Nefrotoxische substantie Micro-injectie in zebravis tot acuut nierfalen Model

Samenvatting

Renal verwondingen opgelopen van nephrotoxins, die drugs, variërend van antibiotica tot chemotherapeutica omvatten, kan leiden tot complexe aandoeningen waarvan de pathogenese blijft onvolledig begrepen. Dit protocol laat zien hoe zebravis kan worden gebruikt voor ziektemodel van deze aandoeningen, die kunnen worden toegepast voor het identificeren van renoprotectieve maatregelen.

Samenvatting

De nieren zijn gevoelig voor schade door blootstelling aan chemische stoffen ze filteren uit de bloedstroom. Dit kan leiden tot orgaanschade tot een snelle afname van de nierfunctie en de ontwikkeling van klinisch syndroom genoemd acuut nierfalen (AKI). Farmacologische middelen gebruikt medische omstandigheden variërend van bacteriële infectie kanker te behandelen wanneer afzonderlijk toegediend of in combinatie met andere geneesmiddelen, kunnen AKI initiëren. Zebravis een bruikbaar diermodel om chemische effecten op de nierfunctie te bestuderen in vivo, aangezien zij een embryonale nier bestaat uit nefron functionele eenheden die zijn geconserveerd met hogere gewervelde dieren, waaronder mensen. Verder kunnen zebravissen worden toegepast voor genetische en chemische schermen, die mogelijkheden om de cellulaire en moleculaire aspecten van AKI helderen en therapeutische strategieën zoals het identificeren van moleculen nefroprotectief ontwikkelen verschaffen voeren. Hier laten we zien hoe micro-injectie in dezebravisembryo kan worden gebruikt als een paradigma voor nefrotoxische substantie studies.

Inleiding

AKI is een abrupt verlies van nierfunctie die kunnen leiden tot verwoestende gevolgen voor de gezondheid ^1. AKI is een belangrijke kwestie in de gezondheidszorg over de hele wereld vanwege de hoge incidentie van ongeveer 20% bij gehospitaliseerde patiënten, met een nog hogere percentages van 30-50% in intensive care gevallen en ouderen, en sterftecijfers van 50-70% ^1-3. Helaas is de prevalentie van AKI is toegenomen en zal naar verwachting verder escaleren de komende tien jaar, mede als gevolg van de diversiteit van de factoren die de AKI kan induceren, die post-operatieve stress, ischemie, en de blootstelling aan nephrotoxins zoals antibiotica en omvatten chemotherapeutica ^4.

AKI gaat plotselinge cellulaire schade in de nier, voorkomende in nefronen, die de wezenlijke functionele elementen zijn en bestaan ​​uit een bloedfilter en een gesegmenteerde tubulus die uitmondt in urine centrale verzamelbuizen ^1. Wanneer een significant aantal nefronenbeschadigd tijdens AKI, de onmiddellijke gevolgen zijn onder andere een onderbreking in de klaring van afval uit de circulatie en verminderd of afgeschaft vloeistofstroom door nefronen wegens obstructie van dode en stervende cellen ^1. Na verloop van tijd kan buisvormige obstructie leiden tot degeneratie van de gehele nefronen, die permanent vermindert de nierfunctie ^1. Fysiologische veranderingen in de nier na AKI omvatten ook complexe inflammatoire gebeurtenissen die kunnen leiden tot chronische littekenvorming ^1.

Ondanks deze resultaten, hebben een aantal nefronen capaciteit om regeneratie te ondergaan na AKI dat de buisvormige epitheel ^5,6 reconstitutes. Hoewel er een toenemende moleculair begrip van nephron regeneratie is geweest, de mechanismen blijven ongrijpbaar in veel opzichten en noodzaken verder onderzoek ^7. De mate waarin AKI tot blijvende nierbeschadiging nog onbekend zijn. Lopend onderzoek suggereert dat de regeneratieve potentieel voor de nieren is dehoogste volgende minder ernstige gevallen van AKI, terwijl meer uitgesproken of herhaalde episodes leiden tot chronische nierziekte (CKD) en uitmonden in eindstadium nierziekte (ESRD) die levensreddende transplantatie of dialyse ^8,9 vereist. Bovendien, mensen die reeds lijden aan CKD zijn op een nog hoger risico op een ernstige episode van AKI ^8,9. Samengevat blijkt dat continue fundamenteel en klinisch onderzoek is cruciaal om te begrijpen, behandelen en voorkomen AKI.

Onderzoek met diermodellen is behulpzaam geweest bij het ​​waarderen van de progressie van de lokale en ecologische veranderingen die optreden tijdens de AKI ¹⁰ geweest. Om dit inzicht te breiden en nieuwe behandelingen te ontwikkelen, heeft de zebravis diermodel toegepast op verschillende manieren ^11,12. De nefronen van de zebravis nier, in zowel het embryo en volwassen, een hoge mate van conservering met zoogdieren ^13-16. Verder nefron epitheliale schade in ZEbrafish lijkt op de werkwijze in hogere vertebraten, waarbij de lokale vernietiging van tubulaire cellen wordt gevolgd door intratubulaire proliferatie en herstel van nefron architectuur ^17-19. In het embryo echter grote tubulus schade van de nephrotoxins zoals cisplatine is gekoppeld letaliteit ^20,21. Ter vergelijking, de zebravis volwassenen overleven AKI en vertonen inhoudelijke regeneratieve mogelijkheden in de nier. Bijvoorbeeld, na blootstelling aan de aminoglycoside antibiotica gentamicine, zebravis regenereren tubulus epitheelbeschadiging en groeien nieuwe nefroneenheden en ^22-24. Hoewel deze gentamicine-geïnduceerde AKI studies waardevolle informatie hebben ontvangen, begrijpen nierschade uit diverse nephrotoxins blijft kritisch voor de werking en de reactie op verschillende soorten schade ²⁵ waarderen.

De zebravis embryo, door zijn omvang, transparantie, en genetische traceerbaarheid, heeft vele voordelen voor de nefrotoxische substantie studies ^{25, waarbij de werkwijze van micro-injectie 20,21 wordt gebruikt om het molecuul (en) voor onderzoek beheren. Nefronen worden gevormd door 24 uur na de bevruchting (HPF) en beginnen om bloed te filteren op ongeveer 48 HPF 26,27. Dus de snelle vorming en functie van de embryonale nier vergemakkelijkt experimentele analyse. Echter, het proces van micro-injectie heeft technische uitdagingen en er kan een steile leercurve voor het beheersen van de techniek. In deze video artikel beschrijven we hoe de micro-injecties uit te voeren en geven tips voor het oplossen van problemen met het oog op de snelheid van de succesvolle injecties verbeteren.}

Protocol

De procedures voor het werken met de zebravis embryo's beschreven in dit protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Notre Dame.

1. Voorbereiding van de Solutions

1. Wordt 50x voorraadoplossing van E3 embryomedium door mengen van 73,0 g NaCl, 3,15 g KCI, 9,15 g CaCl ₂ en 9,95 g MgSO ₄ in 5 liter gedestilleerd water, en bewaar bij kamertemperatuur.
2. Voor het kweken van zebravis embryo verdunnen 50x voorraadoplossing van E3 embryo afdrukmateriaal een 1x werkoplossing met gedestilleerd water, voeg vervolgens 200 pl 0,05% methyleenblauw elk 1 liter 1x E3 om als fungicide en bewaar bij RT.
3. Maak een pigmentatie blokkerende oplossing van E3 embryo medium met 0,003% 1-fenyl-2-thioureum (PTU) door het combineren van 40 ml van de 50x E3 voorraad met 0,06 mg PTU. Breng dan het volume op een totaal van 2 L met gedestilleerd water.
4. Roer de E3 / PTU O / N bij kamertemperatuur aan de PTU poeder te krijgen in de oplossing. op te slaan dan de E3 / PTU opRT.
   Opmerking: De E3 / PTU heeft een houdbaarheid van ongeveer één week en oudere oplossingen minder effectief in het blokkeren pigmentatie ontwikkeling bij zebravis larven.
5. Maak een anestheticum van 0,2% tricaïne (MS-222) door het toevoegen van 1 g tricaïne aan 500 ml gedestilleerd water en op pH 7,2 met 1 M Tris, pH 9,5.
6. Bereid een 2% methylcellulose oplossing imaging maken door een oplossing van 1 x E3 (geen methyleenblauw), met ^1/10 volume van 0,2% tricaïne toegevoegd bij 4 ° C.
   Opmerking: De methylcellulose oplossing is een dikke, heldere oplossing die wordt gebruikt om voorzichtig stabiliseren levende embryo's voor microscopie. Na manipulaties worden uitgevoerd kunnen de embryo's in 1x E3 worden gewassen om de methylcellulose ontbinden, zonder verwonden het dier en het mogelijk maken microscopie in de volgende fasen in hetzelfde monster.
7. Wanneer afgekoeld tot 4 ° C, roer het 1x E3 / tricaïne oplossing krachtig op een roer plaat en voeg geleidelijk de juiste hoeveelheid methylcellulosepoeder en tegelijkertijd krachtig te roeren. Voeg geleidelijk het poeder aan de oplossing om de vorming van onoplosbare aggregaten methylcellulose voorkomen.
8. Nadat al het poeder in de 2% methylcellulose / E3 / tricaïne oplossing wordt gemengd, roer de samengestelde oplossing in het 4 ° C koude kamer O / N.
   Opmerking: De koude temperatuur is het beste voor volledig oplossen van het poeder. Als de oplossing niet helder na één nacht roeren gedurende nog werkdag en / of een tweede O / N.
9. Luchtbellen gedurende 30 minuten of tot 2 uur uit de 2% methylcellulose / E3 / tricaïne oplossing aliquot het mengsel in 1,5 ml buisjes en centrifugeren op hoge snelheid (12.000 x g) bij 4 ° C.
10. Plaats de 2% methylcellulose / E3 / tricaïne oplossing bij 4 ° C voor langdurige opslag.
    Opmerking: Voorafgaand aan het gebruik, monsters moeten vooraf worden opgewarmd tot RT voor het werken met de zebravis exemplaren.

2. Voorbereiding van de Hulpmiddelen

1. Bereid een embryo manipulator tool, gebruikt voor popositionere embryo's voor micro-injectie, door het aanbrengen van een gel geladen tip over het einde van een 5 "straight ontleden naald, en veilig met tape of secondenlijm.
2. Bereid micro-injectie naalden met behulp van een naald trekker, door eerst een brand plaatsen van gepolijst 10 cm borosilicaatglas met filament in het instrument en zet de borosilicaatglas door het aandraaien van de handgrepen.
3. Trek de borosilicaatglas fine-taps toelopende naalden mode. Gebruik de volgende instellingen: verwarm 540, trek 245, snelheid 200, en de tijd 125.
4. Plaats naalden in een petrischaal, de schorsing ze op een strook van boetseerklei ter bescherming van de naald tips, en houdt het gerecht afgedekt om stofophoping te voorkomen.
5. Om te eindigen de voorbereiding van de naald voor micro-injecties, gebruik dan een scheermesje of fijne tang rand naar het trok einde van de naald te snijden tot een scherpe hoek injectie tip te maken met een diameter van ongeveer 0,05-0,1 mm.
6. Om de micro-injectie lade te maken, bereiden een 1,5% agarose / E3 oplossing in een 100 ml Erlenmeyer kolf en los de agarose door verhitting van het E3 aan de kook in een magnetron laat afkoelen bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 10 minuten.
7. Giet de afgekoelde agarose / E3 oplossing in een petrischaal op een fundering te maken met een diepte van ongeveer 0,5 cm. Wanneer deze gestold giet een tweede laag met een diepte van ongeveer 0,3 cm en plaats de geprefabriceerde embryo goed vorm en laat de agarose te stollen bij kamertemperatuur.
   Opmerking: Bij het plaatsen van de matrijs in de topagar / E3 laag, het plaatsen van de matrijs in de agar onder een hoek met het aantal luchtbellen verminderen.
8. Wanneer de hele micro-injectie lade is ingesteld, til de geprefabriceerde embryo goed kneden langzaam en voorzichtig met een scoopula, vul dan de schotel met E3-oplossing en bewaar bij 4 ° C.

3. Embryo Voorbereiding

1. Opgericht zebravis paring tanks door het plaatsen van verdelers in paring kamers en vul met het systeem water.
2. Plaats een vis aan weerszijden van de scheidingslijn such dat elke paring kamer bevat een vrouwelijke en een mannelijke vissen, en elk paring kamer.
3. De volgende ochtend, verwijder de verdelers te paaien in te schakelen.
4. Controleer de vis na ongeveer 30 minuten, en na terugkomst van de volwassenen om het aquarium, het verzamelen van hun embryo's door het passeren van de paring tank water door een fijne gaas zeef tool.
5. Inverteer de zeef in een petrischaal en spoel met E3 de embryo's te verzamelen.
6. Incubeer de embryo's bij 28,5 ° CO / N.
7. Wanneer de embryo's 24-26 somiet fase ²⁶ hebben bereikt, decanteren meeste E3 media en vervolgens dechorionate door toevoeging van 100 pl 50 mg / ml pronase elk gerecht embryo en incuberen van de schaal bij kamertemperatuur (23 ° C) gedurende ongeveer 15 min.
   Opmerking: Het duurt ongeveer 24-25 uur neemt vanaf het moment van de bevruchting embryo naar 24-26 somiet stadium te bereiken wanneer zij worden verzameld op de wijze beschreven en geïncubeerd O / N bij 28,5 ° C.
8. Vul het gerecht metE3 en dan schud zachtjes aan de chorions van de embryo's te verwijderen.
9. Giet het E3 / pronase en spoel de schaal met 25 ml vers E3. Herhaal spoeling stap om alle pronase te verwijderen.
10. Om de ontwikkeling van pigmentatie te blokkeren, giet de E3 en vervangen door 25 ml vers E3 / PTU wanneer de embryo's 24 uur na de bevruchting hebben bereikt.
    Opmerking: Voor experimenten een aantal dagen verspreid, vervang dan de E3 / PTU oplossing met verse media eenmaal per dag om de schotel schoon te houden.

4. Micro-injectie van Toxine dat nierweefsel Solution

1. Op de dag van de injectie, de voorbereiding van de gewenste nefrotoxische substantie oplossing, samen met de juiste controle over het voertuig.
2. Vortex of meng zachtjes om het geneesmiddel (en) verzekerd is / zijn opgelost, het controleren van de zijkanten van de buis en de bovenkant van de waterkolom.
   Opmerking: Toxine dat nierweefsel oplossingen kunnen worden bereid zijn om sporen van fluorescent geconjugeerd dextran bevatten micro-injectie efficiëntie te monitoren en ook renale klaring beoordelen op subsequent tijdstippen ^20,28.
3. Laad een bijgesneden micro-injectie naald met ~ 2-3 pi van de nefrotoxische substantie door rijgen een fijne gel geladen tip in de achterkant van de naald en verticaal op te schorten van de naald met een stuk tape om de oplossing om de bijgesneden naald te vullen door de zwaartekracht.
4. Zodra de naald vol is, zet de geladen naald in de micromanipulator.
5. Test de micro-injectie volume door een druppel minerale olie op een micrometer en injecteren in de olie de druppelgrootte evalueren. Een injectievolume van 500 pl heeft een diameter van 0,1 mm.
6. Verwijder de schotel van embryo's uit de incubator en verdoven door toevoeging van ongeveer 5 ml 0,2% tricaïne het embryo schotel.
7. Om een ​​volledige verdoving te garanderen, zachtjes aanraken embryo met de punt van het embryo manipulator tool. Gebrek aan beweging geeft voldoende verdoving.
8. Na een succesvolle verdoving, transfer embryo's naar de spuitgietmatrijs met een transfer pipet.
9. Manoeuvreren elk embryo in een ander putje van de matrijs plaatsen van de kop in het diepste gebied van de put zodat de romp ligt langs de depressie en de staart steekt uit het depressie.
10. Steek de gevulde naald in de micromanipulator en plaats de naald naast een embryo.
11. Steek de naald in de staart vat door de joystick naar voren te bewegen en druk het voetpedaal aan de micro-injectie te leveren.
    Opmerking: Succesvolle injectie kan worden gemeten door te kijken naar de vloeistof in omloop gebracht. Verder co-injectie van de nephrotoxicant met fluorescent geconjugeerde dextran kan de onderzoeker succesvolle injectie na de procedure te controleren.
12. Trek terug op de joystick om de naald van de embryo te verwijderen.
13. Na injectie, overdracht van de embryo's om een ​​schone schotel en spoel de tricaïne te verwijderen en te vervangen door verse E3 / PTU.
14. Incubeer de embryo naar het gewenste tijdstip om te beoordelens morfologie, die door de fotografie kan worden gedocumenteerd in methylcellulose montage media, of het proces voor experimentele analyse zoals gewenst.
    Opmerking: Herstel van embryo's worden beoordeeld op het percentage individuen met oedeem, dat vaak aangeeft nierbeschadiging bepalen.

Resultaten

Een micro-injectie station opgezet is voorzien van een stereomicroscoop, micromanipulator en drukregelaar (Figuur 1A). Transilluminatie van de injectieplaat voorkeur om monsters te zien tijdens deze procedure (Figuur 1B). Bereiding van de injectienaald omvat het trekken van de juiste borosilicaatglas, gevolgd door het bereiden van de rand met snijden en tenslotte backloading de naald. Optimaal wordt de naald in plaats schuin dan stomp (figuur 1C)...

Discussie

Een divers aantal therapeutische middelen zijn geassocieerd met AKI ^29. Er zijn aanzienlijke onderzoek vooruitgang in het begrijpen van de schade veroorzaakt door vele afzonderlijke verbindingen, zoals aminoglycoside gentamicine ³⁰ en de gebruikte chemotherapeutische cisplatine ^31,32 geweest. Sommige pathologische veranderingen die betrokken zijn bij deze voorwaarden, blijven echter het onderwerp van lopend onderzoek. Een opkomende uitdaging blijft begrijpen hoe meerdere drugs negatieve ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Sodium Chloride	American Bioanalytical	AB01915
Potassium Chloride	American Bioanalytical	AB01652
Calcium Chloride	American Bioanalytical	AB00366
N-Phenylthiourea (PTU)	Aldrich Chemistry	P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)	Fluka Analytical	A5040
Borosilicate glass	Sutter Instruments Co.	BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller	Sutter Instruments Co.	Mo. P097
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Methylene Blue	Sigma-Aldrich	M9140
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:
60 mm x 15 mm	VWR	25373-085
100 mm x 15 mm	VWR	25373-100
(microinjection tray) 150 mm x 15 mm	VWR	25373-187
Low Temperature Incubator	Fischer Scientific	11 690 516DQ
Micro Dissecting Tweezer	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5010
Micrometer	Ted Pella, Inc.	2280-24