Hoe om te studeren Basement Membrane stijfheid als biofysische Trigger bij prostaatkanker en andere Leeftijdsgebonden Pathologies of Metabole Ziekten

Samenvatting

Hier leggen we een protocol voor het modelleren van de biofysische micro-omgeving waar de verknoping en verhoogde stijfheid van het basaal membraan (BM) geïnduceerd door geavanceerde glycatie eindproducten (AGE's) heeft pathologische relevantie.

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol dat kan worden gebruikt om de biofysische micro verband met de toegenomen dikte en stijfheid van de basale membraan (BM) bij leeftijdsgebonden pathologieën en metabole stoornissen (zoals kanker, diabetes, microvasculaire ziekte, retinopathie, nefropathie en neuropathie) bestuderen . Het uitgangspunt van het model is niet-enzymatische verknoping van opgeloste BM (RBM) matrix door behandeling met glycolaldehyde (GLA) tot geavanceerde glycatie eindproduct (AGE) generatie te bevorderen via de Maillard-reactie. Voorbeelden van laboratoriumtechnieken die kunnen worden gebruikt om AGE generatie niet-enzymatische verknoping bevestigen en verhoogde stijfheid in GLA behandelde rBM geschetst. Deze omvatten bereiding van natief rBM (behandeling met fosfaat gebufferde zoutoplossing, PBS) en stijf rBM (behandeling met GLA) voor het bepalen van: een AGE gehalte in fotometrische analyse en immunofluorescentie microscopie, de niet-enzymatische verknoping door natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegelelektroforese (SDS PAGE) en confocale microscopie en de toegenomen stijfheid behulp reometrie. De hier beschreven procedure kan worden gebruikt om de stijfheid (elastische modulus, E) van rBM verhogen tot 3,2-voudige, in overeenstemming met metingen bij gezonde versus zieke menselijke prostaatweefsel. Om de biofysische micro-omgeving in verband met de vergrijzing en zieke prostaat recreëren klier drie prostaat celtypen werden geïntroduceerd aan inheemse rBM en stijf rBM: RWPE-1, prostaat epitheelcellen (PEC) afgeleid van een normale prostaat; BPH-1, PEC afgeleid van een prostaat die door goedaardige prostaathyperplasie (BPH); en PC3, metastatische cellen afkomstig van een secundaire beentumor afkomstig van prostaatkanker. Meerdere parameters kunnen worden gemeten, waaronder de grootte, vorm en invasieve eigenschappen van de 3D glandulaire acini gevormd door RWPE-1 en BPH-1 op inheemse versus stijf rBM en gemiddelde celgrootte lengte, migrerend snelheid en persistentie van celbeweging 3D kobaOIDs gevormd door PC3 cellen onder dezelfde omstandigheden. Cel signaalwegen en de subcellulaire lokalisatie van eiwitten kan ook worden beoordeeld.

Inleiding

De basement membraan (BM) is een laag van gespecialiseerde extracellulaire matrix (ECM) die stabiele weefselgrenzen handhaaft door lagen van epitheliale cellen te scheiden van het stroma¹. Covalente verknoping tussen aangrenzende drievoudige helices van collageen IV in de BM stabiliseert hun laterale associatie door een onregelmatig netwerk van supergedraaide helices te vormen². Deze collageen IV-rasters fungeren als een schakel voor de interactie met laminine en andere BM-componenten¹. De structurele opstelling van de BM verschaft het de mechanische sterkte en stijfheid die nodig zijn voor de normale ontwikkeling van glandulaire epitheel³.

Tijdens veroudering en ziekte wordt de BM progressief dikker en stijf^3,4. Bijvoorbeeld, een 3-voudige toename in de elastische modulus (E) van de oculair BM vindt plaats tussen de leeftijden van 50 en 80 in de normale populatie, en deze verstevigen wordt verder verergerd bij metabole stoornissen zoals diabetes⁵. De structurele en biomechanische veranderingen in de BM die resulteren in de verhoogde stijfheid, treden op wanneer de ECM-componenten, collageen IV en laminine, niet-enzymatisch worden verknoopt na hun blootstelling aan geavanceerde glycosylatie-eindproducten (AGEs).

Het doel van de hier beschreven methode was om een model op te stellen voor het onderzoek naar hoe BM-stijfheid, als gevolg van AGE-blootstelling, de invasiviteit van prostaatepitheelcellen (PEC) en prostaattumorcellen (PTC) bevordert in de context van de overgang naar metastaserend prostaatkanker (PCa). Hiervoor werd een eerdere methode die werd gebruikt voor het genereren van 3D-glandulaire acini uit mammaire epitheelcellen (MECs) in gereconstituteerde rBM-gels⁶ aangepast om een extra stap te omvatten waarbij de rBM-gels worden voorbehandeld met glycolaldehyde (GLA). Er worden verschillende technieken beschreven voor het beoordelen van GLA-geïnduceerde verknoping en verstevigen van voorbehandelde rBM-gels, inclusief fotometrische analyse, natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE), confocale microscopie en reometrische analyse. De prostaatceltypen die zijn geselecteerd voor kweek op de voorverstevigde rBM omvatten: RWPE-1, PECs afkomstig van een normale prostaatklier⁷; BPH-1, PECs afkomstig van een prostaatklier aangetast door BPH⁸; en PC3, metastaserende PTCs afkomstig van een secundaire tumor in het wervelbeen van een patiënt met prostaatkanker (PCa)⁹.

Naast het bevorderen van de studie van pathologie van de prostaatklier, kan het protocol voor het verstevigen van rBM-gels door behandeling met GLA worden aangepast om te onderzoeken hoe BM-stijfheid bijdraagt aan andere leeftijdsgerelateerde pathologieën en metabole stoornissen. Bijvoorbeeld, het model kan direct worden toegepast om te onderzoeken hoe metastaserend kanker wordt geïnduceerd door BM-stijfheid in organen zoals de borst, dikke darm, eierstokken en pancreas door de incorporatie van geschikte celtypen. Verder kan het protocol worden aangepast om te onderzoeken hoe stijve BM biomechanische mechanismen van ziekteprogressie bevordert bij diabetes-gerelateerde microvasculaire ziekte, retinopathie, nefropathie en neuropathie.

Protocol

1. Inductie van BM stijfheid GLA geïnduceerd door behandeling (niet-enzymatische Crosslinking)

1. Ontdooi een bevroren flacon BM matrix (10 ml) door incubatie bij 4 ° C (op ijs in een koude kamer of koelkast) totdat de inhoud van het flesje geworden vloeistof (8-16 uur).
   Let op: Als een koude ruimte / koelkast niet wordt gebruikt, hebben betrekking op de hele fles met ijs. Hiermee wordt voorkomen dat de voorraad oplossing van BM stollen.
2. Voor toekomstige experimenten en herhaalde vries dooi cycli te voorkomen, voorbereiden 25 x 0,4 ml porties van elk nieuw 10 ml flacon van BM matrix. flacons Bewaren bij -80 ° C tot de vervaldatum aangegeven door de fabrikant. Wanneer nodig, flacons ontdooien bij 4 ° C staan ​​op ijs gedurende 2 uur.
3. Bereid een vlakke ondergrond van ijs. Plaats een 8-well kamer glasplaatje bovenop het ijs tot een temperatuur van 4 ° C tijdens de bekledingswerkwijze te handhaven. Dooi een flacon BM matrix bij 4 ° C.
   Opmerking: Een 0,4 ml flacon van BM matrix is ​​voldoende om coat een hele 1 x 8-well kamer dia. De flacon bedekt met ijs tijdens het hanteren om te voorkomen dat de BM matrix stollen.
4. Snijd de afgifte einde van een 200 ul pipetpunt met een schaar. Koel de stompe 200 ul pipetpunt tot 4 ° C en plaats het op een 200 ul capaciteit pipetteren hulp. Neem 40 pi van de koude BM matrix oplossing in de pipet en over te dragen in een goed op de gekoelde 8-well kamer glasplaatje.
   Opmerking: 40 pl BM oplossing is voldoende om een oppervlak van 0,8 ^cm2 omvatten. Houd pipetpunten gekoeld tijdens de bekledingsprocedure om stolling van het BM oplossing voorkomen. Geen luchtbellen te introduceren in de BM matrixoplossing en zorgen voor goed gelijkmatig bedekt zonder de vorming van een meniscus zichtbaar aan de randen.
5. Herhaal stap 1,4 volgens het aantal putten en kamers nodig.
6. Na het bekleden, plaats de 8-well kamer dia bij 37 ° C gedurende 30 minuten om de polymerisatie te bevorderenvan de BM. Sluit de incubator deur zeer zorgvuldig om ongewenste verstoring van de vloeistof rBM voorkomen. Niet meer dan de 30 min incubatietijd om uitdroging van de RBM gel te vermijden.
   Opmerking: De resulterende gel is de inheemse opgelost BM (RBM). De 37 ° C incubatiestap vereist geen _5% CO2. Echter, voor het gemak uitvoeren van deze stap in een weefselkweek incubator ingesteld op 37 ° C en 5% CO ₂ (met bevochtiging).
7. Bereid 50 mM glycolaldehyde (GLA) verdund in 0,2 M fosfaatbuffer (pH 7,8). Steriliseer de oplossing door deze door een 0,22 micron spuitfilter met behulp van een 50 ml spuit.
   1. Een verknopingsreactie in een eindvolume van 250 pl 50 mM GLA, voeg 25 ul van 0,5 M natriumcyaanboorhydride of 2,5 M aminoguanidine aan 125 gl 100 mM GLA (2x) en per 100 gl 0,2 M fosfaatbuffer (pH 7,8 ). Steriliseer de stamoplossingen door hen te passeren door een 0,22 micron spuit filter met behulp van een 50 ml spuit.
      Let op: Hanteer natriumcyaanboorhydride het dragen van een laboratoriumjas, handschoenen, faceshield en ademhalingsapparaat tijdens het werken in een zuurkast.
8. Voeg 250 ul van GLA oplossing van het gepolymeriseerde rBM gel te bedekken en incubeer bij 37 ° C gedurende 6 uur tot een semi-stijve rBM gel of 14 uur een stijve gel rBM produceren.
   Opmerking: Het volume van de GLA toegevoegd, moet de gepolymeriseerde rBM gel bedekken en moeten dienovereenkomstig worden aangepast. Als verschillende GLA incubatietijden worden gebruikt, moet de rBM gels worden geanalyseerd om de vouw-verhoging rBM stijfheid te bepalen (zie stap 2.4).
   1. Bereid een negatieve controle door het incuberen van een natief rBM gel in 250 gl steriel met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 14 uur bij 37 ° C.
   2. Bereid twee aanvullende controles waarbij de vorming van de Schiffse base of adduct Amadori herschikking tijdens de verknopingsreactie worden geremd door de toevoeging van 50 mM natriumcyaanboorhydride of 250 mM aminoguanidine.
9. Bereid 1 M glycine ethyl ester (GEE) verdund in PBS. Steriliseer de oplossing door deze door een 0,22 micron spuitfilter met behulp van een 50 ml spuit.
10. Na de aangegeven incubatietijd, aandachtig de GLA-oplossing van de verknoopte rBM gels verwijderen, GLA oplossing die remmers van de controle rBM gels en PBS via het bedieningspaneel inheemse rBM gels. Voeg 250 ul van GEE oplossing voor alle rBM gels en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
    Opmerking: Deze stap lest de verknopingsreactie.
11. Was alle rBM gels 10 keer in 500 pl PBS om alle sporen van GLA en GEE verwijderen. Incubeer de rBM gels nacht bij 37 ° C in 400 pl PBS om uitdroging te voorkomen.
    1. Analyseer de rBM gels AGE accumulatie, niet-enzymatische verknoping en visco-elastische eigenschappen (Stappen 2,1-2,4). Voor reometrische analyse van hun visco-elastische eigenschappen te bereiden de rBM gels in klonen ringen (Stap 2.4).
    2. Voor celcultuur afspoelen rBM gels 2 maal met 500 ul cultuur media voor het zaaien van de cellen (Stappen 5 en 6). Voer wast zachtjes zonder de pipetpunt aanraken van het gel oppervlak.

2. Kwantificering van niet-enzymatische verknoping en stijfheid van rBM Behandeld met GLA

1. fotometrische Analyse
   1. Meet AGE accumulatie in GLA-behandelde en controle rBM gels met behulp van fotometrische analyse om te bepalen de omvang van de Maillard-reactie.
      1. Na Step 1.11, verwijder de PBS uit rBM gels in de 8-wells kamer dia's en voeg 250 ul ijskoud dubbel gedestilleerd water. Incubeer bij 4 ° C gedurende 16-24 uur zodat de matrix volledig vloeibaar.
         Opmerking: rBM peptiden in deze oplossing bevatten AGEs met auto-fluorescerende eigenschappen.
      2. Breng de vloeibare BM oplossing een 1,5 ml buis en meet de fluorescentie-emissie van de oplossing met een spectrofotometer (excitatie golflengte = 370 nm, emissiegolflengte = 440 nm).
2. SDS-PAGE analyse van cyanogeenbromide peptiden
   1. Los het GLA behandelde en controle rBM gels op een polyacrylamidegel om te bevestigen dat GLA verknoping en vorming van macro-vezels heeft veroorzaakt.
      1. Centrifugeer de vloeibaar BM oplossing verzameld in stap 2.1.1.2 bij 10.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      2. Bereid een voorraadoplossing van 2 g / ml cyanogeenbromide verdund in acetonitril.
         Let op: Behandel cyanogeenbromide in een zuurkast terwijl het dragen van een laboratoriumjas, handschoenen, faceshield en gasmasker.
      3. Verwijder het supernatant, resuspendeer de BM gel pellet in 500 ui van 20 mg / ml cyanogeenbromide + 70% v / v mierenzuur en incubeer overnacht bij kamertemperatuur.
      4. Gebruik een 1 ml wegwerpspuit met de geresuspendeerde pellet BM gel over in een dialyse cassette met een molecuulgewicht uit 3,5 kDa.
      5. Dompel de cassette in een 500 ml glazen beker met 500 ml dubbel gedestilleerd water en een magnetische roerstaaf.Plaats dit op een magnetische roerder en dialyseer gedurende de nacht (16 uur) bij 4 ° C (in een koude kamer) om alle sporen van cyanogeenbromide en mierezuur verwijderen.
      6. Gebruik een 1 ml wegwerpspuit de BM gedialyseerde oplossing uit de cassette over in een 1,5 ml buis.
      7. Analyse 25 pl van elk monster BM op een 12% v / v polyacrylamidegel ^10,11. Na SDS-PAGE, voert zilverkleuring van de polyacrylamide gel ¹² op het elektroforetisch patroon van cyanogeenbromide peptiden matrix ¹³ visualiseren.
3. Immunofluorescentie Microscopy Analyse
   1. Voer immunofluorescentie kleuring van GLA behandelde en controle rBM gels met anti-AGE / pentosidine, anti-collageen IV en anti-laminine-antilichamen gevolgd door confocale microscopie om geaccumuleerde AGE en collageen IV / laminine fiber structurele herschikkingen te visualiseren in de verknoopte rBM gels ^13.
      Let op: Gebruik altijd een voldoende volume om de enti dekkenre rBM gel tijdens incubaties en wast zonder het aanraken van de RBM-oppervlak met de pipet tip. Voor meer informatie over het analyseren van 3D acini culturen door immunofluorescentie zie referentie ⁶ en voor confocale microscopie van 3D acini zie referentie ^14.
      1. Wassen GLA behandelde en controle rBM gels 8-putjes objectglaasjes kamer 2 maal met 300 pi PBS + (PBS dat 0,1 mM _CaCl2 en 0,5 mM _MgCl2) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      2. Verwijder de PBS + voeg 300 ul van 4% w / v paraformaldehyde (PFA) verdund in PBS + elke rBM gel omvatten. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om de rBM componenten op te lossen.
      3. Verwijder de 4% w / v oplossing PFA. Voeg voeg 300 ul van 75 mM _NH4 Cl + 0,5 mM _{MgCl2-oplossing} en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (herhalen 5x) om de fixatie te blussen.
      4. Bereid Immunofluorescentie buffer (IF buffer) door de volgende oplossing in steriel water: 130 mM NaCl, 7 mM Na ₂ HPO _4, 3,5 mM NaH₂ PO _4, 7,7 mM _NaN3, 0,1% w / v runderserumalbumine, 0,5% v / v polyethyleen glycol tert-octylfenyl ether en 0,05% v / v polyethyleen glycol sorbitan monolauraat.
      5. Bereid IF blokkerende buffer door aanvulling IF-buffer met 20% v / v geit serum.
      6. Verwijder het blussen oplossing en voeg 300 ul van IF blokkeerbuffer de rBM gels niet-specifieke reacties te voorkomen. Incubeer 2 uur bij KT op een schuddend platform.
      7. Verwijder de IF blokkeerbuffer en incubeer de rBM gels 16 uur bij 4 ° C met 300 gl primair antilichaam verdund in blokkerende buffer IF (1: 500 anti-muis mAb pentosidine; 1/250 konijnen anti-collageen IV pAb; 1 / 250 konijnen anti-laminine A / C pAb).
         Opmerking: Incubaties langer dan 20 uur bij 4 ° C kan de rBM liquidize.
      8. Verwijder het primaire antilichaam en was 3 keer (10 minuten elk) met 300 pl IF-buffer bij kamertemperatuur op een schuddend platform.
      9. Verwijder de IF-buffer envoeg 300 ul van het secundaire antilichaam (geit anti-konijn of anti-muis IgG [H + L]) geconjugeerd met een fluorochroom verdund 1: 500 in blokkerende buffer IF. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op een schuddend platform.
      10. Verwijder het secundaire antilichaam en geïncubeerd in 300 pl IF buffer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de IF-buffer en was 3 x 10 min in 300 pl PBS + op kamertemperatuur.
      11. Fix en lessen voor de tweede keer, zoals hierboven (Stappen 2.3.1.2 en 2.3.1.3) beschreven.
      12. Monteer lood rBM gels in de montage media en analyseren van de vorming van dichte bundels van de belangrijkste onderdelen met behulp van epifluorescerende of confocale microscopie.
          Opmerking: Voor meer informatie over het analyseren van 3D acini culturen door immunofluorescentie zie referentie ⁶ en voor epifluorescerende en confocale microscopie van 3D acini zie referentie ^14.
4. reologische Analyse
   1. Voer reometrische analyse van GLA behandelde en controle rBM gels om hun v meteniscoelasticity (stijfheid).
      1. Opgericht rBM gels die 1 mm in een ronde mal met een diameter van 8 mm. Om dit te doen, plaatst u een klonen ring (8 mm diameter) in een putje van een 24-well cultuur plaat en voeg BM matrix oplossing bereid zoals beschreven in de stappen 1,3-1,6.
         Opmerking: Voor een nauwkeurige herhaling van de RBM gels gebruikt voor experimenten, de rBM gels voorbereid reometrische analyse moeten dezelfde oppervlakte en dikte als de rBM gels opgericht in het 8-well kamers hebben. De rBM gelen in Figuur 3 werden geanalyseerd 1 mm dik en 8 mm in diameter.
      2. Behandel de rBM gels opgericht in de kloneringsringen met PBS, GLA 6 uur en GLA voor 14 uur zoals hierboven (stap 1,8-1,11) beschreven.
      3. Meet de elasticiteitsmodulus (E) van de 8 mm diameter rBM gels op een reometer met een parallelle plaat 8 mm getand geometrie, een bereik van 1-3% rek, met een vaste frequentie oscillatie van 1Hz en temperatuur van 21 ° C. Voor meer informatie over dereometrische analyse van ECM gels zie referenties zie referentie ^13,15,16.
         Opmerking: E wordt bepaald uit de resulterende afschuiving opslagmodulus (G ') door middel van de volgende vergelijking E = 2 * G * (1 + v) waarbij v de verhouding van Poisson 0,5, zoals beschreven in referentie ^{13,15 , 16.}

3. Cultuur en Behandeling van de Normal PEC lijn, RWPE-1

1. Grow RWPE-1 cellen in keratinocyt serum-vrij medium (KSFM), aangevuld met 5 ng / ml epidermale groeifactor (EGF), 50 ug / ml runderhypofyse-extract (BPE) en 50 U / ml penicilline 50 ug / ml streptomycine ( voltooien KSFM).
   Opmerking: Om de inductie van epitheliale-to-mesenchymale voorkomen (EMT) -achtige overgang niet RWPE-1-cellen bloot te stellen aan serum. Bieden volledige KSFM tot kamertemperatuur komen gedurende 30 minuten na verwijdering uit opslag bij 4 ° C en niet warm in een 37 ° C waterbad omdat dit de EGF en BPE zal inactiveren.
2. Zuig de volledigeKSFM van een confluente 10 cm ² bord RWPE-1 cellen, spoelen met 5 ml voorverwarmde PBS en voeg 5 ml 0,05% v / v trypsine die op cellen zijn bedekt met de oplossing.
   1. Plaats de cellen in een weefselkweek incubator ingesteld op standaardcondities van 37 ° C en 5% CO ₂ (met bevochtiging) gedurende 5 tot 10 minuten. Controleer de omvang van de behandeling met trypsine na 5 min en tik voorzichtig de cultuur plaat om de cellen los.
      Opmerking: RWPE-1 cellen niet langdurig trypsine tolereren Dus is het raadzaam meer dan twee platen niet omgaan tegelijk. Het is ook belangrijk om alle cellen te scheiden van de plaat klonale selectie voorkomen.
3. Wanneer alle RWPE-1 cellen gedissocieerd, voeg 5 ml warm PBS dat 2% v / v foetaal kalfsserum (FCS) om de trypsine te lessen. Voorzichtig pipet op en neer te breken van de cel aggregaten voor het overbrengen van de cellen naar een centrifugebuis.
4. Centrifugeer de cellen los van elkaar op 125-150 xg gedurende 5 minuten bij 25 ° C, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet van cellen in 5 ml compleet KSFM tot een suspensie van afzonderlijke cellen is verkregen.
5. Breng 1 ml van de geresuspendeerde cellen in een nieuwe buis en voeg 9 ml volledig KSFM aan de cellen propageren bij een 1: 5 verdunning passage voor verdere experimenten gebruikt. Tel de rest van de cellen met een hemocytometer voor het instellen acini (zie paragraaf 5.1).
   Let op: Niet cultuur RWPE-1-cellen voor meer dan 10 passages want na langere perioden van de cultuur ze niet acini met de juiste architectuur te vormen.
6. Verander het kweekmedium elke 48 uur om ervoor te zorgen de EGF en BPE actief blijven.
   Opmerking:: Dit medium verandering voor alle behandelingen die verder reiken dan 48 uur.

4. Cultuur en Behandeling van de BPH Cell Line, BPH-1

1. Cultuur BPH-1 cellen in RPMI 1640 medium aangevuld met 5% v / v FCS, 50 U / ml penicilline en 50 ug / ml streptomycine. Verwarm dekweekmedia PBS en 0,25% w / v trypsine-EDTA 0,53 M oplossing van 37 ° C voor gebruik.
   Opmerking: Cellen kunnen ook in media worden gekweekt met 2,5% v / v FCS ^8.
2. Zuig het kweekmedium van een confluente 10 cm ² plaat van BPH-1 cellen en was de cellen 2 x met 3 ml PBS om alle sporen van kweekmedia met serum dat trypsine reactie kan blussen verwijderen.
3. Zuig het PBS en voeg 3 ml trypsine-EDTA-oplossing om de cellen te dekken. Plaats de plaat in een incubator ingesteld op 37 ° C en 5% CO ₂ (met bevochtiging) gedurende 5 min. Verwijder de trypsine-EDTA-oplossing wanneer de cellen zijn rond maar blijven aan de schotel. Was de cellen met 5 ml PBS.
4. Na verwijdering van het PBS, voeg 5 ml kweekmedium en voorzichtig pipet op en neer om een ​​suspensie van afzonderlijke cellen. Overdracht van de cellen om een ​​15 ml buis.
5. Neem 2 ml van de celsuspensie in een nieuwe centrifugebuis met 8 ml compleet medium en plaat de BPH-1 cellen ontoa 10 cm ² cultuur plaat bij een 1: 5 passage verwatering voor latere experimenteel gebruik. Tel de rest van de cellen met een hemocytometer voor het instellen acini (zie paragraaf 5.2).
   Opmerking: Houd een verslag van de passage nummer, aangezien oudere BPH-1 cellen acini met een goede architectuur vormen. Een passage nummer meer dan 10 is niet gewenst.
6. Verander het kweekmedium elke 72 uur.

5. 3D-cultuur van de Prostaat Acini op inheemse en stijf rBM

1. Als RWPE-1-cellen worden gebruikt om acini gevormd, verdun 5000 cellen bereid in stap 3.5 in 300 gl compleet KSFM aangevuld met 2% v / v oplossing van BM.
2. Als BPH-1 cellen worden gebruikt om acini gevormd, verdun 2500 cellen bereid in stap 4.5 in 300 ul RPMI 1640 kweekmedium aangevuld met 2% v / v oplossing van BM.
   Opmerking: BPH-1 cellen zijn groter dan RWPE-1 cellen, zodat het kleiner aantal BPH-1 cellen worden gebruikt om een ​​vergelijkbare verdeling van acini verkregen na 6 dagen cultuur.
3. Voorzichtig zaad de cellen op de natieve en AGE verstijfde rBM en plaats voorzichtig het kweken in een incubator ingesteld op 37 ° C en 5% CO ₂ (met bevochtiging) om een gelijkmatige verdeling van het kweken acini in de put en dat elke cel deelt een acina produceren.
4. Elke 2 dagen vervangen kweekmedium vers kweekmedium met 2% v / v BM oplossing zodat de cellen groeifactoren vereist voor normaal acina homeostase.
5. Monitor acinar morfologie in groeiende kweken met behulp van helderveld microscopie ^13.
   Opmerking: na 3 dagen in cultuur afzonderlijke cellen van een cluster van> 3 cellen vormen en na 1 week prostaatklier acini met een diameter van ~ 50 urn worden waargenomen.
6. Volg protocol in 2.3 beschreven immunofluorescentie uit te voeren met behulp van antilichamen die specifiek zijn voor markers van cel-matrix adhesies, cel-cel adhesie, apico-basale polariteit en invasiviteit ^13.
   1. Gebruik een montage media met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) of beschikken over een extra stap (na 2.3.12) naar celkernen vlek door incubatie met DAPI gedurende 5 minuten en was 2 x 5 min met PBS +.

6. 3D-cultuur van de prostaattumor Cell Aggregaten op inheemse en stijf rBM

1. Cultuur PC3 cellen in RPMI 1640 medium dat 10% v / v FCS en 50 U / ml penicilline 50 ug / ml streptomycine. Verwarm de kweekmedia PBS en 0,25% w / v trypsine-EDTA 0,53 M oplossing van 37 ° C voor gebruik.
2. Zuig het kweekmedium van een confluente 10 cm ² kweekschaal van PC3 cellen en was de cellen 2x met 3 ml PBS om alle sporen van FCS dat de trypsine reactie kan blussen verwijderen.
3. Zuig het PBS en voeg 3 ml trypsine-EDTA-oplossing om de cellen te bedekken en incubeer gedurende 1 min.
4. Wanneer de cellen worden afgerond, maar blijft bevestigd aan de schaal voorzichtig zuig het trypsine-EDTA-oplossing en was met 3 ml PBS omVerwijder alle sporen van trypsine.
5. Na verwijdering van het PBS, voeg 5 ml kweekmedium en voorzichtig pipet op en neer om een ​​suspensie van afzonderlijke cellen. Overdracht van de cellen om een ​​15 ml buis.
6. Neem 1 ml van het PC3 celsuspensie in een nieuwe centrifugebuis en voeg 9 ml van de cultuur media. Plate de cellen op een 10 cm ² cultuur schotel (1:10 verdunning) voor later experimenteel gebruik. Tel de resterende cellen met een hemocytometer.
7. Verdun 2500 PC3 cellen die zijn bereid in stap 6.6 in 300 ul RPMI 1640 kweekmedium aangevuld met 2% v / v BM oplossing om de vorming van een gradiënt gel in de cultuur.
8. Voorzichtig zaad de cellen op de natieve en AGE verstijfde rBM en plaats voorzichtig de cultuur in de op 37 ° C en 5% CO ₂ (met bevochtiging) incubator gelijkmatige verdeling van sferoïden groeien in de put waarborgen.
9. Verander het kweekmedium elke 72 uur.
10. Om het effect van stijve (AGE-rijke) rBM bestuderenop prostaat tumorcel migratie, het PC3 cellen met behulp van helderveld video time-lapse microscopie met behulp van temperatuur / CO ₂ controlepunten en een vochtige kamer ^17.
    Opmerking: PC3 cellen groeien in strengen op inheemse rBM en geen acini met een lumen niet te vormen, maar als links naar meer dan 72 uur te groeien op inheemse rBM zullen ze 3D bolletjes vormen.
11. Naar aanleiding van data-acquisitie, handmatig PC3 cellen volgen en de berekening van hun migratie snelheid, vorm (rek ratio) en persistentie van migratie ^17-19.
    Opmerking: Persistence = verhouding D / T, D = afstand van het begin tot het einde van de cel traject, T = totale lengte van de cel van de bal.

Resultaten

3D Prostaat Acini gekweekt op Stijf rBM

Na 6 dagen kweken PEC afgeleid van normaal prostaatweefsel (RWPE-1) (Figuur 1A) en BPH weefsel (BPH-1) (Figuur 1B) vorm acini op natieve (PBS behandelde) rBM die zijn georganiseerd in uniform sferoïden van epitheliale cellen. Deze acini hebben ook de kenmerken van goed georganiseerde PEC met apicale-to-basale polariteit en een zichtbare luminale ruimte ^13,20.

De acini gevormd door PEC afgeleid van normaal prostaatweefsel (RWPE-1) (Figuur 1A) en BPH weefsel (BPH-1) (Figuur 1B) met verstijfde (AGE-rich) rBM (behandeling met GLA) een verstoord architectuur (verschuiven van bolvormige naar veelhoekige in vorm en cellen uitsteken / migreren van de acini in de AGE-rijke rBM) (Figuur 1A). Deze acini worden ook gekenmerkt door zeer ongeorganiseerd PEC op hun apicale-basale polariteit te hebben verloren met een klein of nihil luminale ruimte ^13.

Figuur 1:. Prostate epitheelcellen gegroeid 3D Glandular Acini op natieve en Stiff Gereconstitueerd Basement Membrane (rBM) (A) Helderveld afbeeldingen RWPE-1 cellen gekweekt gedurende 12 uur tot 6 dagen rBM gels behandeld met PBS (natief) of 50 mM glycolaldehyde gedurende 14 uur (AGE-rijk, stijf); Schaal bar = 50 micrometer. (B) BPH-1 cellen gekweekt zoals beschreven in paneel A; Schaalbalken = 50 urn; data is representatief voor 3 onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1 "src =" / files / ftp_upload / 54230 / 54230table1.jpg "/>
Tabel 1:. Kenmerken van de prostaat Epitheliale RWPE-1 acini Grown op Native, Semi-Stijf en stijf Gereconstitueerd Basement Membrane (RBM) RWPE-1 acini werden gekweekt op rBM voorbehandeld met PBS gedurende 14 uur (native), glycolaldehyde (GLA ) gedurende 6 uur (semi-stijf) of GLA gedurende 14 uur (stijf). Voor acinar vorm, het percentage (%) ± standaarddeviatie (SD) van de toer, werden semi-veelhoekige en veelhoekige acini berekend op basis van 5 onafhankelijke experimenten (50 acini gekwantificeerd per conditie). Relatieve acinar grootte werd berekend (inheemse rBM = 100%) van 3 onafhankelijke experimenten. Voor invasiviteit% ± SD acini met één of meer uitstekende cellen werden berekend uit 3 onafhankelijke experimenten. Voudige verandering wordt berekend door de gemiddelde waarde onder semi-stijf of stijf omstandigheden verkregen door de overeenkomstige waarde voor natieve omstandigheden verdelen. P-waarden berekend met t-toets (α = 0,05).

NHOUD "fo: keep-together.within-page =" 1 "> AGE afhankelijk verhoogd rBM stijfheid bevordert PC3 prostaattumor celmigratie

PC3 cellen gekweekt op inheemse rBM migreren door het handhaven van continue cel-cel contact, terwijl PC3 cellen gekweekt op AGE-rijke (stijf) rBM bewegen onafhankelijk van elkaar (Figuur 2A). Na 72 uur in de cultuur PC3 cellen vormen foci (bolletjes) op inheemse (PBS behandeld) rBM, terwijl PC3 cellen op stijf (AGE-rijke) rBM van bolletjes niet en migreren onafhankelijk (Figuur 2B). PC3 cellen op stijf (AGE-rijke) rBM zijn meer langwerpig dan PC3 cellen gekweekt op inheemse rBM (figuur 2C). PC3 cellen op stijve rBM migreren sneller dan PC3 cellen gekweekt op inheemse rBM (figuur 2D). PC3 cellen op stijf rBM vertonen een daling van de persistentie in vergelijking met PC3 cellen gekweekt op inheemse rBM (figuur 2E).

Figuur 2:. Prostaattumor celmigratie op natieve en Stiff Gereconstitueerd Basement Membrane (rBM) (A) Helderveld afbeeldingen PC3 cellen gekweekt op rBM gels behandeld met PBS (natief) of 50 mM glycolaldehyde 14 uur (AGE-rijke, stijf) . De cellen werden afgebeeld met behulp van een helderveld microscoop (10X objectief) en een overname snelheid van 1 beeld per uur gedurende 12 uur, gevolgd door de cel volgen om trajecten te genereren. Getoonde afbeeldingen komen overeen met de tijdstippen na 0, 3, 6, 9 en 12 uur. Trajecten van enkele cellen worden getoond voor de 12 uur tijdstip. Schaal bar = 100 micrometer. (B) PC3-cellen gekweekt op natieve of stijve rBM voor 72 uur, en afgebeeld zoals in paneel (A). Schaal bar = 100 micrometer. Detail toont geselecteerde gebied op 2X vergroting. (C) Gemiddelde ± SD cellengte (pm); significant verschil tussen autochtone rBM en stijf rBM (p = 1,2 x 10 ^-23). ( D) Gemiddelde ± SD snelheid (um / hr) berekend op basis van cell trajecten; significant verschil tussen autochtone rBM en stijf rBM (p = 0,004). (E) Gemiddelde ± SD voortbestaan ​​van de cel beweging (verhouding D / T, waarbij D = afstand van het begin tot het einde van de cel traject, T = totale lengte van de cel traject); significant verschil tussen autochtone rBM en stijf rBM (p = 0,0007). Voor panelen CE> 10 cellen werden geanalyseerd, data is representatief voor 3 onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Een protocol voor het genereren van 3D glandular acini van MEC in pure rBM gels ⁶ is in een eerdere studie gemodificeerd door toevoeging van 4 mg / ml type I collageen de RBM matrix. De toevoeging van collageen resulteerde in de elastische modulus van de rBM gel toeneemt van 175 ± 37-1589 ± 380 Pascal. Deze 9,1-voudige toename in stijfheid gemoduleerde de groei, overleving, migratie en differentiatie van MEC ^21. Het protocol werd wederom gewijzigd door opname van een behandelingsstap met D - (-) - ribose niet-enzymatische verknoping van de type I collageen dat was toegevoegd aan de gel rBM bevorderen. De resulterende 15-voudige toename in stijfheid bleek te werken met oncogene transformatie van MEC hun invasief gedrag ²² bevorderen. De experimentele benadering van het toevoegen type I collageen gels rBM vergemakkelijkt de directe interactie van MEC's ​​met collageenvezels, die alleen in menselijk weefsel na de fysieke barrière tussen de stromaen epitheel door de BM ondergaat proteolytische afbraak. Door het genereren van 3D-glandular acini van PEC in pure rBM gels voorbehandeld met GLA, het huidige protocol opent de weg om te onderzoeken hoe BM stijfheid per se hun invasief gedrag (figuur 3) kan leiden. De niveaus van BM stijfheid veroorzaakt in dit protocol hebben fysiologische relevantie. Incubatie met 50 mM GLA 6 uur en 14 uur met respectievelijk de elastische moduli van de zuivere rBM gel 175 ± 90 en 322 ± 160 ten opzichte van 122 ± 55 Pascal in rBM gels behandeld met PBS (tabel 1). Dit 1,7-3,2-voudige toename in stijfheid rBM recapituleert het 2,5 tot 3,4-voudige toename van de stijfheid waargenomen maligne opzichte van normale prostaat of BPH weefsel ^23-26. Zoals in een recente publicatie de ¹³ morfologische veranderingen bij de accumulatie van AGE en rBM stijfheid in PEC acini kan worden gekwantificeerd om een statistisch significante verschuiving van arounded naar polygonale vorm, verminderde luminale / totale oppervlakte acinaire en uitsteekt cellen migreren vanuit het acina in de AGE-rijke rBM (figuur 3). Immunoblotting kan ook worden gebruikt om merkers van EMT beoordelen (bijvoorbeeld verlies van E-cadherine ¹³⁾ en de contractiele beïnvloeden (gefosforyleerd myosine lichte keten-2, pMLC2 ¹³⁾ in PEC gekweekt in normale versus stijve rBM (figuur 3). Verdere beoordelingsproces met immunofluorescentie kleuring en confocale microscopie kunnen worden toegepast op de BM visualiseren (bijvoorbeeld laminine, collageen IV en AGE accumulatie ^13), cellulaire apicale naar basale polariteit (bijvoorbeeld apicale lokalisatie van EEA1: vroege endosomale antigeen 1 en GM130: 130 kDa cis Golgi-merker ¹³⁾ en cellulaire patronen van adhesiemoleculen (bijv E-cadherine lokalisatie tot cel-cel contacten ¹³⁾ (figuur 3).

Figuur 3:. Overzicht van de verschillende protocollen hier gepresenteerde Het diagram toont hoe voor te bereiden en te verstijven het opgeloste basaal membraan (RBM) met glycolaldehyde (Maillard-reactie), hoe je cellen te zaaien op de stijve rBM, hoe de stijve rBM analyseren ( omvang van Maillard reactie) en -procedures die kunnen worden gebruikt om de cellulaire en moleculaire veranderingen bij AGE-rijke rBM analyseren. AGE, geavanceerde glycatie eindproducten; BM, basaal membraan; DAPI, 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol; EEA1, vroeg endosomale antigen 1; GAPDH, glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase; GLA, glycolaldehyde; GEE, glycine ethyl ester; GM130, 130 kDa cis-Golgi marker; p-MLC2 (Thr18 / Ser19), myosine lichte keten-2 gefosforyleerd op sites threonine 18 en serine 19; rBM, gereconstitueerde basaal membraan; SDS-PAGE, natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegelelektroforese. Voor RWPE1 acini Schaal bar = 10 micrometer; voor PC3 tumorcellensferoïden Schaal bar = 100 micrometer. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie ^13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Stappen voor probleemoplossing is noodzakelijk als D - (-) - ribose gekozen als verknopingsmiddel voor rBM. Tijdens protocolontwikkeling bleek dat behandeling met 1 M D - (-) - ribose gedurende 72 uren, zoals eerder beschreven voor rBM / collageen gels ^22, geleid tot de dehydratatie en krimp van rBM gels. De evaluatie van lagere concentraties van D - (-) - ribose en kortere behandelingstijden kunnen helpen om deze beperking te overwinnen.

Een mogelijke beperking van toekomstige toepassingen van het protocol kan waar hogere niveaus van rBM stijfheid gewenst worden aangetroffen. Bij langere incubatietijden en hogere concentraties GLA worden gebruikt om hogere rBM gel stijfheid veroorzaken, zullen dit noodzakelijk beoordelen of deze behandeling die een impact hebben op celoverleving en proliferatie, zoals eerder beschreven ^13. Ook moet worden opgemerkt dat incubatie van RWPE-1-cellen met serum induceert een fenotypische EMT-achtige overgang en blootstelling aan serum of serum-bevattende materialen moet worden vermeden. Als bijvoorbeeld experimenten omvatten de transfectie van korte interfererende RNA (siRNA) oligonucleotiden, moet de werkwijze worden geoptimaliseerd met behulp RWPE-1 cellen gekweekt in KSFM zonder het schakelen van de cellen aan lage serum transfectie media. Dit nadeel zou het niveau van gen beschadigen geluidsdemping bereikt bij gebruik van voorbijgaande siRNA zal in het model. Voor sommige eiwit targets zou worden geadviseerd om induceerbare shRNA vectoren voor afstembare gene silencing en de gewenste afname van de eiwitgehalten in dienst. Aanpassingen die enzymatische verknoping te nemen door stromale cel of tumorcel geassocieerd lysyloxidase (LOX) ¹⁷ kan ook in toekomstige modellen worden opgenomen.

jove_content "> Dit protocol zal de toekomstige studie van pro-invasieve mechanismen geactiveerd door leeftijdsafhankelijke BM stijfheid in PEC (RWPE-1, BPH-1) en evaluatie van anti-metastatische doelstellingen invasieve PTC (PC3) te vergemakkelijken. Aangezien BPH wordt als een stofwisselingsstoornis ²⁷ zijn, dit protocol effent ook de weg naar onze beter inzicht in de relatie tussen metabole stoornissen en verhoogd risico op prostaatkanker. Aangezien BM stijfheid veroorzaakt door de blootstelling aan AGEs trigger voor invasieve andere kanker kan types, zal het van belang zijn om het protocol te gebruiken voor het opzetten van vergelijkbare modellen die normale epitheliale cellen en tumorcellen op te nemen van andere organen (zoals borst-, colon, eierstokken, pancreas).

Kritische stappen in het protocol met de timings, zijn in figuur 4. In de eerste stap is het essentieel om de voorraadoplossing van rBM houden bij 4 ° C terwijl het ontdooit zijn pol voorkomenymerization. Pipetpunten mag niet worden geplaatst in de RM voorraad oplossing totdat ze zijn afgekoeld tot 4 ° C. Voor de volgende stap is eveneens belangrijk de kamer sleden geëquilibreerd tot 4 ° C voordat zij worden bekleed met het rBM oplossing. Zodra de temperatuur van de oplossing rBM boven 4 ° C wordt verhoogd zal het onomkeerbare polymerisatie vorming van een gel ondergaat. Het essentieel dat de rBM niet verstoord tijdens de polymerisatiestap zodat er een homogene oppervlak geschikt voor celcultuur en microscopische analyse. De duur van de incubatie met GLA, met of zonder remmers van de Maillard-reactie (natriumcyaanboorhydride en amingoguanidine) zal bepalen hoe stijf de rBM gel wordt. Het wordt aanbevolen om een 6 uur incubatie te gebruiken met GLA ​​als semi-stijve voorwaarden nodig zijn, en 14 uur incubatie als stijve voorwaarden zijn vereist (tabel 1). Alternatieve incubatietijden of concentraties GLA kan worden gebruikt als verschillende niveausstijfheid gewenst zijn. In dit geval rheologische analyse van de RBM gels nodig als een essentiële stap te worden opgenomen. Na de stap van het blussen van de Maillard reactie door incubatie met GEE en de daaropvolgende wasstappen met PBS, kan de rBM gels onmiddellijk worden gebruikt of opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 48 uur vóór het gebruik voor celcultuur. Zodra celkweken worden ingesteld is het belangrijk om het kweekmedium (inclusief eventuele behandelingen) om de twee dagen veranderen. Het wordt aanbevolen om de 3D celculturen handhaven 3-12 dagen afhankelijk van de onderzochte parameters. Voor 3D PEC Acini is het raadzaam om de culturen te analyseren na 6 dagen, en voor 3D PTC sferoïden analyse wordt aanbevolen na 3 dagen van de cultuur in de eerste plaats.

Figuur 4:. Eenvoudig overzicht van het protocol met kritische stappen en timings gewezen op de flow diagram toont hoe voor te bereiden en te verstijven het opgeloste basaal membraan (RBM) met glycolaldehyde (Maillard-reactie) met kritische stappen en timings aangegeven. Punten waar de protocol kan worden gestopt, en rBM gels opgeslagen, zijn ook aangegeven. rBM, gereconstitueerde basaal membraan; GLA, glycolaldehyde; GEE, glycine ethyl ester; ON, 's nachts; PBS, fosfaatgebufferde zoutoplossing; RT, kamertemperatuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
I - Materiaal voor monolaagcultuur
BPH-1	CaP Cell Line Database	PCaCL-132	Contact: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu
Complete keratinocyte serumvrij media	ThermoFisher Scientific	17005-075	Niet opwarmen bij 37 ºC vóór gebruik
Fetaal runder serum	First Link UK Ltd	02-00-850	Bewaar bij -20 ºC in aliquots
PC3	American Type Culture Collection	CRL-1435
Penicilline/streptomycine	ThermoFisher Scientific	15070-063
Fosfaatbufferoplossing (Dulbecco A) tabletten	Oxoid	BR0014G
RPMI 1640 medium	Sigma-Aldrich	R5886	Warm in 37 ºC waterbad vóór gebruik
RWPE-1	American Type Culture Collection	CRL-11609
Trypsine-EDTA oplossing	Sigma-Aldrich	T4049
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
II - Materiaal voor 3D-cultuur
Acetonitril	Sigma-Aldrich	271004
Aminoguanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	396494	Irriteert de ogen, het ademhalingssysteem en de huid
Chamber slides, 8-well	Thermo Scientific Nunc Lab-Tek	TKT-210-816M
Culture Matrix gereconstitueerde basaalmembraan (rBM) gereduceerd groeifactorextract	AMS Biotechnology	3445-005-01	Bewaar het basaalmembraan (BM) bij -80 ºC in aliquots
Cyanogeen bromide	Sigma-Aldrich	C91492	Giftig bij contact met huid en inademing
Mierenzuur	Sigma-Aldrich	695076
Glycine ethyl ester hydrochloride (GEE)	Sigma-Aldrich	50060	Irriteert de ogen
Glycolaldehyde dimer (GLA)	Sigma-Aldrich	G6805
Natriumcyanoborohydride	Sigma-Aldrich	71435	Zeer ontvlambaar; giftig bij contact met huid en inademing
Spuitfilter 0,22 micrometer	Appleton Woods	BC680
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
III - Materiaal om Maillard-reactie te kwantificeren
4’,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI)	ThemoFisher Scientific	D3571	lichtgevoelig en bewaar bij -20 ºC in aliquots
Kloon cilinders	Sigma-Aldrich	C1059
Geit anti-muis IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugaat	ThemoFisher Scientific	A-11001	lichtgevoelig
Geit anti-konijn IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugaat	ThemoFisher Scientific	A-11034	lichtgevoelig
Geitenserum	Abcam	ab7481	Bewaar bij -20 ºC in aliquots
Vectashield montagemedium	Vector Laboratories	H-1000
Muis anti-pentosidine klonale PEN-12 mAb	TransGenic Inc	KH012
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	F8775	Bewaar bij -20 ºC in aliquots
Konijn anti-menselijk collageen IV polyklonaal antilichaam	Acris Antibodies	R1041	Bewaar bij -20 ºC in aliquots
Konijn anti-laminine A/C pAb	Santa Cruz Biotechnology Inc	sc-7292	Bewaar bij -20 ºC in aliquots
Polyethyleenglycol tert-octylfenyl ether (Triton-X100)	Sigma-Aldrich	T9284
Polyethyleenglycol sorbitaanmonolauraat (Tween-20)	Sigma-Aldrich	P1379
Dialyse cassette Slide-A-Lyzer	ThemoFisher Scientific	66333
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
IV - Apparatuur
ARG2 gecontroleerde spanningsrotatierheometer	T.A. Instruments
Axiovert S100 (20X vergroting) microscoop	Zeiss
CO2 gecontroleerde bevochtigde incubatiekamer voor Zeiss Axio S100 microscoop	Solent Scientific
Confocale Axiovert 200M (40X, 63X vergroting) microscoop	Zeiss
Olympus LH50A microscoop uitgerust met een digitale camera met fasecontrast	Olympus
PHERAstar Plus plate reader spectrofotometer	BMG Labtech
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
V - Software
Image J 1.47v	National Institute of Health, USA
MetaXpress	Molecular Divices