Snelle en vereenvoudigde methode voor High Through-put Isolatie van miRNA uit Highly Purified high density lipoproteïne

Samenvatting

MicroRNAs spelen een belangrijke regulerende rol en zijn in opkomst als nieuwe therapeutische doelen voor verschillende ziekten bij de mens. Het is aangetoond dat miRNAs worden vervoerd in high density lipoproteïnen. Wij hebben een eenvoudige methode om gezuiverd HDL geschikt voor miRNA analyse uit menselijk plasma snel isoleren ontwikkeld.

Samenvatting

Kleine niet-coderende RNA's (miRNA's) zijn betrokken gebleken bij verschillende menselijke ziekten, waaronder metabole syndromen. Ze kunnen worden gebruikt als biomarkers voor diagnose en prognose of kunnen respectievelijk dienen als doelwitten voor medicijnontwikkeling. Onlangs is aangetoond dat miRNA's worden vervoerd in lipoproteïnen, met name in lipoproteïnen met hoge dichtheid (HDL) en worden afgeleverd aan receptorcellen voor opname. Dit werpt de mogelijkheid op dat miRNA's een kritische en centrale rol spelen in cel- en orgaanfunctie via regulatie van genexpressie, evenals boodschapper voor cel-celcommunicatie en interactie tussen organen. De huidige methoden voor miRNA-isolatie uit gezuiverde HDL zijn onpraktisch bij het gebruik van kleine monsters op grote schaal. Dit komt grotendeels door de tijdrovende en arbeidsintensieve methoden die worden gebruikt voor lipoproteïne-isolatie. We hebben een vereenvoudigde aanpak ontwikkeld om snel gezuiverd HDL te isoleren dat geschikt is voor miRNA-analyse uit plasmamonsters. Deze methode zou onderzoek naar de rol van miRNA's in gezondheid en ziekte moeten vergemakkelijken en in het bijzonder nieuwe inzichten moeten bieden in de verscheidenheid aan biologische functies, buiten de omgekeerde cholesteroltransport, die aan HDL zijn toegeschreven. Ook kunnen de miRNA-soorten die aanwezig zijn in HDL waardevolle informatie bieden over klinische biomarkers voor de diagnose van verschillende ziekten.

Inleiding

MicroRNA's zijn endogene niet-coderende kleine RNA-soorten die sterk geconserveerd zijn en worden beschouwd als sleutelrolspelers bij de regulatie van verschillende biologische processen door het afbreken of onderdrukken van specifieke doelwitten van boodschapper-RNA's¹. Omdat miRNA's intracellulair werken, zijn ze onderzocht als weefselafgeleide biomarkers, wat leidde tot de ontdekking van weefselspecifieke functies van deze miRNA's. Echter, miRNA's worden ook extracellulair gevonden, hetzij geassocieerd met eiwitten of in exosomen/microvesikels die ze effectief kunnen beschermen tegen afbraak door extracellulaire RNases². Recentere studies hebben aangetoond dat het beschermende effect van HDL mogelijk niet nauw verbonden is met zijn vermogen om cholesterolefflux te bevorderen, maar eerder met zijn niet-cholesterolvracht, in het bijzonder als een circulerende miRNA-drager ^{3, 4}. Deze miRNA's kunnen niet alleen het lipidenmetabolisme moduleren, maar zijn ook geassocieerd met anti-inflammatoire, antioxiderende en antitrombotische effecten van het HDL-miRNA-complex ^{5, 6}.

Om de rol van miRNA's in HDL-deeltjes verder te onderzoeken, moet een eenvoudig en gemakkelijk protocol worden vastgesteld voor miRNA-extractie uit geïsoleerde, hoog gezuiverde HDL voor gebruik in de klinische praktijk. Er zijn talrijke methoden beschreven om HDL te isoleren. Deze methoden zijn ofwel zeer tijdrovend of vereisen grote volumes plasma die mogelijk sample-pooling, uitgebreide dialyse voor het ontzouten van geïsoleerde lipoproteïnen vereisen en ze verwijderen exosomen niet volledig als bron van miRNA's³, respectievelijk. Hier beschrijven we een eenvoudige en snelle methode die miRNA kan isoleren uit hoog gezuiverd HDL met behulp van kleine volumes bloedmonsters op grotere schaal. We geloven dat deze methode kan dienen als goede referentie om onderzoek naar de rol van circulerende miRNA's te bevorderen en in het bijzonder de rol van HDL bij het faciliteren van communicatie tussen verschillende cellen en organen.

Protocol

1. Het verzamelen van bloedmonsters

1. Verzamel vasten perifere veneuze bloedmonsters in 10 ml plastic buizen die anticoagulant Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (dit kan enkele voordelen boven andere anticoagulantia heeft) door standaard venapunctie een prominente ader in de antecubitale fossa.
2. Centrifugeer de bloedmonsters bij 1600 xg gedurende 20 min bij 4 ° C in een tafelblad centrifuge plasma vrij van rode bloedcellen en kleine hoeveelheden RNA te verkrijgen.
3. Opeenvolgend centrifugeer het supernatant bij 3000 g (4 ° C) in een swinging bucket rotor gedurende 10 min WBC en bloedplaatjes en bijkomende 15 min verwijderen respectievelijk verwijderen van alle resterende celresten.
4. Meet de dichtheid van het plasma met een densitometer bij kamertemperatuur volgens vervaardiging instructies.
   OPMERKING: Aanpassing van de dichtheid (d = 1,023 g / ml) met 0,9% zoutoplossing vereist kan na verwijdering van exosomen maar vóór dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie.

2. exosome Verwijdering van Plasma

1. Verwijder de circulerende exosomes dat een dichtheid vergelijkbaar HDL hebben en vormen een kwantitatief belangrijke bron van miRNA ^3.
   1. Do hierop door 252 pi precipitatie exosome oplossing van 1 ml plasma, gevolgd door incubatie gedurende 30 min bij 4 ° C. Om pellet de exosomes, centrifuge het mengsel gedurende 30 minuten bij 1500 g bij 4 ° C.
   2. HDL, breng 1 ml van de supernatant tot een polycarbonaat dikwandige ultracentrifuge buis voor verdere verwerking met dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie isoleren (zie hieronder).

3. dichtheidsgradiëntcentrifugatie (figuur 1).

1. Te scheiden HDL gebruik van een 3-staps proces waarbij een vloer ultracentrifuge met vaste hoek rotor werkt bij 448.811 x G en 8 ° C.
2. Bereid drie verschillende dichtheid oplossingen sequentieel en fris voor elke isolement.
   1. Bereid Oplossing A (isolatie van VLDL, d = 1,006 g / ml) door het oplossen van 11,4 g NaCl (NaCl: 0,195 mol), 0,1 g EDTA2Na en 1 ml 1N NaOH in 1000 ml van geautoclaveerd gedestilleerd water. Voeg vervolgens nog eens 3 ml geautoclaveerd gedestilleerd water.
   2. Bereid Oplossing B (isoleren van LDL, d = 1,182 g / ml) door toevoeging van 25,2 g NaBr aan 100 ml oplossing A (0,195 mol NaCl, NaBr 2,44 mol).
   3. Bereid Oplossing C (isoleren van HDL, d = 1,470 g / ml) door mengen van 78,8 g NaBr met 100 ml oplossing A (0,195 mol NaCl, NaBr 7,7 mol). Bevestig de juiste dichtheid bij kamertemperatuur met behulp van een densitometer. Houd alle oplossingen bij 4 ° C tot verder gebruik.

4. Isolatie van VLDL

1. Meng 1 ml plasma (gemiddelde dichtheid = 1,023 g / ml) en nuclease vrij 200 gl Fat Red 7B in een 6,5 ml polycarbonaat dikwandige buis ultracentrifuge.
2. Vervolgens voorzichtig laag 5 ml oplossing A bovenop het mengsel. Indien nodig, voeg extra Fat Red 7B op de top van de oplossing A to balanceren het gewicht van elke buis. Centrifugeer gedurende 2 uur (versnelling - 5), (vertraging - 7).
   LET OP: Tijdens het centrifugeren, worden de lipoproteïnen opgebouwd als een band bij hun evenwicht dichtheid.
3. Aan het einde van de run te observeren 2 lagen. Verwijderen 1,5 ml van de VLDL breuk welke de toplaag en bewaar bij 4 ° C.
4. Bovendien zullen, met een pipet overdracht 4 ml van de bodem van de buis met het LDL, HDL, albumine en vetzuurfractie in nieuw polycarbonaat buis LDL isolatie.

5. Isolatie van LDL

1. Meng 2 ml oplossing B en 100 ul nuclease vrij Fat Red 7B in de buis met de LDL en HDL-fractie (hoofdstuk 4), respectievelijk.
2. centrifugeren vervolgens gedurende 3 uur (9 versnelling, vertraging 7). Daarna verwijdert 1,5 ml van de LDL fractie die de bovenste laag en laten 4 ° C en bewaar bij -80 ° C. Breng tenslotte 4 ml van de bodem van de buis met het HDLfractie om een ​​nieuwe polycarbonaat buis.

6. Isolatie van HDL

1. Meng 2 ml oplossing C, 100 ul nuclease vrij vet Red 7B en 15 pl 98% β-mercaptoethanol in de buis met de HDL-fractie, respectievelijk.
2. Centrifugeer gedurende 3 h (9 versnelling, vertraging 7). Daarna verwijdert 2 ml van de HDL-fractie die de bovenste laag en deze behouden bij 4 ° C en bewaar bij -80 ° C.

7. Het ontzouten en concentratie van lipoproteïnefracties

1. Om interferentie met daaropvolgende agarose gelelektroforese en PCR vermijden de buitensporig zout toegevoegd tijdens dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie middels centrifugale filterinrichtingen met het geschikte molecuulgewicht cutoff (3K buis VLDL en 10K buis LDL / HDL) volgens de instructies van de fabrikant.
   1. Kort na het toevoegen van 2,5 ml koude PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) centrifugalege de gehele VLDL-fractie verzameld tijdens dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie bij 4 ° C gedurende 60 min met een swinging bucket rotor.
   2. Ontzouten de LDL fractie tweemaal met 10 ml ijskoud PBS gedurende 30 minuten elk. Gebruik vervolgens 13 ml ijskoud PBS twee keer voor het ontzouten van de HDL-fractie. Hoe hoger volume PBS moet mobiliteit agarosegelelektroforese verbeteren. Na centrifugeren, verwijderen lipoproteïne bevattende opgeloste stoffen en bewaar bij 4 ° C en bewaard bij -80 ° C.

8. agarosegelelektroforese

1. Perfrom lipoproteïne agarosegelelektroforese onder toepassing van de kit met kleine modificaties van de instructies van de fabrikant als volgt.
   OPMERKING: Deze stap is alleen maar om de kwaliteit en zuiverheid van de geconcentreerde lipoproteïne monsters te beoordelen.
   1. In het kort verkrijgen 6 ui van het ontzoute lipoproteïne fractie met dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie en laden op een prefab lipoproteïne gel. Gebruik menselijke lipopProtein normen voor VLDL, LDL en HDL als maat referentie. Uit te voeren elektroforese bij KT bij 100 V gedurende 60 min met behulp van Rep Prep buffer.
   2. Droog de gel gedurende 10 minuten en daarna kleur wordt 10 minuten bij kamertemperatuur met Fat Red 7B. Destain de gel in een mengsel van methanol-water 75:25 (v / v) en droog weer gedurende 5 minuten.

9. RNA extractie en zuivering

1. Perfrom isolatie van miRNA door gezuiverde humane HDL met behulp van de serum / plasma miRNA isolatie en zuivering kit.
   1. Kort samengevat, voeg 1 ml RNA lysis reagens 200 gl gezuiverd HDL, mengen met een vortexer en vervolgens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om complete dissociatie van nucleoproteïne complexen en inactiveren van RNasen waarborgen.
   2. Spike dan 3,5 pi van synthetische Caenorhabditis elegans microRNA (CEL-miR-39; 1,6 x 10 ⁸ kopieën / ul) in het mengsel. Voer daarna RNA extractie volgens de instructies van de fabrikant.
2. Voer purificatiop geëxtraheerde-miRNA met elueren spinkolommen volgens instructies van de fabrikant. Meet de concentratie van miRNA uit gezuiverd HDL met een spectrophorometer.
   LET OP: Elutie van miRNA uit de spin-kolommen toegepast 16 pi RNase-vrij water.

10. Reverse transcriptie (RT-PCR)

1. Isoleren 100 ng van het miRNA van HDL verrijkt met synthetische miRNA (CEL-miR-39) en reverse getranscribeerd in een 20 pl reactievolume onder toepassing van de reverse transcriptie en kit volgens de instructies van de fabrikant.
2. Voer de juiste controles zonder template miRNA (NTC) en zonder reverse transcriptase-enzym mix (NRT).

11. Real-time PCR (qRT-PCR)

1. Perfrom real-time PCR in een totaalvolume van 20 pi met 2 ui van een 1: 2 verdunning van de cDNA, 10 pi PCR-mix, 2 gl universele primer 2 ui miRNA primers en 4 pi RNase-vrij water.
2. Voer het Reaction in 96-well platen bij 95 ° C gedurende 15 min, gevolgd door 45 cycli van 94 ° C gedurende 15 sec en 55 ° C gedurende 30 s en verlenging fase bij 70 ° C gedurende 30 s.ec alle reacties in drievoud perfrom .
3. Vervolgens calcuate relatieve hoeveelheden miRNA met de 2 ^-ΔΔ Ct werkwijze na normalisatie naar de synthetische huishoudgen volgens instructies van de fabrikant.

Resultaten

Isolatie van high density lipoproteïne na verwijdering van exosomes
Om miRNA verkrijgen van sterk gezuiverd HDL moet worden exosomes die een bron van verontreiniging miRNA ⁷ vertegenwoordigen verwijderen. Dit werd gedaan vóór dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie met een commercieel verkrijgbare kit. Voor praktische doeleinden een driestaps standaard dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie protocol ontwikkeld door commercieel gemodificeer...

Discussie

Identificatie van nieuwe biomarkers uit bloed zal helpen bij de klinische diagnose en prognose van verschillende ziekten. MicroRNA's zijn bekend bij alle kwaliteiten van biomarkers te bezitten en er is aangetoond in diverse studies ^14-17. In deze studie hebben we aangetoond dat een snelle en eenvoudige eenvoudige methode om miRNA isoleren van HDL. Conventionele dichtheidsgradiënt ultra-centrifugatie isolatiemethode van VLDL, LDL en HDL afhankelijk nauwkeurige bemonstering van plasma, nauwkeurige opstellin...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes	Becton, Dickinson and Company	366643
Centrifuge	Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R	75004261
Densito 30PX densitometer	Mettler Toledo	MT51324450
ExoQuick solution	Invitrogen	4484451
Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube	Thermo Scientific	O3237
Sorvall WX100 ultracentrifuge	Thermo Scientific	46902
Fat Red 7B	Sigma-Aldrich	201618
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K	Millipore	UFC901008
Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K	Millipore	UFC800308
QuickGel Lipo kit	Helena Laboratories	3344,3544T
Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL	LipoTrol; Helena Laboratories	5069
Rep Prep buffer	Helena Laboratories	3100
RNeasy MinElute spin columns	Qiagen
NanoDrop 1000 analyzer	Thermo Scientific
miScript II RT Kit	Qiagen	218161
CFX96 Touch real-time PCR detection system	BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit	QIAGEN	217184
miScript Primer Assays	QIAGEN	141078139
miScript SYBR Green PCR Kit	QIAGEN	218073
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control	QIAGEN	219610
NaOH	SIGMA-ALDRICH	480878
0.20 µM sterile syringe filter	SIGMA-ALDRICH	Z227536