cel-interacties APC worden geclassificeerd als statisch, dat de twee mobiele partners statisch ten opzichte van elkaar. Meestal deze interactie plaatsvindt binnen de lymfeklieren. Als een T-cel interageert met de wand van het bloedvat, de cellen te arresteren en moet de gegenereerde shear stress te weerstaan. 1,2 Deze verschillen onderstrepen de noodzaak om beter te begrijpen statische hechting en hechting onder stroom voorwaarden als twee afzonderlijke wettelijke processen. De regulering van T-cel-adhesie kunnen de meeste bondig worden omschreven als controlling de affiniteitstoestand integrine moleculen tot expressie gebracht op het celoppervlak, en daardoor de interactie van integrinen met het adhesiemolecuul liganden op het oppervlak van de interagerende cellen reguleren. Onze huidige kennis van de regulatie van integrine affiniteit staten komt uit vaak simplistisch in vitro modelsystemen. De bepaling van adhesie middels stroming hier beschreven omstandigheden maakt de visualisatie en kwantificatie van T-cel-epitheliale cel interacties in real time volgen van een stimulus. Een hechting onder stroom test kan worden toegepast op studies van hechting signalering in T-cellen na behandeling met remmende of stimulerende stoffen. Bovendien kan deze test worden uitgebreid buiten T-cel signalering naar elke lijm leukocyten bevolking en eventuele integrine-adhesie molecuul pair.
Inleiding
T lymfocyt adhesie medieert een aantal verschillende werkwijzen in een gezond immuunsysteem, 3 cruciale rol spelen in T celtransport en antigeenpresentatie. Of tijdens immune surveillance of een actieve immuunreactie beide brede rollen voor hechting kritisch. 4 Fysiologische signalering gebeurtenissen van T-cel-endotheelcelinteracties verschillen van T-cel-antigeen-presenterende cel (APC) interacties en vereisen daarom verschillende methodes studie om het best begrijpen de signalering cascades betrokken. De firma hechting van een T-cel naar een wand van het bloedvat tijdens lymfocyten extravasatie vereist een snelle en dynamische integrine activering. De nauwe interactie tussen een actieve toestand integrine en adhesiemoleculen aan het endotheel leidt tot hechting bestand tegen de bloedstroom, waardoor T-cellen te kruipen langs het oppervlak, op zoek naar een gebied permissief celpassage. 5 het doorzoeken van een T-cel bi -directionally alonga bloedvatwand is aangewezen op gepolariseerd hechting en is uitdrukkelijk kleefstof vooreinde van de T-cel. 6 Belangrijker, stevige adhesie en transmigratie bestand moeten zijn tegen de afschuifkracht opgewekt door circulerende bloedstroom.
Bij het ontwerpen van experimenten om lymfocyt adhesie studeren, moet aandacht worden besteed aan de specifieke stimulus van belang. Terwijl integrine activering een gemeenschappelijke en essentieel onderdeel van alle vormen van T-cel adhesie, de stromen van activering waarschijnlijk unieke stroomafwaarts van individuele receptoren en co-receptoren zijn. Evenzo, en integrine adhesiemoleculen paren functioneren in gespecialiseerde micro-omgevingen en specifieke subpopulaties. Zo kunnen deze paren heel verschillend geregeld. De hier gepresenteerde model is ideaal voor de studie van signalering cascades leidt aan integrine activering plaatsvindt onder schuifspanning omstandigheden. 7 Deze interacties kunnen niet adequaat worden opgevat in een statische lijm,betreffende systeem door het effect van deze krachten bleek direct bij hebben op T-cel gedrag. 8 Hoewel hier voorgesteld met T-cellen en CHO (Chinese Hamster Ovarium) cellen om humaan ICAM-1 (CHO-ICAM-cellen) tot expressie kan het systeem eenvoudig worden aangepast verschillende leukocyt populaties of adhesiemoleculen te bestuderen.
Deze analyse verschaft een werkwijze om T-cel hechting en integrine activering kwantificeren volgens afschuifspanning, die een model voor de stevige adhesie fase van extravasatie van leukocyten. Door het gebruik van CHO-cellen ICAM de affiniteit van LFA-1 voor zijn ligand in levende cellen in real time kan worden onderzocht in reactie op verschillende stimuli plaats. Deze techniek vereist gemakkelijk te verkrijgen, in de handel verkrijgbare micro-stromingskamers in combinatie met een spuitpomp, veel eenvoudiger de nodige bloedstroom en schuifspanning modelleren apparatuur in vergelijking met andere modellen. 9 Een ander groot voordeel van deze test is dat specifieke signaleringcascades en de resulterende activatie status van afzonderlijke integrinen kan netjes worden bestudeerd door het gebruik van gemanipuleerde CHO-cellen die humane adhesiemoleculen plaats. Bovendien is de combinatie van kwantitatieve gegevens beeldvorming van levende cellen is een belangrijk voordeel van deze methode. Overall, terwijl een aantal assays statische T celadhesie beschreven die mooi model T-cel-interacties APC, deze modellen zijn onvoldoende vastleggen van het dynamische proces van T-cel-epitheliale adhesie. Daarom, bij het kiezen van een adhesietest de stimulus opnieuw dienen te worden beschouwd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Plating de CHO-cellen ICAM
Opmerking: Het doel van deze stap is de CHO-cellen overnacht ICAM plaat in de stromingskamers groei met als doel het genereren van een confluente monolaag.
- Onderhouden CHO-ICAM-cellen in 10 cm weefselkweek behandelde kweekschalen in 10 ml RPMI medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine (CHO-ICAM compleet kweekmedium) bij 37 ° C met 5% CO 2.
- Om cellen te verzamelen, voeg 1 ml 0,5% trypsine-EDTA en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 min onder zacht schudden. Neutraliseer de trypsine met 4 ml medium.
- Tel de CHO-ICAM-cellen met behulp van een hemacytometer en bereken 0,75 x 10 5 cellen per kamer. Opmerking: In dit experiment: 2,25 x 10 5 cellen nodig is om 3 kamers zaad.
- Centrifugeer 0,75 x 10 5 CHO-cellen ICAM per kamer gedurende 5 min bij 500 xg, kamertemperatuur en resuspendeer de celpellet in 30 gl per kamer van CHO-ICAM Volledige cultuur media.
Let op: In dit experiment wordt 90 ul nodig zijn om 3 kamers zaad. - Voeg langzaam de cellen in een reservoir van de stroom kamer. Laat de cellen te regelen voor 5 min in 37 ° C incubator met 5% CO2.
- Voeg 200 ul van complete cultuur media over de twee reservoirs van elke kamer. Alternate toevoegingen tussen de twee bewegingen van de cellen te voorkomen als het systeem in evenwicht.
- Incubeer de cellen overnacht in een 37 ° C incubator met 5% CO2.
2. Bereiding van de T-cellen
Opmerking: Deze test kan worden uitgevoerd met primaire humane T-cellen of T-cellijn. Een protocol op T-cel-isolatie van bloed is eerder beschreven. 10 Bij gebruik van primaire menselijke T-cellen te gebruiken vers geïsoleerde cellen voor het beste resultaat. Bij gebruik van een T-cellijn, volgt de cultuurprotocol door de bron van de cellen. Om de cellen op een fluorescerende Micr detecterenpe de T-cellen gelabeld met carboxy fluoresceïne succinimidylester (CFSE).
- Tel de T-cellen met behulp van een hemacytometer en bereken 2 x 10 6 cellen per kamer. Opmerking: In dit experiment wordt 6 x 10 6 cellen nodig voor 3 kamers.
- Centrifugeer 2 x 10 6 cellen per T kamer gedurende 5 min bij 500 xg, kamertemperatuur en resuspendeer de cellen in 1 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bevattende 1% glucose en 2% FBS.
- Voeg CFSE bij 1: 1000 verdunning (voorraad gemaakt tot 5 mm). Bedek tegen licht en incubeer gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur
- Spin bij 500 xg gedurende 5 min, RT.
- Resuspendeer celpellet met 240 ul per staat (zie hoofdstuk 4 "Note") RPMI media ontbreekt serum. In dit experiment, resuspendeer de celpellet in 720 ui RPMI vlakte. Verdeel de cellen in lege 1,5 ml buisjes gelabeld voor elke kamer, 240 ul per buis. Houd cellen in een 37 ° C verwarmen blok tot gebruik.
3. Het opzetten van the Input / Output Hosing en -spuitpomp
- Verwarm de microscoop live-imaging kamer tot 37 ° C.
- Bereid de ingang schoonspuiten:
- Vul een 500 ml glazen fles met water en maak 2 gaten in het deksel. Label de gaten "in" en "out." Deze zal fungeren als een verwarmen van water bad voor de input media.
- De ingangsstroomkabels schoonspuiten door de gaten in het deksel en in het waterbad. Zorg ervoor dat de zijde van het schoonspuiten die aansluit op de spuit komt door de "in" gat en de kant die zal aansluiten op de ingang reservoir komt door de "out" gat.
- Spoel de input schoonspuiten met 60 ml water om alle lucht uit het systeem te verwijderen.
- Prime de ingang afspuiten met RPMI medium zonder serum verwarmd tot 37 ° C. Vul een 60 ml spuit en duwen door de media tot het schoonspuiten is volledig gegronde en het ontbreekt aan eventuele luchtbellen.
Opmerking: Afhankelijk van de length slang gebruikt het volume dat nodig is om prime zal variëren.- Bereken de hoeveelheid media die nodig zijn voor het experiment van de stroomsnelheid (hier 0,3 ml / min) te vermenigvuldigen met het aantal minuten (5 min) van het aantal kamers in het experiment (hier 3); in dit experiment gebruikt 4,5 ml media. Let op: Wij raden met 5 ml extra volume (hier in totaal 9,5 ml) die nog in de spuit na priming.
- Plaats het gehele ingangsinstelling in de levende beeldvorming behuizing van de microscoop 37 ° C te houden. Voer het schoonspuiten en spuit uit de behuizing en plaats de injectiespuit in de injectiepomp.
- Bereid de uitgang schoonspuiten:
- Een gat in het deksel van de fles 250 ml te gebruiken als output afval.
- Voer het uitgangsbuizen door het gat en in de fles. Losjes zet de deksel niet helemaal sluiten.
- Leg de output setup in de live-imaging omheining van het microscope.
- Bereken het debiet (ml / min) moet de gewenste schuifspanning (dyn / cm 2) genereren. Schuifspanning varieert in verschillende vasculaire compartimenten, neem dan ook rekening gehouden met de algemene model met inbegrip van celtypen te onderzoeken en behandelingen bij de besluitvorming over een shear stress-niveau.
Let op: Deze experimenten worden uitgevoerd bij 0,4 dyn / cm2 om nauw samen te bootsen een kleine ader setting.- Neem de kamer afmetingen rekening gehouden bij de berekening van shear stress. Gebruik de volgende formule (verstrekt door de fabrikant 11) voor de stroom kamers hier gebruikt (zie tabel of Materials): T = η * 176,1 * ø waarbij T = shear stress, η = dynamische viscositeit, ø = debiet. Opmerking: De dynamische viscositeit van RPMI medium bij 37 ° C is 0,007.
4. Laden van de Flow Chambers en stimulatie van de cellen
Let op: Om hechting te leiden,T-cellen worden gestimuleerd. In het volgende experiment wordt de ongestimuleerde cellen ofwel blijven of worden gestimuleerd met SDF-1α 12 of forbolmyristaatacetaat (PMA; positieve controle) 13. Voor een juiste weergave van chemokine T-cel, zijn CHO-ICAM-cellen gepreïncubeerd met SDF-1α (serieel gevolgd door wassen), waardoor de presentatie op het celoppervlak. PMA is een forbolester die structureel vergelijkbaar met de tweede boodschapper diacylglycerol (DAG); hier wordt gebruikt als een positieve controle. T-cellen worden direct behandeld met PMA vóór het laden in de stromingskamer.
- Plaats de stroom kamer dia op de microscoop en zet de focal plane op de CHO-ICAM monolaag met behulp van de 20X objectief.
- Houd CFSE-gekleurde T-cellen voor alle andere voorwaarden in de 37 ° C verwarmen blok. Bereid de CHO-ICAM of T-cellen vóór de test voor deze voorwaarde als volgt:
- Voor de niet gestimuleerde toestand (kamer 1), houdt één buis / stroom chamber onbehandeld, als negatieve controle voor stimulatie dienen.
- PMA stimulatie (kamer 2) stimuleren een buis van T-cellen met PMA (10 ng / ml) als positieve controle te dienen; behandel onmiddellijk vóór het laden in de stroom kamer.
- Voor SDF-1α stimulatie, (kamer 3) stimuleren de derde stromingskamer met SDF-1α (100 ng / ml) door 70 gl per keer 3 keer uit het bovenste reservoir (output reservoir) en vervolgens toevoegen van 70 gl SDF -1α (100 ng / ml) in het onderste reservoir (input reservoir). Incubeer gedurende 5 min.
- Verwijder en gooi 70 ul op een moment 3 keer van de uitgang reservoir van één kamer.
- Voeg 70 ul van voorbehandeld (indien van toepassing) T celsuspensie in de ingang reservoir 3 maal. Wacht 5 minuten om de cellen om van de inlaat van de kamer ( "In"), en de proximale uitlaat ( "Out") van de kamer bereiken.
- Gedurende deze tijd, afbeelding 5velden CFSE-gekleurde T-cellen. Kies velden die gedurende het midden van de kamer (figuur 1) worden gedispergeerd. Gebruik de volgende excitatie / emissie voorwaarden: excitatie laser golflengte: 488 nm; emissie collectie filter: 500 - 540 nm. Deze beelden zullen dienen als de pre-flow-cel-tellingen.
- Bevestig de input en output buizen tegelijkertijd de stromingskamer reservoirs.
Opmerking: Bevestigen van de buis gelijktijdig is cruciaal om geen luchtbellen te introduceren in de kamer en bewaard bleef evenwicht binnen de kamer. - Begin stroom bij 0,3 ml / min (0,4 dyn / cm 2), terwijl het visualiseren van de CFSE-gekleurde T-cellen. Als er stroming, vooral met de eerste kamer, er vaak verloren gaat tussen de stroom en observeren T cel rollen dus beginnen timing 5 min bij aanvang van T-cel beweging.
- Beëindigen flow na 5 min, en het beeld 5 velden in de CFSE kanaal. Kies velden willekeurig verspreid throughout het centrum van de stromingskamer (figuur 1). Deze beelden zullen dienen als de post-stroom cel telt.
5. Het bepalen van de Percentage van de hechtende cellen
Noot: Bepaling van het aantal cellen in de verkregen beelden objectief gebeurt met geautomatiseerde software. Voor onze studies gebruikten we de software Volocity (versie 6.2.1), maar ook andere software zoals ImageJ (Version 1.48V) zijn eveneens toepasbaar.
- Bepaal het aantal cellen per veld pre-flow voor elke conditie. Het gemiddelde van de 5 velden is het "pre-stromingsgemiddelde celtelling." 7
- Bepaal het aantal cellen per veld post-flow voor elke conditie. Het gemiddelde van de 5 velden is het "post-stromingsgemiddelde celtelling." 7
- Bereken het percentage hechtende cellen met de volgende formule: percentage hechtende cellen = (na stromingsgemiddelde celtelling) / (pre-stromingsgemiddelde celtelling) x 100%.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Representatieve resultaten worden weergegeven van de stroom adhesietest behulp Jurkat en primaire humane CD3 + T-cellen, zoals aangegeven, gestimuleerd met SDF-1α. De negatieve controles in elke getoonde experimenten ongestimuleerde cellen. Een drempel basale procent adhesie van ongestimuleerde cellen tussen 5 - 10%; base hechting met name boven deze range duidt op een problematische experiment en stelt het begin populatie van T-cellen werden niet-specifiek pre-geactiveerde in...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Om goed te analyseren T celadhesie, de stimulans voor opname in de studie moet worden overwogen bij het kiezen van een in vitro werkwijze. Hoewel er verschillende assays om signalen leidt tot LFA-1 activering en ICAM-1 bindende bestuderen alle methoden zijn niet uitwisselbaar. Een statische hechting assay 10 is het meest geschikt voor T-cel-APC interacties te bestuderen; Als alternatief kan de shear stress methode die hier beschreven is ideaal om T-cel-epitheliale cel interacties te modelleren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De Rheumatology Research Foundation en de Hirschil Trust ondersteunden dit werk.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| T cell samples (cell line or primary) | ATCC | TIB-152 | Perifere menselijke T-cellen |
| CHO-ICAM-1 cellen | ATCC | CRL-2093 | |
| µ-Slide VI 0.4 ibiTreat | ibidi | 80606 | |
| 500 ml glazen fles | Fisher | FB800500 | |
| 250 ml glazen fles | Fisher | FB800250 | |
| Siliconen slang 0,8 mm | ibidi | 10841 | |
| Confocal microscoop met incubatorkamer | Ziess | 700 | Elke brede veld fluorescerende microscoop |
| Spuitpomp | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| 60 ml spuit | BD | 309653 | |
| CFSE | eBioscience | 65-0850 | |
| SDF-1α | R&D | 350-NS-010/CF | |
| RPMI | Lonza | 12-702F/12 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| PMA | Sigma Aldrich | 16561-29-8 | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Versie 6.2.1 | |
| ImageJ software | NIH | Versie 1.48V | |
| In weefsel gekweekte kweekschotels | Falcon | 353003 | |
| Trypsin-EDTA (0,25%) Fenol Rood | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | |
| Penicilline/Streptomycine | Fisher | BP295950 |
Referenties
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Su, W., et al. Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking. Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophys J. 102 (2), L5-L7 (2012).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. Static adhesion assay for the study of integrin activation in T lymphocytes. J Vis Exp. (88), (2014).
- Ibidi GmbH. Shear stress and shear rates for ibidi μ-Slides - based on numerical calculations. Application Note 11. , Available from: http://ibidi.com/fileadmin/support/application_notes/AN11_Shear_stress.pdf (2014).
- van Gijsel-Bonnello, M., et al. Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration. J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).
- Tozeren, A., et al. Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1. Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).
- Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability. Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).
- Rot, A. In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells. J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).
- Yang, L., et al. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Long, E. O. ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion. J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
