Methodenartikel

Isolatie en uitbreiding van mesenchymale stamcellen / stromale cellen afkomstig van menselijke placenta Tissue

39.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54204

⸱

6 juni 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1UQ Centre for Clinical Research, The University of Queensland, 2Translational Research Institute, Queensland University of Technology, 3Translational Research Institute, Mater Medical Research - University of Queensland

In dit artikel

Samenvatting

Hierin beschrijven we werkwijzen voor de ontleding van foetale en maternale weefsels van menselijke term placenta, gevolgd door isolatie en expansie van mesenchymale stamcellen / stromale cellen (MSC) van deze weefsels.

Samenvatting

Mesenchymale stam-/stromacellen (MSC) zijn veelbelovende kandidaten voor gebruik in cel-gebaseerde therapieën. In de meeste gevallen lijkt de therapeutische respons afhankelijk te zijn van de celdosis. De menselijke placenta na een voldragen zwangerschap is rijk aan MSC en is een fysiek groot weefsel dat over het algemeen na de geboorte wordt weggegooid. De placenta is een ideaal uitgangsmateriaal voor de grootschalige productie van meerdere celdoses van allogene MSC. De placenta is een feto-maternal orgaan waaruit het foetale of maternale weefsel kan worden geïsoleerd. Dit artikel beschrijft de anatomie van de placenta en de procedure om het decidua (maternal), de chorionvlokken (foetaal) en het chorionplaatje (foetaal) weefsel te scheiden. Het protocol beschrijft vervolgens hoe MSC uit elk gesneden weefselgebied kan worden geïsoleerd en geeft een representatieve analyse van geëxpandeerde MSC afkomstig uit de respectieve weefseltypen. Deze methoden zijn bedoeld voor preklinische MSC-isolatie, maar zijn ook aangepast voor klinische productie van placentale MSC voor therapeutisch gebruik bij mensen.

Inleiding

Mesenchymale stamcellen / stromale cellen (MSC) ontstaan ​​als een veelbelovende kandidaat voor gebruik bij celtherapie 1. De meeste toepassingen lijken te richten op MSC-gemedieerde weefselherstel en immuunregulatie 2. In veel van deze toepassingen kan allogene MSC zo effectief als autoloog MSC 3 zijn. Het gebruik van allogene MSC heeft het economisch voordeel dat ze compatibel met de grootschalige productie van meercellige doses uit een enkele bron weefsel 4 om veel patiënten te behandelen.

Historisch gezien hebben preklinische en klinische studies gebruikt MSC-afgeleid van het beenmerg 4. Beenmerg is over het algemeen verzameld uit het bekken van een vrijwilliger donor. Deze werkwijze is invasief, en slechts een klein volume merg (~ 20 ml) verzameld via één punctie. Het genereren van klinisch betekenisvolle aantallen MSC vereist uitgebreide in vitro expansie. Celpotentie afneemt met de passage nummer 3, waardoor een paradox waarvan het theoretische aantal cellen nodig voor klinische werkzaamheid wordt verhoogd naarmate de celpopulatie wordt geëxpandeerd. In tegenstelling tot beenmergaspiraten, Termijn placenta is een fysiek groot uitgangsweefsel (typisch 500-750 g 4), die aseptisch tijdens keizersnede zonder risico voor de donor kan worden geoogst. MSC afgeleid van placenta hebben op lange termijn proliferatie 5 en immunomodulerende capaciteit 6, superieur aan beenmerg afgeleide MSC. In een eerdere studie hebben we aangetoond dat een enkele term placenta bevatte voldoende MSC voor de vervaardiging van maximaal 7000 klinische doses 4. Deze kenmerken maken een ideale bron placenta weefsel voor de productie van allogene MSC.

De placenta is een orgaan fetomaternal bestaande uit zowel foetale en maternale weefsel 7, en dus MSC van foetale of maternale oorsprong kunnen zijn, in theorie, geïsoleerd. De volgende referenties bieden detailed informatie over de ontwikkeling en pathologie, alsook microscopische en macroscopische onderzoek van de humane placenta en adnexa 8,9. De placenta juiste bestaat grotendeels uit foetale bloedvaten en secretoire en het ondersteunen van cellen genaamd trofoblasten, waaruit de vlokken vallen onder de chorion frondosum (plaat) 8. De vertakte placenta villi, badend in het bloed van de moeder verlost van de baarmoeder spiraal slagaders, waardoor voedingsstoffen, hormonen en gasuitwisseling tussen de foetus en de moeder. De placenta is verankerd aan het endometrium via maternale decidua stromale cellen en foetale extravillious trofoblasten worden afgewisseld in de extracellulaire matrix 8. De villi convergeren op de foetale chorionic plaat waar ze vormen de navelstreng 8.

Een resultaat van de eerste International Workshop on-placenta afkomstige stamcellen (2008) werd een evaluatie van de noodzaak om de isolatie en characterizatio standaardiserenn cellen uit menselijke placenta term 10. Als gevolg van de anatomie van de placenta, dissectie van de verschillende weefsels, isolatie van MSC en verwachte cultuur resultaten kunnen overweldigend zijn voor nieuwkomers in het veld. In dit protocol, de oogst van de placenta chorionic weefsels, gevolgd door MSC isolatie en expansie is goed gedetailleerd. MSC karakterisering via flowcytometrie en in vitro differentiatie beschouwd 5,11-13 routine en hier dus slechts kort beschreven.

Zoals in een recent systematisch literatuuronderzoek 14, MSC verkregen uit de placenta vlokken over het algemeen wordt aangenomen dat de foetus te zijn. Hoewel slechts 18% van studies onderzochten de oorsprong van de MSC verkregen, en die slechts de helft van de studies foetale MSC en de andere helft gerapporteerde maternale of gemengde populaties MSC. Elk van de drie weefsel componenten die hierin worden beschreven (chorionvlokken, chorionic plaat en decidua basalis) zijn compingosed voornamelijk uit de vliezen / villi, en een klein deel van de baarmoeder afgeleide maternale cellen die gehecht blijven aan de geleverde placenta. Wij verstrekken gegevens die aantonen dat MSC isoleren van moederszijde van de placenta, in plaats van de foetale kant van de placenta, zoals we eerder gemeld 5,11, een geschikter uitgangsmateriaal als moeder MSC gewenst. Dit protocol beschrijft ook het gebruik van XY FISH foetale of maternale bijdrage aan celculturen valideren. Hoewel dit een standaard protocol van de fabrikant, wordt deze analyse vaak verwaarloosd en het belang onderschat 14.

Protocol

The Human Research Ethics Commissies bij Mater Health Services, Koninklijke Brisbane en Women's Hospital, Queensland University of Technology en de Universiteit van Queensland keurde het onderzoek en het verzamelen van de menselijke placenta samples gebruikt in het onderzoek. Alle protocollen voldaan aan de nationale richtlijnen voor onderzoek. Patiënten mits schriftelijke toestemming van de hoogte van het gebruik van weefsel voor onderzoeksdoeleinden.

Derde trimester placenta werden verkregen van gezonde moeders volgende routine keizersnede (CS) geboorten op termijn van bovengenoemde ziekenhuizen in Brisbane, Australië. Mannelijke tegenstrijdige zwangerschappen term monsters werden gebruikt in deze studie foetale onderscheiden van maternale cellen. Foetale geslacht werd bepaald door middel van ultrageluid voor de geboorte en / of visuele inspectie van de pasgeborene bij de geboorte door klinisch personeel. X en Y-chromosoom fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) werd gebruikt om verder te valideren geslacht en foetale of maternale oorsprong weefsel behoed deorigineel placenta's.

1. Voorafgaand aan Harvest, Bereid de volgende

Opmerking: Bij het maken van enzymoplossingen dienen de specifieke eisen en concentraties van de fabrikant voor elk product worden gevolgd. Enzymen worden vaak geleverd als een ruw mengsel van eiwitten, dus soortgelijke enzymen van verschillende bedrijven waarschijnlijk verschillende activiteiten / concentraties. Om deze reden is het advies van de fabrikant moet worden erkend en oplossing preparaat kan dienovereenkomstig worden aangepast.

  1. Bereiden of te kopen 1,5 tot 2 L totaal steriele Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) voor dit protocol.
  2. Bereid collagenase I voorraadoplossing door afwegen van collagenase type I en los 1 mg / ml in HBSS en vortex zachtjes om volledige oplossing te verzekeren. Bepaal het volume van HBSS (met calcium en magnesium) nodig om collagenase oplossing voor 100 eenheden (U) / ul (1000x voorraad-oplossing) te brengen en vervolgens filteren met een 0,2 &# 181; m spuitfilter. Aliquot 1 ml volumes in 1,5 ml buisjes en bewaar bij -20 ° C totdat het nodig is.
  3. Bereid dispase voorraadoplossing door het oplossen van niet-steriele dispase bij 10 mg / ml in Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) zonder calcium of magnesium. Verdun met DPBS zonder calcium of magnesium tot een eindconcentratie van 2,4 U / ml. Filter steriliseer door een 0,2 urn spuitfilter. Aliquot 1 ml volumes in 1,5 ml buisjes en bewaar bij -20 ° C totdat het nodig is.
  4. Bereid deoxyribonuclease (DNase) -I voorraadoplossing door het oplossen DNase-I bij 10 mg / ml in 0,15 M NaCl. Filter thorugh een 0,2 urn spuitfilter. Aliquot 1 ml volumes in 1,5 ml buisjes en bewaar bij -20 ° C totdat het nodig is.
  5. De werkoplossing verteringsoplossing combineert 100 U / ml collagenase type I, I 5 ug / ml DNase I en 2,4 U / ml dispase in serumvrij DMEM. Vers ontdooid en verdund enzym voorraden onmiddellijk voor gebruik. Ongeveer een 1: 1 verhouding van ontsluitingsoplossingvolume weefselvolume vereist (bijvoorbeeld 10 ml weefsel, gemeten in een 50 ml buis vereist 10 ml ontsluitingsoplossing).
  6. Bereid een oplossing van 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS en op pH 7,4 15. WINKEL 25 ml porties bij -20 ° C voor lange termijn of bij 4 ° C gedurende 1 week.
  7. Bereid MSC kweekmedium DMEM-lage glucose (DMEM-LG), aangevuld met 1x antibiotica en antimycotische oplossing en 10% niet-hitte geïnactiveerd foetaal runderserum. MSC-grade FBS kunnen worden gekocht bij vele FBS leveranciers.
  8. Autoclaaf steriliseren dissectie apparatuur van tevoren als per institutionele richtlijnen. Deze omvatten schaar, pincet, scalpels, en een grote metalen dissectie lade. Verzamel extra steriele weefselkweek plasticware en hulpstoffen (bijv scalpelmesjes, 50 ml en 15 ml buizen, 25 ml, 10 ml en 5 ml pipetten, en 75 of 175 cm 2 celkweek flessen).
  9. Gebruik standaard primaire celcultuur laboratorium apparatuur: een klasse II biosafety kast geschikt voor primaire celisolatie, celkweek incubator ingesteld op 5% CO2 en 37 ° C, een tuimelschakelaar in een 37 ° C incubator, en een centrifuge met een capaciteit van 50 ml buizen.
  10. Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen: een labjas, 2 paar handschoenen (ten alle tijden), veiligheidsbril en close-toed schoenen als per institutionele richtlijnen.
  11. Bereid gepaste decontaminatie oplossingen voor menselijke bloedmonsters volgens institutionele richtlijnen en vloeibaar biologisch afval containers op voorhand.

2. Isolatie van de placenta MSC

  1. Bereiding van de placenta
    1. Jurk in de vereiste persoonlijke beschermingsmiddelen. Het opzetten van de biologische veiligheid kast met benodigde materialen, oplossingen en afvalcontainers de procedure tot uit te voeren naar de enzymatische afbraak (paragraaf 2.5.6).
    2. Het verkrijgen van een placenta met informed consent en ethische goedkeuring. Verzamel de placenta via keizersnede sectie onder aseptische chirurgische omstandigheden en verpakking een steriele zak of bak voor transport naar het laboratorium.
    3. Tijdens transport en voorafgaand aan dissectie, slaan de placenta bij kamertemperatuur of 4 ° C.
      Opmerking: Weefsel kan worden bewaard tot 6 uur zonder dat celkweek prestaties.
      1. Beperk de tijd tussen placenta inzameling en verwerking weefsel waar mogelijk. Deze aanbeveling is gebaseerd op praktische zaken. In sommige gevallen hebben we de cel isolatiewerkwijze tot 6 uur na de geboorte vertraagd. In deze gevallen placenta zijn bij kamertemperatuur of 4 ° C (in het laboratorium of aan de verzamelplaats) gehouden. Geen detecteerbare verschillen waargenomen, bovenstaande algemene donor variatie in de MSC verkregen uit placenta wanneer ze bij 4 ° C of bij kamertemperatuur werden bewaard.
    4. Plaats de houder met placenta in de biologische veiligheidskast. Open de houder en breng de placenta in een steriele schaal.
    5. Open de foetale membranen (vruchtzak of amnion-chorion laeve) 8. Worden georiënteerd met de delen van de placenta. De foetale kant heeft de navelstreng insertie, die in het algemeen centraal geplaatst in de placenta. Moederszijde (bekleed met decidua basalis), die tegenover de foetale kant, heeft duidelijke zaadlobben (of lobben).
    6. Om de dissectie te beginnen, oriënteren de placenta met de navelstreng naar boven in de steriele lade.
      Opmerking: Dit protocol is ontworpen om voldoende cellen te zaaien in een T175 kolf van elk van de drie weefseltypen verkregen. Elke digest begint met ongeveer 10 g weefsel. Dit is een gelijkaardig startnummer kolven als MSC culturen geïnitieerd vanuit een 20 ml beenmergaspiraat. Als er meer cellen gewenst zijn, dan meer weefsel kan worden geoogst en het protocol kan lineair worden geschaald. De afmetingen van het weefsel te oogsten zijn slechts een indicatie van wat praktisch met de placenta weefsel. Er zijn weinig defining functies in de placenta villi, die kan worden gebruikt als referentiepunt. De opgegeven afmetingen dienen als schatting en de navelstreng wordt gebruikt als een baken op de foetale oppervlak.
  2. Dissectie van de deciduale (D) Tissue
    1. Flip de placenta om zodat de moederlijke oppervlak (decidua basalis) naar boven. Zorg ervoor dat de foetale kant met de navelstreng invoegpunt naar beneden is gericht.
    2. Knip stukjes van 0,5 cm dikte van de moederlijke kant van de placenta (met decidua basalis weefsel).
    3. Plaats stukken weefsel in een petrischaal met HBSS tijdens de dissectie de stukken weefsel gehydrateerd.
    4. Transfer voldoende weefsel om een ​​buis te vullen tot de streep 10 ml in een buis van 50 ml (dit is ongeveer 10 g weefsel).
  3. Dissectie van de chorion Plate (CP) Tissue
    1. Mechanisch verwijderen van het vruchtwater membraan van de foetale oppervlak van de placenta (niet de vruchtzak), waardoor de chorionic frondosum (chorionic plaat) intact.
    2. Knip stukjes ~ 1 cm breed en 0,5 cm diep uit de chorionic plaat. Oogst de chorionic plaat uit het gebied het dichtst bij de navelstreng, weg van de rand van de placenta.
    3. Plaats stukken weefsel in een petrischaal met HBSS tijdens de dissectie om ze gehydrateerd.
    4. Transfer voldoende weefsel in een 50 ml buis te vullen tot de streep 10 ml (~ 10 g weefsel).
  4. Dissectie van de vlokken (CV) Tissue
    1. Ontleden CV weefsel ~ 1 cm 2 x 0,5-1 cm diep uit placentaweefsel waar de CP al is verwijderd. Nogmaals, oogst CV van het gebied het dichtst bij de navelstreng, weg van de rand van de placenta. Proberen te blijven ten minste 1 cm afstand van de moederlijke kant van de placenta (met decidua basalis weefsel); het doel is om weefsel te oogsten uit het inwendige van de placenta villi weefsel.
    2. Plaats stukken weefsel in een petrischaal met HBSS gedurende het dissection om hen gehydrateerd te houden.
    3. Transfer voldoende weefsel in een 50 ml buis te vullen tot de streep 10 ml (~ 10 g weefsel).
  5. Mincing en enzymatische afbraak van de D, CP, en CV placenta weefsels
    1. Aangezien er ~ 10 g D, CP of CV weefsels in drie verschillende 50 ml buizen vul elke buis met ongeveer 40 ml HBSS en herhaaldelijk omkeren van de buis om het weefsel te wassen (herhaal voor ~ 10 sec).
    2. Decanteer het supernatant en herhaal deze wasstap 2-3 keer totdat de oplossing grotendeels vrij van bloed. Gebruik een 10 ml pipet of lange pincet te zorgen voor de weefselstukken niet verloren uit de buis (en) bij decanteren van de bovenstaande vloeistof.
    3. Terugkeren weefselstukjes een 10 cm petrischaal met minimale vloeistofoverdracht. Chop / gehakt het weefsel in fijne stukjes van ongeveer 1-5 mm 3 met een schaar of scheermesje.
    4. Breng het gehakt weefsel terug in gepaste label (D, CP of CV) 50 ml buizen.
    5. Voeg vers prepared verteren media in ten minste een 1: 1 verhouding met het weefsel (bijvoorbeeld 10 ml weefsel plus 10 ml verteren media). Plaats de dop op elke buis en draai de buizen meerdere malen om te mengen.
    6. Incubeer de weefsels in de buizen met digest media gedurende 1-2 uur bij 37 ° C. Een vochtige atmosfeer en 5% CO2 niet nodig voor deze stap.
      Opmerking: Rapid schudden vereist om cellen van het weefsel efficiënt dissociëren en MSC maximale opbrengst. Limited opbrengst zal duidelijk zijn door zeer weinig cellen op 48 uur en een eerste passage langer dan 1-2 weken aan de cultuur kolf. De incubatietijd en schudden werkwijze afhankelijk van de 37 ° C incubator in het laboratorium en kunnen optimalisatie vereisen.
      1. Voor een incubator met een snelle en controleerbare schudden mechanisme, plaats weefsel en verteren medium in een 50 ml buis of steriele erlenmeyer, plaats in de incubator en stel schudden snelheid tot 250 rpm. Dit resulteert in een complete digestie vanhet weefsel in 1 uur.
      2. Als alternatief voor een incubator met een zachte rockende of geen schommelen mechanisme, hand schudden de buis snel en krachtig met de hand gedurende 10 sec elke 30 min gedurende 1,5 tot 2 uur. Het enzym incubatietijd is een geschikte tijd om afval te ontdoen, duidelijk de bioveiligheid kabinet van onnodige voorwerpen, veranderen laboratoriumjas als vuil en voor te bereiden voor het volgende deel van de procedure.
  6. Het verzamelen van mononucleaire cellen en Plating in Flessen
    Opmerking: Van de vorige stap zijn er drie 50 ml buizen (D, CP of CV) met digereren stukken weefsel. Wanneer het weefsel digest oplossing evolueert een bewolkte verschijning en witte bloedvaten zijn duidelijk in het weefsel, de spijsvertering is voltooid.
    1. Voeg 30 ml MSC medium met FBS aan elke buis om de enzymen in de verteringsoplossing inactiveren.
    2. De mononucleaire cellen te scheiden van de grote onverteerde puin, Pulscentrifugeer de 50 ml buis. Kort toestaande centrifuge tot 340 x bereiken g gedurende 5 seconden en dan stoppen. Dit zal de grote brokstukken dwingen pellet op de bodem van de buis, terwijl de mononucleaire cellen in vloeibare suspensie.
      Opmerking: De mononucleaire cellen in de vloeistoffase blijft indien de buis kortdurend (gepulseerd) gecentrifugeerd. Als centrifugeren wordt verlengd, wordt de mononucleaire cellen ook pellet op de bodem van de buis met het weefsel stukken, leidt tot ongewenste celverlies.
    3. Verzamel de supernatant met de mononucleaire cellen en breng deze in een nieuwe 50 ml buis met een pipet.
    4. Voeg 30 ml van de media of HBSS om de resterende placenta weefsel puin en schud krachtig. Dit zal de resterende vrijstaande mononucleaire cellen te brengen in suspensie en maken een tweede oogst van de vermeende MSC uit het weefsel.
    5. Pulse centrifuge de buis een tweede keer, en opnieuw over de bovenstaande om een ​​nieuwe 50 ml buis. Herhaal deze stap voor de derde keer aan de collectie efficiëntie te maximaliserenmononucleaire cellen uit elke weefselbron.
    6. de supernatanten van elk van de afzonderlijke weefselsoorten pool in twee 50 ml buisjes. Dit zal 6 tubes in totaal (2 tubes van elk D, CP en CV) opleveren. Centrifuge elke buis gedurende 5 minuten bij 340 x g. Deze stap zijn mononucleaire cellen pellet op de bodem van de buizen.
    7. Zorgvuldig giet of pipet uit de bovenstaande vloeistof in het afval. Behoeft proberen om elke druppel supernatant te elimineren.
      Opmerking: De celpellet wordt kwetsbaar vanwege een groot aantal rode bloedcellen. Wees voorzichtig dat u de pellet ongeluk weggooien als u rechtstreeks decanteren van de 50 ml buis.
    8. Na het verwijderen van de meeste van de bovenstaande vloeistof voorzichtig flick de buis meerdere malen met een vinger om de celpellet te verwijderen. Combineer de pellets, zodat er een buis voor elke D, CP of CV weefsel en resuspendeer elk in 35 ml van MSC media.
    9. Optioneel: Filter de mononucleaire fractie door een 100 um mesh cel zeef SETUp in een 50 ml buis naar cel klonten of vezelig materiaal te verwijderen.
      Opmerking: Zorg is vereist als de filters gemakkelijk kunnen verstoppen en over-fill. Daarnaast kunnen luchtbellen filters belemmeren van aftappen. Als dit gebeurt, langzaam til de filter uit de buis om de lucht te laten stromen onder het filter, wassen filter door middel van media voor celkweek of uitwisseling naar een nieuwe filter. Exclusief de filtratiestap lijkt geen opbrengst of kwaliteit van de daaropvolgende MSC kweken verandert.
      1. Eventueel een rode bloedcel (RBC) lysis of dichtheidsgradiënt centrifugatie kan in dit stadium 15 uitgevoerd. Maar onze ervaring is dat RBC niet interfereren met MSC aan- resp proliferatie en derhalve RBC lysis is niet noodzakelijk. Mononucleaire cellen kunnen worden geteld bij deze stap als RBC verwijdering 15 uitgevoerd. Hoewel de overgrote meerderheid van de cellen in deze fase niet MSC, maar zijn foetale oorsprong trofoblasten, endotheliale cellen en hematopoietische cellen, en materne oorsprong hematopoietische cellen en decidua stromale cellen.
    10. Breng de celsuspensie per D, CP of CV weefsel in een T175 kolf en cultuur in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
  7. Post Isolatie-cell Expansion
    1. Op 48 uur na de oorspronkelijke isolatie Verwijder het medium uit elk van de kolven (D, CP cv) en vervangen door 35 ml vers medium MSC. Het verbruikte medium en losgemaakte cellen kunnen worden gebruikt omdat vermeende MSC, worden geacht aan de weefselkweek kolf 16. Terugkeren kolven naar de incubator voor een verdere 24 uur.
    2. Na nog eens 24 uur cultuur, was de kolven tweemaal met DPBS (25 ml) om afval en RBC's te verwijderen. Zwenk de vloeistof rond de bodem van de kolf RBC's te verwijderen. Gebruik een pipet om vloeistof en vuil te verwijderen. Voeg 35 ml MSC media om de kolven en de terugkeer van de flessen naar de incubator.
    3. Vervang de media twee keer per week, en incubate kweken totdat de celmonolagen zijn 80- 90% confluent. Deze eerste expansie duurt 4-14 dagen, afhankelijk van de kwaliteit van het weefsel, hoeveelheid uitgangsmateriaal en efficiëntie en incubatietijd met de digest oplossing.

3. Subculture van pMSCs

  1. Wanneer culturen 80-90% confluent, twee keer wassen met 20 ml 1x HBSS of DPBS en gooi wasbeurten. Voeg trypsine-substituut voor elke kolf (dwz gebruiken 5 ml voor een T175 kolf).
  2. Incubeer de kolven gedurende 5 minuten bij 37 ° C MSC bevrijden van de weefselkweek oppervlak. Tik op de zijkanten van de kolf elke ~ 2 min tot onthechting te vergemakkelijken.
  3. Wanneer cellen worden losgemaakt van het oppervlak en een enkele celsuspensie, was de cellen uit de kolf MSC media en het verzamelen van de cellen in buizen. De MSC media zal verdunnen en deactiveren van de trypsine-vervanger (gebruik ~ 15 ml van MSC media per T175 kolf).
  4. Breng de inhoud van elke weefselkweek kolf een 50ml buis.
  5. Centrifugebuizen bij 340 xg gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren.
  6. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellets in 1 ml MSC media.
  7. Verdun 10 pi celsuspensie in 10 pi trypan blauw. Aantal cellen met een hemocytometer en bereken het totale aantal cellen 15.
  8. Transfer cellen nieuwe kolven bij 1150 cellen / cm2 in verse MSC media en incuberen in een weefselkweek incubator. Dit zaaidichtheid, zaad 200,000 MSC naar elke nieuwe T175 kolf 35 ml van MSC media. Voeden cellen tweemaal per week tot 80-90% confluent. Zaad daaropvolgende passages op 1150 cellen / cm 2 of 200.000 MSC in elk T175 kolf.
  9. Wanneer de passage 1 (P1) of P2 cellen confluent cryopreserve de meerderheid van de cellen voor toekomstig gebruik, en reseed slechts een T175 kolf voor verdere vermeerdering en karakterisering. De gekweekte cellen kunnen gebruikt worden op P3 en P4 voor mesodermale differentiatie assays en cel karakterisering via flow cytometrie.
    Opmerking: In vroege passages kunnen er weinig dun gescheiden kolonies, maar de lokale celdichtheid in elke kolonie kan zeer hoog zijn. Dit is niet ideaal, omdat de lokale dichte pakking van de cellen zal resulteren in contactinhibitie, vertragen de groei en vermindering cultuur prestaties. We raden wanneer dichte kolonies worden waargenomen, moet de cellen worden geoogst en opnieuw uitgezet in een nieuwe fles. Deze herverdeling werkwijze verschaft cellen met ruimte om te prolifereren, en de algehele cultuur prestaties worden verbeterd.
  10. MSC cryopreserve verzamelen ~ 1 x 10 6 cellen in 1 ml 90% FCS en 10% dimethylsulfoxide (DMSO) en vries behulp van standaard protocollen.
    Opmerking: In de resultaten representatief gedeelte, zijn er beschrijvingen van MSC karakterisering met behulp van flowcytometrie, mesodermale differentiatie en XY FISH analyse om het geslacht van de drie verschillende (D, CP en CV) uitgebreid celpopulaties te bepalen. In onze studie, placenta's waren afkomstig van mannelijke baby's; dus allefoetale cellen kunnen worden onderscheiden mannelijke (Y chromosoom) en alle maternale cellen kunnen (alleen X-chromosoom) worden onderscheiden vrouwelijke.

Resultaten

De placenta MSC isolatieprocedure is samengevat in figuur 1. De drie delen van de placenta anatomie waaruit MSC werden geïsoleerd zijn aangegeven in figuur 2. Dit zijn de maternale decidua, evenals de mate foetale weefsels van het chorion plaat en chorionvilli. Veel tekst boeken, artikelen en online detail middelen van de ontwikkeling en de functionele rol van de verschillende placenta weefsels (zie verwijzing 8).

Morfologie van kweken 48 uur na isolatie en verwijdering van het weefselafval.
Na 48 uur van de cultuur, zal de MSC naar de weefselkweek plastic hebben gehecht, terwijl de rode bloedcellen en de meeste andere cellulaire puin niet hebben gehecht. Op dit moment moet het medium vervangen door 35 ml vers kweekmedium. Daarvoor medium uitwisseling is moeilijk nauwkeurige waarnemingen door de tegrote aantallen rode bloedcellen, die visuele beoordeling zal belemmeren. Het uiterlijk van de kweeksupernatant kan aanzienlijk variëren placenta donoren. Deze variatie kan visueel worden gezien in Voorbeeld 1 en 2 (Figuur 3A). Beide MSC isolaties, die bleek zeer verschillend te zijn, werden gelijktijdig uitgevoerd vanuit twee verschillende placenta. Echter, eenmaal gewassen, beide culturen, vergelijkbaar (zie gewassen voorbeeld 3, figuur 3A).

Onder een microscoop, na 48 uur media uitwisseling, alleen enkele cellen wordt toegevoegd aan de kolf (figuur 3B) en de cellen blijken significant van uitgebreider geëxpandeerde MSCs. Er afval en RBCs wordt getoond als drijvende of verbonden klonten en die geen invloed heeft op de groei van de MSCs. Hoe langer fibroblastische cellen gehecht aan de bodem van de kolf waarschijnlijk een mix van cellen zoals MSC, hematopoietische zijn,trofoblastische of endotheelcellen. Nogmaals, de niet-MSC cellen niet de MSC kweken gevaar, aangezien deze cellen niet overleven in het algemeen meer dan 1-2 passages in de MSC kweekomstandigheden. Ondanks enige variatie in de eerste verschijning van culturen, de daaropvolgende expansie resultaten globaal overeen.

Morfologie van MSC culturen in de tijd.
In dit representatief voorbeeld, zeven dagen na isolatie, kleine fibroblasten MSC kolonies zichtbaar waren, hoewel niet-MSC-cellen ook kunnen worden beschouwd als ronde of losjes gehechte cellen (Figuur 4A). De gehechte cellen worden hetgeen aanvankelijk werd aangeduid als een "kolonie uitmakende -fibroblast "(CFU-F) 17 en later genoemd MSC 18. Dertien dagen na isolatie, fibroblast MSC kolonies waren groot (Figuur 4B). In het algemeen zal de monolaag 80-90% confluent zijn op dit punt en de cellen moeten worden passa ged. Vanaf passage 2 verder, heeft de placenta MSC monolaag de karakteristieke whirlpool-achtige morfologie bij samenloop (Figuur 4C) te ontwikkelen. Tenzij de cellen gepasseerd bij lage dichtheid, de CFU-F formatie niet meer waargenomen. Bij lage dichtheid, placenta afgeleide MSC een kleinere, meer vierkante verschijning dan volwassen beenmerg afgeleide MSC 1. Terwijl de placenta afgeleide MSC en beenmerg afgeleide MSC vertonen vergelijkbare proliferatiesnelheden, de placenta afgeleide cellen minder gevoelig voor snelle veroudering 5.

Karakterisering van placenta MSC in vitro.
Elke geëxpandeerde celpopulatie worden gekenmerkt zodat het voldoet aan standaard MSC criteria 16, waaronder (1) plastic hechting (2) de aanwezigheid van mesenchymale oppervlaktemerkers en de afwezigheid van hematopoietische oppervlaktemerkers, en (3) het vermogen om mesodermale ondergaan differentiatie.

"Fo: keep-together.within-page =" 1 "> Placenta MSC's zijn plastic hechtende.
Zoals getoond in figuur 4, de MSC's in cultuur plastic hechtende en een fibroblast-achtige morfologie; Dit bevestigt dat de cellen aan de eerste criteria die MSC 16 definiëren.

Placenta MSC scherm mesenchymale oppervlakte markers.
De tweede definiëren MSC kenmerk is de aanwezigheid van mesenchymale oppervlaktemerkers en de afwezigheid van hematopoietische oppervlaktemerkers 16. Aangezien er geen enkele merker kunnen definitief identificeren van een MSC, worden panelen van markers algemeen gebruikt in combinatie met flowcytometrie analyse van cellen die mesenchymale identificeren, maar niet hematopoietische. In de representatieve gegevens set die hier (Figuur 5A), evalueerden we cel expressie van mesenchymale markers CD73, CD105, CD90, CD146 en CD44, de hematopoietische markers CD45 en CD34 en HLA-DR, als well als endotheliale marker CD31. Alle antilichamen gebruikt in deze placenta MSC karakterisering die zijn vermeld in de Tabel Materiaal / Equipment. Kleuring werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant, met analysemethoden hier 19 beschreven.

De cellen waren positief voor de mesenchymale markers CD73, CD105, CD44, en negatief voor de celoppervlak markers CD45, CD34, HLA-DR en CD31, zoals verwacht 5,20. Ongeveer 37% en 57% van de cellen in onze representatieve dataset waren positief voor CD90 en CD146 21, respectievelijk. Zowel CD90 en CD146 worden gewoonlijk gebruikt MSC markeringen 21. MSC celoppervlak marker profielen kunnen verschillen, afhankelijk van MSC weefsel bron, medium samenstelling, of passage nummer 22. In onze jarenlange ervaring, hebben we niet waargenomen op lange termijn besmetting van placenta-afgeleide MSC met niet-mesenchymale cellen na 1-2 passages 5,11.

Placenta MSC scherm mesenchymale differentiatie potentieel
Per definitie moeten MSC in vitro mesodermale differentiatievermogen 5,13 bezitten. Mesodermale differentiatie potentieel wordt vaak beoordeeld aan de hand ofwel tri- of bi-lineage differentiatie assays. Bi-lineage assays in het algemeen beoordelen osteogene en adipogenic differentiatie capaciteit, terwijl tri-lineage assays bovendien chondrogene differentiatie capaciteit te beoordelen. In de representatieve hier gepresenteerde resultaten wordt aangetoond dat de geëxpandeerde MSC populaties vormen beide kalkaanslag, indicatief voor osteogene differentiatie en lipide vacuolen, indicatief adipogenese (figuur 5B).

De MSC populaties hier gerapporteerde karakteriseren we gezaaide cellen in 24 kweekputjes van 6 x 10 4 cellen in 1 ml inductiemedium. Het medium componenten zijn opgenomen in de tabel van Materialen / Equipment. Terwijl inductiemedium formuleringen vaak in de literatuur is er aanzienlijke variatie in de gepubliceerde formuleringen. Om deze reden hebben we de lijst kort onze inductie medium formuleringen en vlekken benaderingen hier. Osteogene inductie medium bevatte DMEM-HG, 10% FBS, 1x antibiotica antimycotische oplossing, 10 mM β-glycerol fosfaatbuffer, 100 nM dexamethason en 50 pM L-ascorbinezuur 2-fosfaat. Adipogene inductie medium bevatte DMEM-HG, 10% FBS, 1x antibiotica antimycotische oplossing, 10 ug / ml insuline, 100 nM dexamethason, 200 uM indomethacine en 500 uM 3-isobutyl-1-methyl- xanthine. Hier kweken werden op 37 ° C, 5% CO2 incubator en gedurende 14 dagen. Inductie medium werd uitgewisseld twee keer per week in de kweekperiode. Na 14 dagen van inductie, werden de kweken gekarakteriseerd voor zowel bot-achtige matrix (osteogenese) of lipide vacuolen (adipogenese) als per onze previous publicatie 5. Osteogene calcium matrixafzetting analyse werd bereikt door eerst het medium opzuigen uit, de vaststelling van de kweken met 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten, wassen van de monolaag met DPBS en vervolgens kleuring met Alizarine rood volgens de instructies van de fabrikant. Adipogene inductie werd vastgesteld door afzuigen uit het medium, vaststelling van de kweken met 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten, wassen van de monolaag en kleuring met Oil Red O oplossing volgens de instructies van de fabrikant. Stained kalkafzettingen en olie vacuolen werden vervolgens gevisualiseerd met een lichtmicroscoop, en afbeeldingen die zijn opgeslagen voor later gebruik.

Eerder is, hebben we de differentiatie potentieel van placenta afgeleide MSC uitgebreider 4,5 gekarakteriseerd. -Placenta afgeleide MSC osteogenesis is vergelijkbaar met beenmerg afgeleide MSC, terwijl adipogenese het algemeen minder efficiënt in placenta afgeleide MSC 5 </ Sup>. Wij niet routinematig uitvoeren chondrogene differentiatie om verschillende redenen, maar dit is eerder door ons beschreven voor placenta-MSC 5. Enerzijds, terwijl mesodermale differentiatievermogen is een kenmerk van MSC, is het waarschijnlijk ondergeschikt 23-25, in het bijzonder wanneer het therapeutische voordeel waarschijnlijk afgeleid van het MSC paracriene afscheidingen 26. Tweede, hoewel Dominici et al. Voorgestelde minimale criteria voor de klinische productie van humane volwassen beenmerg afgeleide MSC 16 Recentere onderzoeken geven MSC uit verschillende niches verschillende inherente eigenschappen en differentiatie mogelijkheden 5,13,27-32. In feite, Parolini et al. Voorgesteld placenta afgeleide MSC moet differentiëren tot 'één of meer mesodermale "lineages plaats van drie lijnen 10. Tenslotte MSC vele studies sluiten chondrogene differentiatie deze optreedt door een soortgelijkeintracellulaire signaleringsroute als osteogenesis (TGF familie pathway) 33-35.

Placenta MSC zijn moeder in oorsprong met behulp van deze methode van de cultuur, ondanks de anatomische locatie van het uitgangsmateriaal.
Vele publicaties veronderstellen dat cellen geïsoleerd uit de foetale chorion opbrengst foetale MSC op 14 cultuur. Zoals wij eerder hebben gemeld 5, alle culturen afgeleid uit foetaal chorion, met dit protocol, worden snel verrijkt maternale MSC als zou intuïtief verwachten voor de maternale decidua MSC kweken. In deze representatieve resultaten die we placenta weefsel van mannelijke baby zodat het mogelijk was om gemakkelijk bakenen de foetale en maternale cellen bijdrage in de geëxpandeerde celpopulatie. Voor deze studies gebruikten we de XY FISH kit in de Tabel Materiaal / Apparatuur vermeld, en volgde de instructies van de fabrikant.

In de representatieve gegevens die hier de kweken afgeleid van maternale decidua was ~ 90% maternale cellen (XX) en ~ 10% foetale cellen (XY) bij passage 0 (figuur 6) . Door passage 2, de celpopulaties afkomstig van de maternale weefsels waren ~ 100% maternale cellen (XX) en foetale cellen (XY) niet detecteerbaar. Dit suggereert dat fysieke dissectie van maternale weefsels tot de verrijking van maternale cellen in het daaropvolgende kweken. Echter, is het essentieel om de kweek uitkomsten van bij de foetale vlokken en chorion-plaat afgeleide cultures. Bij passage 0, zowel foetale chorion villi en chorionic plaat afgeleide cultures waren ~ 85% XY of van foetale oorsprong aangeeft dat gerichte dissectie verrijkt voor foetale cellen (figuur 6). Bij passage 0, beide kweken bevatten ~ 15% maternale cellen (XX) vervuiling. Verrassenderwijs bij passage 2, werden beide foetale kweken gevuld met ~ 100% maternale cellen (XX) en foetale cellen (XY)waren niet meer aantoonbaar. XY FISH analyse blijkt dat maternale cellen (XX chromosomen) moeten snel en efficiënt de overname cultures afgeleid van het chorion foetale weefsels. Dit is een kritieke cultuur observatie dat vaak over het hoofd 5. Bijzonderheden van deze analyse wordt in dit protocol omdat het demonstreert de zeer belangrijke waarneming dat maternale cellen snel alle culturen vullen wanneer DMEM aangevuld met 10% FBS wordt zonder additionele factoren ontworpen om de foetale afgeleide populaties ondersteunen.

figure-results-1
Figuur 1:. Samenvatting van de placenta MSC isolatie procedure (stap 1) Oriënteer jezelf met de placenta anatomie. (Stap 2) handmatig ontleden 10 g weefsel van zowel de decidua, chorion villi of chorionic plaat met een schaar. (Stap 3) Mince thij ontleed delen van decidua, chorionvlokken of chorionic plaat weefsels in fijne stukjes met een schaar of een scalpel.
(Stap 4) bevrijden cellen van de fijne stukjes via een 1-2 uur ontsluiting dispase en collagenase I.
(Stap 5) scheiden van de cellen van het bindweefsel van puls centrifugeren en / of te wassen door een cel zeef. Verzamelen en resuspendeer cellen in kweekmedium en geplaatst in de cultuur kolven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Mesenchymale stromale cellen (MSC) worden geselecteerd op basis van hun neiging tot plastische hechting en vermogen om te overleven en prolifereren in het kweekmedium. Tenslotte bij de Resultaten, de geëxpandeerde MSC kunnen worden gekarakteriseerd en opgeslagen voor gebruik in toekomstige experimenten.

figure-results-2
Figuur 2:. Anatomie van het menselijke term placenta en weefsels die in deze procedure het eerste weefsel te geoogste maternale decidua. Decidua is weefsel dat blijft een dunne laag op het oppervlak van de placenta na het vergoten van de baarmoederwand (decidua wordt met de groene markeringen). Het tweede weefsel dat uit het inwendige van de placenta wordt geoogst is de foetale vlokken (blauwe markeringen). Het derde weefsel worden geoogst is foetale chorionic plaat (rode markeringen) (aangepast uit referentie 36). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Morfologie van culturen 48 uur na isolatie en hergebruikverplaatsen van de weefselafval. (A) Het uiterlijk van de kweeksupernatant kan aanzienlijk variëren placenta donoren vóór het wassen van de vuil. Voorbeeld culturen 1 en 2 tonen deze variatie. Deze twee isolaties werden gelijktijdig uitgevoerd, maar uit twee verschillende placenta. Eenmaal gewassen culturen vrij van erytrocyten en weefselafval zoals getoond in voorbeeld 3. De resultaten daaropvolgende expansie globaal overeen. (B) Na de 48 uur media-uitwisseling, zal slechts een paar cellen aan de kolf worden bevestigd. Schaal bar = 200 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4:. Morfologie van MSC culturen in de tijd (A) Zeven dagen na isolatie, kleine fibroblastic MSC kolonies zichtbaar hoewel niet-MSC cellen aanwezig als ronde of losjes verbonden cellen is. (B) 13 dagen na isolatie, fibroblasten MSC kolonies groot en vaak monolaag van confluente MSC is en klaar voor passage. (C) van passage 2 verder, heeft de MSC monolaag een whirlpool karakteristieke morfologie bij confluentie ontwikkelen. Schaal bar = 200 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5:. MSC karakterisatie van flowcytometrie en endodermale differentiatie (A) De placenta chorion-villi afgeleide MSC vertonen een klassieke MSC merkerprofiel middels flowcytometrieanalyse, hoewel voor deze celoppervlak markers, expresSion is gelijk voor alle soorten van de menselijke MSC. Elk histogram toont de signaalintensiteit (x-as) versus de genormaliseerde cellen op de y-as (% Max). In deze set representatieve gegevens waren de cellen positief voor CD73, CD105 en CD44, en negatief voor de hematopoietische markers CD45 en CD34 en HLA-DR. (B) Placenta MSC algemeen ondergaan robuuste osteogene differentiatie echter (C) adipogene differentiatie minder efficiënt beenmerg afgeleide MSC zijn. Afbeeldingen in onderschriften B en C werden genomen bij 40x vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Placenta MSC zijn maternale oorsprong met deze methode van cultuur, ondanks de anatomische locatie van het uitgangsmateriaal.De grafieken tonen kwantificering van de foetus (man, XY) en de moeder (vrouwelijke, XX) cel samenstelling van de placenta MSC culturen geïsoleerd van deciduale, vlokken en chorionic plaat weefsels bij elke tweede doorgang. Moederlijke cellen (XX) snel en reproduceerbaar te nemen over de culturen afkomstig van de foetale chorionic weefsels. Foetale = male = XY chromosomen aangetroffen in een individuele cel, de moeder = female = XX chromosomen aangetroffen in een individuele cel. Hier gepresenteerde gegevens was van N = 3 onafhankelijke donor placenta van mannelijke baby's, met een minimum van 100 cellen gekleurd voor XY FISH en geteld voor elk meetpunt. Bars vertegenwoordigen gemiddelden en error bars weerspiegelen één standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

De placenta is een fysiek groot fetomaternal orgel, waaruit foetale of maternale MSC kan worden geïsoleerd 22. Hierin, op voorwaarde dat we een gedetailleerd overzicht van de placenta anatomie en instructie over hoe om specifiek te ontleden decidua (de moeder), vlokken (de foetus), en chorionic plaat (de foetus) weefsel (Stap 2,2-2,4). Vervolgens beschreven we een robuuste protocol dat MSC isolatie mogelijk maakt van elk van deze drie weefsels (stap 2,5-2,6). Placenta MSC uitbreiding efficiënt en culturen lijken op beenmerg afgeleide MSC kweken (figuren 3 en 4). Osteogene differentiatie betrouwbaar (figuur 5B), terwijl adipogene differentiatie algemeen minder efficiënt (Figuur 5C) 5.

Veel nieuwkomers in het veld zal veronderstellen dat culturen afkomstig van foetale chorionvlokken of chorionic plaat weefsels zal worden verrijkt voor foetale MSC. Echter, in onze handen feTal celverrijking slechts voorbijgaand als standaard MSC groei medium zoals DMEM-LG + 10% FBS gebruikt 5. Hier bieden we representatieve resultaten met behulp van placenta weefsel afkomstig van een mannelijke baby. Door het gebruik van placenta weefsel van een mannelijke baby, de foetale cellen zijn direct herkenbaar als zijnde XY-chromosomen, terwijl de moederlijke cellen identificeerbaar zijn als het hebben van XX-chromosomen. Figuur 6 toont XY FISH resultaten voor een representatieve cultuur. Terwijl foetale MSC (XY) zijn verrijkt (tot 80%) in de aanvankelijke cultures afgeleid van foetaal chorion villi of chorionic plaat weefsels, worden deze zelfde kweken snel ingehaald (~ 100%) van de moeder (XX) MSC via eerste twee passages . In standaard medium, bestaande uit DMEM-LG + 10% FBS, het aantal maternale afgeleide MSC dat verontreinigen foetale weefsels outcompete de foetale-afgeleide cellen in kweek.

Een kritische stap beschreven in dit protocol is een appreciatie van de placenta anatomie en van waar de foetusen moederlijke weefsel kan het meest effectief worden geoogst. Zoals uiteengezet in de resultaten representatief gedeelte, betekent dissectie van foetaal weefsel in staat transiënte verrijking voor foetale afgeleide MSC. Verbeteringen in de uitbreiding medium formulering, door middel van specifieke exogene groeifactor medium suppletie moet selectieve uitbreiding van de foetale-afgeleide MSC bevolkingsgroepen mogelijk te maken, en de vervaardiging van een cel product dat is verrijkt voor foetale plaats van moederlijke cellen (onze groep is momenteel de ontwikkeling van een dergelijk medium formuleringen). De vervaardiging van foetale MSC populaties kan een aantal voordelen, zoals foetale MSC beweerd grotere angiogenese en immunosuppressieve eigenschappen dan vergelijkbare maternale MSC populaties 37 hebben.

In elk van de beschreven isolatie protocollen gebruikten we ongeveer 10 g weefsel. Een hele placenta is typisch 500-750 g, en in eerder werk hebben we aangetoond dat door middel van geautomatiseerde weefsel digest en een mobiele uitbreiding bioreactor procsen dat het mogelijk moet zijn dan 7000 klinische celdoses vervaardigen uit één placenta 4. Deze cijfers wijzen op de mogelijke geschiktheid van placenta-afgeleide MSC in allogene MSC therapieën, en de betekenis van deze methode ongeacht MSC oorsprong (de foetus of de moeder). Vanuit therapeutisch oogpunt is het zeer belangrijk dat gebruikers een volledig begrip van de cel product en het vermogen om betrouwbaar vervaardigen deze cel product. Wij hopen dat onze video onderzoekers zal helpen om placenta anatomie te begrijpen, te isoleren MSC uit placenta, en te anticiperen op de mogelijke foetale of maternale cel samenstelling van hun culturen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

RP werd ondersteund door een National Health en Medical Research Council (NHMRC) Postdocopleiding Fellowship. VS werd ondersteund door een universiteit van Queensland International Postgraduate Student beurs. MRD werd gesteund door de NHMRC en Inner Wheel Australië.

Wij danken de klinische en verplegend personeel om te helpen bij toestemming van de patiënt en monstername. Wij danken Prof. Nickolas Fisk, Prof. Kerry Atkinson en dr Rohan Lourie voor inzichtelijke discussies in de verloskunde, foetale-ontwikkeling van de placenta en de placenta anatomie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagenten
HBSSGibco/Invitrogen14185-052Lange naam: Hanks Balanced Salt Solution
FBSGibco/InvitrogenLange naam: Fetal Bovine Serum
trypsin-substituutGibco/Invitrogen12563-029Lange naam: TrypLE Select
DMEM-LGGibco/Invitrogen11885-092Lange naam: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-Low Glucose
DMEM-HGGibco/Invitrogen11965118Lange naam: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4,5 g/L)
PBS (Mg+Ca+ vrij)Gibco/Invitrogen14190-250Lange naam: Dulbecco's Phosphate buffered saline, magnesium en calcium vrij
Anti- anti-Gibco/Invitrogen15240-062Lange naam: antibiotic-antimycotic oplossing x100
paraformaldehyde poeder of 4% oplossingelke 
Collagenase IInvitrogen17100-017 2.500 U/ml
Dnase ISigmaD502510 mg/ml in  0,15 M NaCl
DispaseInvitrogen17105-041 10 mg/ml in water (20.000 U/ml).
MateriaalBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Disposible:
50 ml centrifugeerbuizenFalcon of elk merk
petrischalen, steriele kunststof (25 cm en 10 cm diameter)Nunc
Cell strainers (100 μm)Becton Dickinson352340
175 en 75 cm2 (T175 en T75) weefselkweekkolvenNunc
5 ml, 10 ml, 25 ml steriele serologische pipettenelk merk
MateriaalBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Apparatuur:
 Centrifuge  
 weefselkweekincubator 37 °C, 5% CO2
Biologische veiligheidscabinet
 Steriele scharen en pincetten
Buisjeshouders 
Pipette-boy of gelijkwaardig
Gilson type pipetten en steriele tips 1.000 µl, 200 µl, 20 µl.
schuddende of schuddende incubator (37 °C)
persoonlijk beschermingsmateriaal
reinigingsoplossingen (geschikt voor bloed)
afvalcontainers, juiste afvoerbakken voor weefsel/bloed
Reagentia voor MSC-karakterisering
Antilichaam (Clone ID)FabrikantCatalogusnr.Isotype
CD73 (AD2)Miltenyi Biotec130-095-183Muis IgG1
CD105 (43A4E1)Miltenyi Biotec130-094-941Muis IgG1
CD90/Thy-1 (AC122)Miltenyi Biotec130-095-403Muis IgG1
CD45 (5B1)Miltenyi Biotec130-080-202Muis IgG2a
CD34 (AC136)Miltenyi Biotec130-090-954Muis IgG2a
HLA-DR (AC122)Miltenyi Biotec130-095-298Muis IgG2a
CD31 (PECAM-1)BD Pharmingen555446Muis IgG1
CD146 (541-10B2)Miltenyi Biotec130-092-849Muis IgG1
CD44 (DB105)Miltenyi Biotec130-095-180Muis IgG1
Isotype-controles (Clone ID)FabrikantCatalogusnr.
Muis IgG1 Isotype (IS5-21F5)Miltenyi Biotec130-092-214
Muis IgG1 Isotype (IS5-21F5)Miltenyi Biotec130-092-212
Muis IgG1 Isotype (IS5-21F5)Miltenyi Biotec130-092-213
Muis IgG2a (S43.10)Miltenyi Biotec130-091-837
Muis IgG2a (S43.10)Miltenyi Biotec130-098-849
MACS-bufferMiltenyi Biotec130-091-221
Osteogene differentiatieFabrikantCatalogusnr.
DMEM-HGGibco/Invitrogen11965118Lange naam: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4,5 g/L)
FBSGibco/InvitrogenLange naam: Fetal Bovine Serum
Anti- anti-Gibco/Invitrogen15240-062Lange naam: antibiotic-antimycotic oplossing x100
DexamethasonSigmaD4902
β-Glycerol Phophate

Referenties

  1. Brooke, G., et al. Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells. Semin Cell dev Biol. 18, 846-858 (2007).
  2. Wei, X., et al. Mesenchymal stem cells: a new trend for cell therapy. Acta Phamacol Sin. 34, 747-754 (2013).
  3. Ma, S., et al. Immunobiology of mesenchymal stem cells. Cell Death Differ. 21, 216-225 (2014).
  4. Timmins, N. E., et al. Closed system isolation and scalable expansion of human placental mesenchymal stem cells. Biotechnol Bioeng. 109, 1817-1826 (2012).
  5. Barlow, S., et al. Comparison of human placenta- and bone marrow-derived multipotent mesenchymal stem cells. Stem Cell Dev. 17, 1095-1107 (2008).
  6. Jones, B. J., Brooke, G., Atkinson, K., McTaggart, S. J. Immunosuppression by placental indoleamine 2,3-dioxygenase: a role for mesenchymal stem cells. Placenta. 28, 1174-1181 (2007).
  7. Parolini, O., et al. Toward cell therapy using placenta-derived cells: disease mechanisms, cell biology, preclinical studies, and regulatory aspects at the round table. Stem Cell Dev. 19, 143-154 (2010).
  8. Benirschke, K., Burton, G. J., Baergen, R. N. Pathology of the Human Placenta. , 6 edn (2012).
  9. Moore, K., Persaud, T., Torchia, M. The developing human: clinically oriented embryology. , Elsevier/ Saunders. (2013).
  10. Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem cells. 26, 300-311 (2008).
  11. Brooke, G., et al. Manufacturing of human placenta-derived mesenchymal stem cells for clinical trials. Brit J Haematol. 144, 571-579 (2009).
  12. Pelekanos, R. A., et al. Intracellular trafficking and endocytosis of CXCR4 in fetal mesenchymal stem/stromal cells. BMC cell biology. 15, 15(2014).
  13. Chen, Y. S., et al. Small molecule mesengenic induction of human induced pluripotent stem cells to generate mesenchymal stem/stromal cells. Stem Cells Transl Med. 1, 83-95 (2012).
  14. Heazlewood, C. F., et al. High incidence of contaminating maternal cell overgrowth in human placental mesenchymal stem/stromal cell cultures: a systematic review. Stem Cells Transl Med. 3, 1305-1311 (2014).
  15. Horn, P., Bork, S., Wagner, W. Standardized isolation of human mesenchymal stromal cells with red blood cell lysis. Methods Mol Biol. 698, 23-35 (2011).
  16. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
  17. Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol. 2, 83-92 (1974).
  18. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9, 641-650 (1991).
  19. Futrega, K., et al. The microwell-mesh: A novel device and protocol for the high throughput manufacturing of cartilage microtissues. Biomaterials. 62, 1-12 (2015).
  20. Liu, Y., Goldberg, A. J., Dennis, J. E., Gronowicz, G. A., Kuhn, L. T. One-step derivation of mesenchymal stem cell (MSC)-like cells from human pluripotent stem cells on a fibrillar collagen coating. PloS one. 7, 33225(2012).
  21. Maleki, M., Ghanbarvand, F., Reza Behvarz, M., Ejtemaei, M., Ghadirkhomi, E. Comparison of mesenchymal stem cell markers in multiple human adult stem cells. Int J Stem Cell. 7, 118-126 (2014).
  22. Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12(2011).
  23. Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal stem cells: revisiting history, concepts, and assays. Cell stem cell. 2, 313-319 (2008).
  24. Bianco, P., et al. The meaning, the sense and the significance: translating the science of mesenchymal stem cells into medicine. Nature med. 19, 35-42 (2013).
  25. Da Silva Meirelles, L., Caplan, A. I., Nardi, N. B. In search of the in vivo identity of mesenchymal stem cells. Stem cells. 26, 2287-2299 (2008).
  26. Caplan, A. I., Correa, D. The MSC: an injury drugstore. Cell Stem Cell. 9, 11-15 (2011).
  27. Wegmeyer, H., et al. Mesenchymal Stromal Cell Characteristics Vary Depending on Their Origin. Stem Cell Dev. , (2013).
  28. Guillot, P. V., Gotherstrom, C., Chan, J., Kurata, H., Fisk, N. M. Human first-trimester fetal MSC express pluripotency markers and grow faster and have longer telomeres than adult MSC. Stem cells. 25, 646-654 (2007).
  29. Covas, D. T., et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts. Exp Hemol. 36, 642-654 (2008).
  30. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).
  31. Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem cell res. 8, 58-73 (2012).
  32. da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P. C., Nardi, N. B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 119, 2204-2213 (2006).
  33. James, A. W. Review of Signaling Pathways Governing MSC Osteogenic and Adipogenic Differentiation. Scientifica (Cairo). 2013, 684736(2013).
  34. Xu, C., et al. Cross-Talking between PPAR and WNT Signaling and Its Regulation in Mesenchymal Stem Cell Differentiation. Curr Stem Cell Res Ther. , (2015).
  35. Zhuang, H., et al. Molecular Mechanisms of PPAR-gamma Governing MSC Osteogenic and Adipogenic Differentiation. Curr Stem Cell Res Ther. , (2015).
  36. Moore, K., Persaud, T., Torchia, M. Before We Are Born: Essentials of Embryology and Birth Defects. , Elsevier Health Sciences. 8 edn (2011).
  37. Zhu, Y., et al. Placental mesenchymal stem cells of fetal and maternal origins demonstrate different therapeutic potentials. Stem Cell Res Ther. 5, 48(2014).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Mesenchymale stamcellencelisolatieweefselverteringflowcytometriecelkweekstromaal vasculairchorionvlokkendecidua weefselchorionplaat

Gerelateerde artikelen