Een methode voor het kweken van Drosophila melanogaster onder axenic en gnotobiotische voorwaarden wordt gepresenteerd. Fly embryo's worden dechorionated in natriumhypochloriet, aseptisch in steriele voeding en grootgebracht in gesloten containers. Inenten van voeding en embryo's met bacteriën leidt tot gnotobiotische verenigingen, en bacteriële aanwezigheid wordt bevestigd door plating whole-body Drosophila homogenaten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
De invloed van microben op talloze dierlijke eigenschappen en gedragingen is de afgelopen jaren steeds meer erkend. De fruitvlieg Drosophila melanogaster is een model voor het begrijpen van microbiële interacties met dierlijke gastheren, mogelijk gemaakt door benaderingen om grote monsters van Drosophila te kweken onder micro-organismevrije (axenische) omstandigheden, of met gedefinieerde microbiële gemeenschappen (gnotobiotische). Dit werk schetst een methode voor het verzamelen van Drosophila embryo's, dechorionatie en sterilisatie met hypochloriet, en overdracht naar steriel dieet. Gesteriliseerde embryo's worden overgebracht naar steriel dieet in 50 ml centrifugebuizen, en ontwikkelende larven en volwassenen blijven vrij van enige exogeen microben totdat de flesjes worden geopend. Als alternatief kunnen vliegen met een gedefinieerde microbiota worden grootgebracht door steriele voeding en embryo's te inoculeren met microbiële soorten van belang. We beschrijven de introductie van 4 bacteriesoorten om een representatieve gnotobiotische microbiota in Drosophila te vestigen. Ten slotte beschrijven we benaderingen voor het bevestigen van de samenstelling van de bacteriegemeenschap, inclusief het testen of axenische Drosophila bacterievrij blijven tot in de volwassenheid.
Inleiding
De meeste dieren zijn nauw verbonden met bacteriën ( 'microbiota') vanaf de geboorte tot de dood 1. Vergelijkingen van micro-organisme-vrij ( 'axenic') en micro-organisme geassocieerde ( 'conventionele') dieren hebben aangetoond microben invloed op diverse aspecten van de gezondheid van dieren, met inbegrip van metabole, nutritionele, bloedvaten, lever, respiratoire, immunologische, endocriene en neurologische functie 2. De fruitvlieg Drosophila melanogaster is een belangrijk model voor het begrijpen van vele van deze processen in de aanwezigheid van microben 3,4 en voor het bestuderen microbiota invlo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Cultuur Bacteriën (Start ~ 1 week voor Picking eieren)
- Bereid gemodificeerde MRS 20 (Mmrs) borden en bouillon buizen (tabel 1). Giet 20 ml Mmrs agar in elk 100 mm Petri plaat en laat het afkoelen / droog 's nachts, of 5 ml Mmrs bouillon in 18 mm reageerbuizen.
- Streak Acetobacter pomorum, A. tropicalis, Lactobacillus brevis, en L. plantarum op Mmrs agarplaten. Incubeer Acetobacter overnacht bij 30 ° C. Incubate Lactobacillus anaëroob door het plaatsen van de platen in een luchtdichte container en overstromingen met kooldioxide voor het afdichten. Incubeer bij ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Succesvolle opfok van axenic vliegen wordt bevestigd door isolatie van geen CFU's uit het hele lichaam homogenisaties van D. melanogaster volwassenen (figuur 1). Als alternatief, als de vergulde homogenaat levert kolonies, de flesjes zijn vervuild en moet worden weggegooid. Voor gnotobiotische vliegen, elk van de vier bacteriële isolaten werden geïsoleerd uit pools van 5 volwassen mannen, waaruit verschillen in de totale levensvatbare CFU's geassocieerd .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hier beschreven methode is een van de verschillende benaderingen voor het embryo dechorionation 8,11,18,25,26,27, samen met alternatieve houderijsystemen axenic vliegen, met inbegrip van seriële overdracht van axenic volwassenen 18,27 of een behandeling met antibiotica 13,18. Andere dechorionation methoden omvatten ethanol wast en verminderen 11,25,26 of uit te breiden 8 hypochloriet behandeling. Verschillende wasstappen kunnen helpen grootbrengen verschill.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Sommige details van dit protocol werden geoptimaliseerd met de hulp van Dr. Adam Dobson, die ook voorzien van nuttige opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de Stichting voor de National Institutes of Health (FNIH) subsidie nummer R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD, en AED). FNIH subsidie nummer 1F32GM099374-01 (PDN), en Brigham Young University opstarten fondsen (JMC, MLK, MV). Publicatiekosten werden gesteund door de Brigham Young University College van Life Sciences en het ministerie van Plant and Wildlife Sciences.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Brewer's Yeast | MP Biomedicals, LLC. | 903312 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312 |
| Glucose | Sigma Aldrich | 158968-3KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en®ion=US |
| Agar | Fisher--Lab Scientific | fly802010 | https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177 |
| Welch's 100% Grape Juice Concentrate | Walmart of andere supermarkt | 9116196 | http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406 |
| Translucent Round Deli Container (32 oz.) | Webstaurant Store | 999L5032Y | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html |
| Translucent Round Deli Container Lid | Webstaurant Store | 999YNL500 | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html |
| Voorraadflessen | Genesee Scientific | 32-130 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130 |
| Droso-Plugs | Genesee Scientific | 49-101 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101 |
| Nylon gaas | Genesee Scientific | 57-102 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102 |
| Kunststof bus | Home Depot | 100404002 | http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002 |
| Kunststof busdop | Home Depot | 100153897 | http://www.homedepot.com/p/1-1-4- in-Rigid-Plastic-Insulated-Bushing-2-Pack-27529/100153897 |
| Specimen Cup | MedSupply Partners | K01-207067 | http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html |
| 50 ml Centrifuge Tubes | TrueLine Centrifuge Tubes | TR2003 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003 |
| Voedseldozen | USA Scientific | 2316-5001 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001 |
| Lysing Matrix D Bulk | MP Biomedicals, LLC. | 116540434 | http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search |
| Filter Pipette Tips, 300 µl | USA Scientific | 1120-9810 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810 |
| Petri Dishes | Laboratory Product Sales | M089303 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303 |
| Ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2701 | http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88 |
| Schilderborstel | Walmart | 5133 | http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005 |
| Pincet | Fisher | 08-882 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693 |
| Huishoudbleek (6-8% hypochloriet) | Walmart | 550646751 | http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295 |
| Universal Peptone | Genesee Scientific | 20-260 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260 |
| Gist Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500 |
| Dikaliumfosfaat | Sigma Aldrich | P3786-1KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All& N=0&mode=match%20partialmax&lang= en®ion=US&focus=product |
| Ammonium Citraat | Sigma Aldrich | 25102-500g | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N =0&mode=match%20partialmax&lang= en®ion=US&focus=product |
| Natriumacetaat | VWR | 97061-994 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994 |
| Magnesiumsulfaat | Fisher Scientific | M63-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500 |
| Mangansulfaat | Sigma Aldrich | 10034-96-5 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match %20partialmax&lang=en®ion =US&focus=product |
| MRS-poeder | Sigma Aldrich | 69966-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product |
Referenties
- McFall-Ngai, M. J. Giving microbes their due--animal life in a microbially dominant world. J Exp Biol. 218, (Pt 12) 1968-1973 (2015).
- Smith, K., McCoy, K. D., Macpherson, A. J. Use of axenic animals in studying the adaptation of mammals to their co....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions
Posted by JoVE Editors on 8/18/2020. Citeable Link.
An erratum was issued for: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. The Protocol was updated.
Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:
If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).
to:
If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).
