Isolatie van Perivasculaire Multipotent Precursor Cell Populaties van de Mens Cardiac Tissue

Samenvatting

Menselijk hartweefsel herbergt multipotente perivasculaire precursor celpopulaties die geschikt zijn voor myocard regeneratie kunnen zijn. De hier beschreven techniek maakt de gelijktijdige isolatie en zuivering van twee multipotente stromale cel populaties geassocieerd met natieve bloedvat, dat wil zeggen CD146 ⁺ CD34 ^- pericyten en CD34 ⁺ CD146 ^- adventitia-cellen van de menselijke hartspier.

Samenvatting

Multipotente mesenchymatische stam-/stromacellen (MSC) werden conventioneel geïsoleerd, door hun plastische aanhechting, uit primaire weefseldigeraten, terwijl hun anatomische weefselligging onduidelijk bleef. De recente ontdekking van gedefinieerde perivasculare en MSC-celmarkerexpressie door perivasculare cellen in meerdere weefsels door onze groep en andere onderzoekers heeft een mogelijkheid geboden om prospectief specifieke homogene subpopulaties van multipotente perivasculare voorlopercellen te isoleren en zuiveren. We hebben eerder het gebruik van fluorescente geactiveerde celsortering (FACS) gedemonstreerd om microvasculaire CD146⁺CD34^- pericten en vasculaire CD34⁺CD146^- adventitiële cellen uit menselijk skeletspierweefsel te zuiveren. Hierin beschrijven we een methode om deze twee perivasculare celsubpopulaties gelijktijdig uit menselijk myocard te isoleren door FACS, gebaseerd op de expressie van een gedefinieerde set celoppervlaktemarkers voor positieve en negatieve selecties. Deze methode maakt dus twee specifieke subpopulaties van multipotente hart-MSC-achtige voorlopercellen beschikbaar voor gebruik in fundamenteel onderzoek en/of therapeutische onderzoeken.

Inleiding

Het hart is lang beschouwd als een post-mitotische orgaan. Echter, recente studies de aanwezigheid van cardiomyocyt omzet beperkt bij volwassen menselijk hart ¹ aangetoond. Inheemse stam / voorlopercellen met cardiomyocyt differentiatie potentieel zijn ook geïdentificeerd binnen het myocard bij volwassen knaagdieren en menselijke harten, met inbegrip van Sca-1 ^+, c-kit ^+, cardiosphere-vorming, en het meest recent, perivasculaire voorlopercellen ^2,3. Deze cellen zijn aantrekkelijke kandidaten voor therapieën die gericht zijn op verbetering van cardiale herstel / regeneratie via cel transplantatie of stimulatie van in-situ proliferatie.

Mesenchymale stamcellen / stromale cellen (MSC) zijn geïsoleerd uit bijna alle menselijke weefsels ^4,5 Klinische proeven van de therapeutische toepassingen van MSC zijn uitgevoerd voor meerdere pathologische omstandigheden uitgevoerd zoals hart- reparatie ^6, graft-versus-host ziekte ⁷ En levercirrose ^8. Gunstige effecten zijn toegeschreven aan het vermogen van MSCs tot: huis aan ontstekingsplaatsen ^9; differentiëren in verschillende celtypes ^10; scheiden pro-herstellende moleculen ^11; en moduleren gastheer immuunreacties ^12. De isolatie van MSC's is van oudsher vertrouwd op hun preferentiële hechting aan plastic substraten. De resulterende celpopulatie is typisch aanmerkelijk heterogeen ^13. Van door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) met een combinatie van essentiële perivasculaire celmerkers, konden wij isoleren en zuiveren van een multipotente MSC-achtige precursor populatie ^(- / CD34 ^- / CD45 ^{- -} / CD56 CD146 ⁺ / CD31) geweest meerdere menselijke weefsels waaronder volwassen skeletspier en wit vet ^14.

Er is aangetoond perivasculaire cel bevolking in diverse niet-cardiale weefsels stam / voorlopercellen cel eigenschappen van een hebbennd worden onderzocht voor klinisch gebruik bij de cardiovasculaire instelling. Pericyten, een van de meest bekende perivasculaire cel subsets, een heterogene populatie die verschillende pathofysiologische functies, waaronder de ontwikkeling van nieuwe vaten ¹⁵ te spelen, de regulatie van de bloeddruk ¹⁶ en onderhouden van vasculaire integriteit ^17,18. Zoals getoond in verschillende weefsels, specifieke subgroepen van pericytes native uiten MSC antigenen en hun MSC-achtige fenotypes in primaire cultuur in stand te houden na FACS zuivering ^14. Bovendien zijn deze cellen die stabiel behouden hun lange termijn fenotypes binnen de cultuur en vertonen multi-lijn differentiatie potentieel, vergelijkbaar met MSC's ^19,20. Deze resultaten suggereren dat pericytes zijn een van de oorsprong van de ongrijpbare MSC ^14. Het therapeutisch potentieel van pericyten aangetoond met een vermindering van myocardiale littekenvorming en verbeterde hartfunctie na transplantatie in ischemisch gewondenharten ^21. Onlangs hebben we met succes gezuiverd pericyten van de menselijke hartspier en koos MSC-achtige fenotypen en multipotent (adipogenese, chondrogenese en osteogenese) het ontbreken van skelet myogenesis ^3. Bovendien vertoonden myocardiale pericyten cardiomyogene differentiële potentie en angiogene capaciteit vergeleken met tegenhangers gezuiverd van andere organen.

Een tweede populatie van multipotente perivasculaire stam / progenitorcellen, de adventitia cel, is geïsoleerd uit menselijke aderen op basis van positieve CD34 expressie ^22. Veneuze adventitia-cellen is aangetoond dat potentiële klonale, mesodermale differentiatievermogen en pro-angiogene potentieel in vitro hebben. Transplantatie van deze cellen in het ischaemisch gewonden harten van muizen resulteerde in een afname van interstitiële fibrose, een toename van angiogenese en myocardiale bloedstroom, verminderde ventriculaire dilatie, en verhoogde cardiale ejectiefractie ^23. Interessant is dat vetweefsel adventitia cellen is aangetoond dat CD34 expressie te verliezen en upregulate CD146 expressie in cultuur in reactie op angiopoietine II behandeling, wat suggereert dat de goedkeuring van een pericyte fenotype met stimulering ^24. In het hart, maar de adventitia celpopulatie nog niet prospectief gezuiverd door FACS en / of goed gekarakteriseerd. Gebruik makend van de cel isolatie procedures in de volgende gedeelten worden beschreven, zijn we momenteel karakteriseren myocard adventitia cellen en het onderzoeken van hun potentieel voor regeneratieve toepassingen.

Hierin beschrijven we een werkwijze voor het isoleren en zuiveren twee subpopulaties van perivasculaire stam / progenitorcellen uit humaan foetaal of volwassen myocardium. Deze prospectieve cel isolatie methode zal onderzoekers in staat stellen om isogene perivasculaire stamcellen / voorlopercellen cel subsets van menselijk hart biopsieën voor vergelijkende studies en furthe verkrijgenr verkennen hun therapeutisch potentieel in diverse cardiale pathologische omstandigheden.

Protocol

1. De verwerking van de Mens Cardiac Sample

1. Zorg ervoor dat alle vloeistoffen, containers, instrumenten, en de specifieke operationele gebied zijn steriel.
2. Plaats het hartweefsel monster (verkregen door de weefselbank of chirurgische team) in opslagmedium samengesteld gekoeld Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) dat 20% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (P / S) op ijs ³ transport.
3. Verwijder de cardiale monster uit het opslagmedium en was met een wasmedium uit fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 2% FBS en 1% P / S. Bij het hanteren van het monster, maken gebruik van fijne getipt tang om grote schepen of hartzakje te grijpen en het minimaliseren van het breken van het myocard.
4. Dompel het monster in wasmedium in een petrischaaltje en verwijder het hartzakje, endocardium en grote bloedvaten met gesteriliseerd iris schaar en fijne punt tang zoals beschreven ^3.
5. Snijd de resterende myocardium in kleine stukjes van ongeveer 1 ^mm3 met een enkelzijdig scheermes of een paar scherpe irisschaar. Let op: Hoogste cel opbrengst zal worden verkregen als de monsters direct worden verwerkt. Als dit niet mogelijk is, opslaan van de bewerkte hartweefsel in de verse opslagmedium (> 5 ml per 1 ^cm3 weefsel) bij 4 ° C gedurende maximaal 72 uur kan echter vermoedelijk met een bijbehorende afname van de opbrengst cel.

2. Spijsvertering van het weefsel en isolatie van cellen

1. Vers vormen de vertering oplossing die 1,5 ml van collagenase I, collagenase II en IV collagenase (alle op 0,5 mg / ml in DMEM) en opwarmen tot 37 ° C in een waterbad.
   Opmerking: volume en concentratie van collagenasen zijn geschikt voor monsters van ongeveer 1 cm ^3.
2. Filter de geschorste weefsel stukken door een 100 um zeef en tweemaal wassen met PBS. Breng de stukken weefsel naar een steriele 30 ml container meteen goed afgesloten deksel.
   Opmerking: Korte brede potten in plaats van lange smalle buizen betere resultaten geven. Als alternatief zet weefselstukken in een steriele 50 ml buis en plaats horizontaal als een houder 30 ml afgesloten.
3. Voeg alle spijsvertering oplossingen (4,5 ml totaal) en de container in een afgesloten plastic zak te plaatsen in een 37 ° C schuddend waterbad ingesteld op 120 rpm. Als alternatief, sluit de container met paraffine film en plaats in een verwarmde rondschudapparaat ingesteld op 120 rpm.
4. Na 15 minuten, te verwijderen en draai de pot drie keer voordat het vervangen voor een verdere 15 min. Verwijder de collagenasen blussen met 5 ml DMEM aangevuld met 20% FBS en 1% P / S.
5. Vermaal het digest door voorzichtig pipetteren tien tot twintig keer met 10 ml serologische pipet te breken elk weefsel klonten. Filtreer de suspensie achtereenvolgens tot 100 urn, 70 urn en 40 urn cel uiteindelijk zeven onverteerd materiaal te verwijderen en het verkrijgen van een enkele celsuspensie.
   Notitie:Niet uitspoelen tussen cel zeven naar cel debrisgenerated door het enzym verteringsproces te voorkomen.
6. Centrifugeer de celsuspensie bij 200 xg gedurende 4 minuten, voorzichtig de bovenstaande en resuspendeer de pellet in 1 ml erytrocyten lysisbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur vóór het verdunnen met 4 ml van wasmedium.
7. Centrifugeer nogmaals stap en resuspendeer de pellet in 1 ml van wasmedium. Meng goed en neem 10 ul van de celsuspensie voor celtelling.
8. Mix 10 ul van de celsuspensie met 10 pi van trypan blauwe vlekken en plaats 10 pi van het mengsel op een standaard hemocytometer voor celtelling. Tel het aantal lichte, ronde cellen aanwezig in de vier hoeken vierkantjes (elk onderverdeeld in zestien vierkantjes) en 4 delen door het gemiddelde per hoekveld krijgen. Vermenigvuldig het gemiddelde van 2 tot vertegenwoordigen de vlek verdunningsfactor en vervolgens met 10 ⁴ tot het totale aantal cellen per 1 ml monster te verkrijgen.

3. Cel etikettering en sorteren

1. Voeg 50 ul muizenserum aan de celsuspensie en incuberen bij 4 ° C gedurende 20 min om niet-specifiek antilichaam blokkeert binding.
2. Centrifugeer de celsuspensie met muizenserum bij 200 xg gedurende 4 minuten, verwijder supernatant en resuspendeer in wasmedium in een concentratie van 1 x 10 ⁶ cellen per 100 pl.
3. Aliquot 50 pi elk van de celsuspensie voor de isotype controles en ongekleurde in twee polystyreen rondbodem flowcytometrie buizen plaats dan het resterende volume in een derde buis voor multi-kleur-kleuring.
4. Voeg CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5 en CD146-AF647 antilichamen (alle 1: 100) naar de enkele celsuspensie voor multi-color vlekken. Voor de isotype controle, voeg equivalente volumes van PE, APC-Cy7-, PE-Cy7-, PerCP-Cy5.5- en AF647-geconjugeerd isotype antilichamen. Voorzichtig pipet om de antilichamen met de cellen te mengen en incuberen alle buizen bij 4 ° C gedurende 20min in het donker.
5. Bereid compensatieregeling kralen door één druppel positieve kralen 100 ul wasmedium in vijf rondbodem polystyreen stroomcytometrie buizen. Add CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5 en CD146-AF647 antilichamen (alle 1: 100) afzonderlijk aan elk van de 5 buizen. Incubeer alle buizen bij 4 ° C gedurende 20 minuten in het donker.
6. Tijdens de incubatie bereiden cel verzamelbuizen elk 500 pi groeimedium Endotheel-2 (EGM-2) kweekmedium en bij 4 ° C.
7. Na antilichaam incubatie, voeg 5 ml van wasmedium aan cellen en kralen wassen om ongebonden antilichaam te verwijderen. Centrifugeer alle buizen bij 200 g gedurende 4 min. Herhaal het wassen en centrifugeren stap. decanteren voorzichtig het supernatant en pipet voorzichtig bij het opnieuw schorsing van cellen.
8. Resuspendeer in wasmedium in een concentratie van ongeveer 1 x 10 ⁶ cellen per 250 pl. Resuspendeer de kralen in 100 ul wassen medium.
9. Vervoeren alle cel en kraal schorsingen aan de cel sorter op ijs in het donker. Voeg 1 druppel negatieve kralen om de positieve kraal compensatieregeling, buizen en deze gebruiken om de fluorescentie schadevergoeding in te stellen.
10. Run ongekleurde controlecellen volgens de instructies van de fabrikant om de achtergrondfluorescentie vast en zet de spanningen op: FSC 150V; SSC 290V; V450 / 50 350V; V710 / 50 620V; B530 / 30 400V; B710 / 50 530V; YG780 / 60 460; R670 / 30 480V; R780 / 60 460V. Run isotypen controles volgens de instructies van de fabrikant om de achtergrondfluorescentie drempelwaarden met betrekking tot niet-specifieke binding vast te stellen. Run multi-color gekleurde monster en verzamel de pericyte en adventitia celpopulaties in de verzamelbuizen (figuur 1).
    OPMERKING: Optimale levensvatbare cellen levert ongeveer 3% van de totale levende cel dissociatie van pericyten en 4% voor adventitia-cellen.

4. Cell Culture

1. Kies geschikte grootte kweekplaten basis van de resultaten van de FACS-sortering. Voeg 100 ul van steriel 0,2% gelatine-oplossing per ^cm2 groeigebied en de hand schudden om de vacht van de hele putten. Incubeer de platen bij 4 ° C gedurende 10 minuten en verwijder gelatineoplossing volledig. Houd verzamelde cellen op ijs bij het voorbereiden kweekplaten.
   Opmerking: Vers gesorteerd pericyten en adventitia cellen groeien goed wanneer gezaaid met een dichtheid van 30.000 tot 40.000 cellen / ^cm2 op met gelatine gecoate kweekoppervlak.
2. Centrifugeren vers verzamelde cellen bij 200 g gedurende 4 min en voorzichtig resuspendeer de celpellet in een geschikte hoeveelheid EGM-2.Seed de cellen op met gelatine beklede platen.
   Opmerking: Het werkelijke aantal cellen worden geënt per putje en de hoeveelheid EGM-2 toegevoegd worden afhankelijk van de maaltijdschotels. Bijvoorbeeld 0,5 ml en 1 ml EGM-2 nodig per putje van 48- en 24-well platen resp.
3. Exchange EGM-2 voor perivasculaire celgroei medium (DMEM aangevuld met 20% FBS en 1% P / S) voor zowel pericyten en adventitia cellen eenmaal cellen geregeld en gehecht aan de plaat (na minimaal 72 uur). Wijzig de media elke 72 uur vanaf dat moment. Uitvoeren van eerste en alle volgende incubaties in 5% _CO2 en bij 37 ° C.
4. Cellen losmaken behulp 0,05% trypsine EDTA bij pericyten en adventitia cellen bereikt 80 tot 90% confluentie. Blussen met 20% FBS in PBS, centrifuge bij 200 xg gedurende 4 min, resuspendeer in perivasculaire celkweekmedium, en de passage cellen bij een 1: 3 verhouding op ongecoate polystyreen kweekplaten. Passage van 2 ingang passage cellen bij een 1: 5 verhouding (of bij ongeveer 7000 cellen / ^cm2) tot ongecoate polystyreen kweekplaten of flessen.

Resultaten

Enkele cellen werden onderscheiden van puin en doubletten op basis van voorwaartse en zijwaartse verstrooiing distributies. Levende cellen werden geïdentificeerd door hun falen te maken van de DAPI kleurstof. De gating strategie werd gekozen op basis van isotype controle etikettering van deze levende, hele hartcel dissociatie (figuur 1). Vanuit de levende cellen, werden CD45 ⁺ cellen eerst gated out, gevolgd door CD56 ⁺ cellen. CD144 ⁺ en...

Discussie

Steeds meer bewijs ondersteunt een beperkte regeneratieve capaciteit van de volwassen menselijk hart na een blessure. Identificatie en karakterisatie van natief precursorcellen verantwoordelijk zijn voor dergelijke regeneratieve respons gewonde harten essentieel voor zowel het begrijpen van geassocieerde mechanismen en signaalwegen en de ontwikkeling van benaderingen van deze cellen therapeutisch gebruik.

Vorige protocollen zijn de isolatie van perivasculaire voorloper cel subsets beschreven...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
AbC Anti-mouse Bead Kit	Molecular Probes	A-10344
Collagenase I	Gibco	17100-017	Reconstitueer poeder indien nodig en filter steriliseer
Collagenase II	Gibco	17101-015
Collagenase IV	Gibco	17104-019
anti-human CD34-PE	BD Pharmingen	555822	Blijf steriel
anti-human CD45-APC-Cy7	BD Pharmingen	557833	Blijf steriel
anti-human CD56-PE-Cy7	BD Pharmingen	557747	Blijf steriel
anti-human CD144-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	Blijf steriel
anti-human CD146-AF647	AbD Serotec	MCA2141A647	Blijf steriel
EGM2-BulletKit	Lonza	CC-3162	Voor het verzamelen van cellen en het kweken tot ze gehecht zijn
DMEM, hoge glucose, GlutaMAX zonder natriumpyruvaat	ThermoFischer Scientific	10566-016
Fetal Bovine Serum	ThermoFischer Scientific	10500-064	In porties invriezen en steriel houden
Gelatine	Sigma Aldrich	G1393	Verdunnen met steriel water
IgG1k-PE	BD Pharmingen	559320	Blijf steriel
IgG1k-APC-Cy7	BD Pharmingen	557873	Blijf steriel
IgG1k-PE-Cy7	BD Pharmingen	557872	Blijf steriel
IgG1k-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	Blijf steriel
IgG1k-647	AbD Serotec	MCA1209A647	Blijf steriel
Muis serum	Sigma Aldrich	M5905	Blijf steriel
Parafilm Film - Parafilm M	Sigma Aldrich	P7793
Penicilline-Streptomycine	Gibco	15979-063	In porties invriezen en steriel houden
Fosfaat gebufferde zoutoplossing pH 7.4	ThermoFischer Scientific	10010-023	Blijf steriel
Rode Bloedcel Lysering Buffer Hybri-Max	Sigma Aldrich	R7757	Blijf steriel
Trypan Blauw Oplossing	Sigma Aldrich	T8154
Trypsine-EDTA 0,5%(10x)	Invitrogen	15400-054
FACSARIA FUSION	BD Pharmingen		Fluorescence Activated Cell Sorter