Methodenartikel

Hoge-resolutie time-lapse beeldvorming en geautomatiseerde analyse van de dynamiek van microtubuli in Living humane navelstreng endotheelcellen

DOI:

10.3791/54265

⸱

13 augustus 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of the Sciences in Philadelphia

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protocollen voor de kweek van humane navelstrengveneuze endotheelcellen (HUVEC), tijdelijke transfectie van fluorescerend gelabelde markers van microtubulusgroei, beeldvorming van levende cellen en geautomatiseerde analyse van interfase-microtubulusgroeidynamiek worden gedetailleerd beschreven.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het fysiologische proces waarbij nieuwe vaatwanden worden gevormd uit bestaande vaatwanden vereist specifieke signaalgebeurtenissen die morfologische veranderingen in afzonderlijke endotheelcellen (EC's) veroorzaken. Deze processen zijn cruciaal voor homeostatische onderhoud zoals wondgenezing en zijn ook belangrijk voor het bevorderen van tumorgroei en metastase. EC-morfologie wordt gedefinieerd door de organisatie van het cytoskelet, een strak gereguleerd systeem van actine- en microtubuli- (MT) dynamica dat bekend staat om het regelen van EC-vertakking, polariteit en directionele migratie, essentiële componenten van angiogenese. Om MT-dynamica te bestuderen, gebruikten we hoog-resolutie fluorescentiemicroscopie gekoppeld met computationele beeldanalyse van fluorescentie-gelabelde MT plus-einden om MT-groeidynamica en de regulatie van EC-vertakkingsmorfologie en directionele migratie te onderzoeken. Time-lapse beeldvorming van levende Humane Umbilicale Veneuze Endotheelcellen (HUVEC's) werd uitgevoerd na transfectie met fluorescentie-gelabelde MT End Binding proteïne 3 (EB3) en Mitotische Centromeer Geassocieerde Kinesine (MCAK)-specifieke cDNA-constructen om effecten op MT-dynamica te evalueren. PlusTipTracker software werd gebruikt om EB3-gelabelde MT-plus einden te volgen om MT-groeisnelheden en MT-groeitijdsduur in time-lapse beelden te meten. Deze methodologie maakt de studie van MT-dynamica mogelijk en de identificatie van hoe gelokaliseerde regulatie van MT-dynamica binnen subcellulaire gebieden bijdraagt aan de angiogenetische processen van EC-vertakking en migratie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Angiogenese wordt geactiveerd door extracellulaire signalering signalen die endotheelcellen (EC) te bevorderen polariseren, migreren met directionele specificiteit en vormen nieuwe bloedvaten in weefsels die bloedtoevoer nodig. Bijdragende factoren gedacht om angiogenese rijden zijn signalen van de extracellulaire matrix (ECM). In reactie op fysieke signalen, EC uit te breiden nieuwe vestigingen met directionele specificiteit voor gerichte beweging te begeleiden bij de vorming van het vasculaire netwerk 1,2. De architectuur van EC morfologie en vertakking gedefinieerd gelokaliseerd regulering van de microtubuli (MT) cytoskelet op een manier die is afgestemd op de regulering van acto-myosine contractiliteit 3. Om EC takken te vormen, moet myosine-II lokaal worden neerwaarts gereguleerd, wat resulteert in gelokaliseerde membraan uitsteeksels 4. Op hetzelfde moment en op dezelfde locatie in de cel, raken MT groeidynamiek gewijzigd resulteert in trage en aanhoudende MT groei tak Elon bevorderenking en stabiliteit 5. Deze gecoördineerde cytoskelet verordening staat EC om hun morfologie polariseren om directionele migratie te vergemakkelijken.

De ontwikkeling van een gepolariseerde celmorfologie vereist gepolariseerd MT monteren 6. In migrerende epitheelcellen, MT groeien langzaam en aanhoudend specifiek naar de voorrand van de cel 7-9; terwijl neuronen in de inleiding en verlenging van axonen en dendrieten vereist dat MT niet alleen aanwezig, maar dat ze dynamisch het proces van montage en demontage 10-15 ondergaan. Op deze wijze gelokaliseerde controle MT groeidynamiek bepaalt de architectuur van de cel en zorgt voor een snelle herinrichting van celmorfologie ECS navigeren door de ECM.

MT groeidynamiek worden gereguleerd door families van moleculaire motor eiwitten en niet-motorische eiwitten, de zogenaamde microtubuli geassocieerde eiwitten of microtubuli interagerende eiwitten (voortaan afbeeldRred als Maps). Kaarten kunnen lokaal worden geactiveerd of geïnactiveerd, meestal door middel van signalering cascades gestart met de cel-ECM-interface 16,17. Eenmaal actief, MAP-functie door te binden aan het MT en de wijziging van de kinetiek van MT montage en demontage; daardoor functioneren om lokaal te regelen MT dynamiek om de cel vorm en polariteit 18-20 promoten. Mitotische Centromere Associated Kinesin (MCAK) is een Kinesin-13 familie MAP dat zich bindt aan MT uiteinden en koppels ATP hydrolyse tot MT demontage 21-23. Deze functionele rol van MCAK bekend kritiek in de mitotische spoel 24-28, alsook tijdens interfase 29,30 te zijn. Binnen tussenfase EC, wordt-MCAK bemiddeld MT demontage gereguleerd door gelokaliseerde Aurora-A-geïnduceerde fosforylering van MCAK in reactie op de wond-edge-geïnduceerde activering van de Rac1 kleine GTPase. Het resultaat van deze signaalcascade is de remming van MCAK aan de voorrand van EC, resulterend in gepolariseerd groei MT richting de leAding edge and-MCAK geïnduceerde MT demontage aan de achterrand van het migreren van EC 31.

Traditionele methoden voor het bepalen MT groei dynamiek doorgaans gebruikt kant volgen van ofwel fluorescent gelabelde tubuline of, meer recent, fluorescent-gelabelde MT End Bindingseiwit 1 of 3 (EB1 of EB3 respectievelijk). De fluorescerende tubuline benadering het voordeel etikettering van MT gehele array. Omdat de meeste celtypen mitotische een radiale reeks MT houden tijdens interfase 8,32,33, MT vlakbij het ​​centrosoom zeer dicht en daardoor volgen groei MT en demontage fluorescerende tubuline is meestal beperkt tot de perifere gebieden van de cel. Vanwege deze beperkingen, is het gebruik van fluorescent gelabelde eiwitten EB (EB1 of EB3) de meest voorkomende aanpak voor het meten MT dynamiek geweest. Omdat EBS alleen de groeiende plus-uiteinden van MTs label, verschijnen ze als kleine (1-3 pm), fel tl koments, waardoor een gemakkelijk waarneembare marker MT polymerisatie met zeer beperkte achtergrondfluorescentie 34-37. Terwijl dat EBS label slechts een subset van de MT matrix is ​​een grote kracht van de EB benadering ook wijst op een belangrijke beperking zijn die niet groeiende MT niet gelabeld door het EB3 benadering. Desondanks moet het vermogen te meten en volgen EB3 kometen tijd en MT groei binnen subcellulaire's zichtbaar maakt deze aanpak geschikt voor toepassingen die regionale evaluatie van MT organisatie vereist.

Een andere kritieke beperking van traditionele methoden voor het bepalen MT groeidynamiek is zeer grote gegevenssets en de tijd die nodig is voor gegevensanalyse. Deze beperking komt voort uit de noodzaak van de hand volgen van honderden EB kometen met een hoge tijdsresolutie. Bovendien moeten deze metingen uit te voeren in een statistisch significant aantal cellen en ook uitgevoerd onder verschillende controle- en experimental omstandigheden. Onlangs zijn deze beperkingen overwonnen door middel van geautomatiseerde analyse technieken die specifiek gericht zijn op het bijhouden van EB3 kometen met behulp van time-lapse microscopie in levende cellen 35. Bij juist onderhoud deze computationele benadering dient om zowel de kans op menselijke fouten in verband met de hand tracking naast voorzien in een high-throughput werkwijze voor het meten MT polymerisatie beperken. Computationele analyse van MT dynamiek met behulp van de MatLab-gebaseerde software pakket, plusTipTracker, zorgt voor metingen van MT groei door het bijhouden van fluorescent-gelabelde EB3 kometen 5,31,35,38. Daarnaast plusTipTracker software maakt het mogelijk voor berekeningen van MT catastrofe gebeurtenissen (aka demontage) op basis van de verdwijning van EB3 kometen binnen een groeiende MT spoor, en zorgt voor een sub-cellulaire (aka regionaal) analyse van MT groeidynamiek binnen de door de gebruiker gedefinieerde regio's van belang . Voor onze studies, werden MT groeidynamiek in vergelijking binnenvertakte gebieden versus niet-vertakte gebieden of binnen leidende versus trailing celranden. Gegevensuitvoer plusTipTracker software kan ook worden gebruikt om kleur gecodeerde overlays voor individuele cellen en subcellulaire's genereren.

Hier beschrijven we de methode die werd gebruikt om de rol van MCAK bij het moduleren van MT groeidynamiek en de bijdrage van deze MT depolymerase om de regulering van de EC vertakking morfologie en directionele migratie te onderzoeken. Onze aanpak een primaire humane cellijn, humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC), die gemakkelijk gekweekt en zeer vatbaar voor elektroporatie-geïnduceerde, transiënte transfectie van plasmide cDNA zijn. We vervolgens gebruikt high-resolution, time-lapse fluorescentie microscopie van HUVECs getransfecteerd met MT Einde Binding eiwit 3 (EB3) en Mitotische Centromere Associated Kinesin (MCAK) -specifieke cDNA constructen te evalueren effecten op MT dynamiek getransfecteerde HUVEC's. PlusTipTracker-gebaseerde, computer beeldanalyse van EB3gemerkte MT plus uiteinden was om MT groei snelheden en MT groei levens te meten in time-lapse beelden, te meten en te vergelijken effecten van experimentele manipulaties op MT groeidynamiek. Deze methode maakt het mogelijk voor de studie van MT dynamiek en de identificatie van de manier waarop gelokaliseerde regulatie van MT dynamiek binnen sub-cellulaire regio's draagt ​​bij aan de angiogene processen van de EG-vertakking en migratie. Deze technieken zijn van toepassing op onderzoeken van elke MAP die fluorescent kunnen worden gelabeld en uitgedrukt in levende cellen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. HUVEC Cultuur en Onderhoud

  1. Bereid volledige endotheliale basaal medium door de volledige inhoud van de endotheliale celgroei mediumsupplement pakket en 5% penicilline / streptomycine antibiotica mengsel fenolrood vrije endotheliale basale media (zie Materialen / Apparatuur lijst voor details). Warm volledige endotheliale basismedium tot 37 ° C in een waterbad.
  2. Verwijder een HUVEC cryovial uit de opslag van vloeibare stikstof en ontdooien snel in een 37 ° C waterbad gedurende 2 min. Wanneer ~ 80-90% ontdooid, voeg 500 pl volledig verwarmd endotheliale basismedium de cryovial, meng door pipetteren en afzien cellen gelijkmatig in een 100 mm kunststof weefselkweekplaat die 15 ml verwarmd totale endotheliale basale medium.
  3. Plaats cellen in een 37 ° C incubator met 5% CO2. Laat cellen om 's nachts hechten. Niet verwijderen of wijzigen van het celkweekmedium.
  4. Wanneer de 100 mm schaal is> 90% confluent overdragen HUVEC into een 75 cm 2 weefselkweek behandeld kolf en te handhaven op> 60% samenvloeiing te allen tijde (zie stap 1.5).
    Opmerking: Wanneer gehandhaafd op een dichtheid van> 60%, HUVEC een verdubbeling van de tijd consequent 18-20 uur.
    1. Voor situaties waarin passage van de cellen niet nodig (de dichtheid <90%), zuigen en het medium vervangen door verse volledige endotheliale basaal medium elke 48 uur.
  5. Wanneer HUVECs bereiken> 90% samenvloeiing, spoelen 2 maal met 10 ml 1x PBS, en verwijder vervolgens de cellen uit de weefselkweek schotel door ze te behandelen 1,5 ml van 0,25% trypsine gedurende 1-2 minuten bij 37 ° C. Opmerking: De levensvatbaarheid van HUVEC's wordt sterk verminderd door de uitbreiding van de duur van de blootstelling trypsine.
  6. Redding cellen door toevoeging van 8,5 ml compleet endotheliale basaal medium met trypsine / HUVEC mengsel in een verhouding van 4: 1 endotheliale basale media compleet: trypsine (minimaal ratio), en blijft dan op een 15 ml conische buis.
  7. Centrifugeer bij 1400 g gedurende 4 min. aspirerenhet supernatant.
  8. Resuspendeer de pellet in 2 ml compleet endotheliale basismedium en voeg de cellen een nieuwe 225 cm2 weefselkweek kolf die 25 ml volledig endotheliale basale medium.

2. Coverslip Voorbereiding Voorafgaand aan HUVEC Cultuur

  1. Coating Coverslips met fibronectine Substrates.
    1. Bereid deftige 22 mm No. 1.5 dekglaasjes 39 en bewaar bij kamertemperatuur (RT) in 100% ethanol.
    2. Gebruik een bunsenbrander een dekglaasje vlam en plaats deze in een 35 mm petrischaal met een pincet.
    3. Bereid een fibronectine / PBS mengsel door het mengen van 10 ul van fibronectine voorraad (1 mg / ml) met 990 pl PBS.
    4. Pipetteer 250 ul van de fibronectine / PBS mengsel op het dekglaasje in de 35 mm schaal. Gelijkmatig op het oppervlak van het dekglaasje te dekken.
    5. Incubeer de schotel gedurende minimaal 3 uur bij 37 ° C en 3 maal spoelen met 2 ml 1x PBS vóór gebruik.
  2. Coating Coverslips met Polyacrylamide (PA) Substrates.
    1. Coverslip Activation
      1. Plaats een 22 mm No. 1.5 dekglaasje in 50% 3-aminopropyltrimethyloxysilane gedurende 10 minuten op een roer plaat. Na incubatie, was 10 keer gedurende 2 minuten elk in dubbel gedestilleerd H 2 O (DDH 2 O).
      2. Incubeer de dekglaasje in 0,5% glutaaraldehyde gedurende 30 minuten op een roer plaat. Na incubatie was 10 keer gedurende 2 minuten in DDH 2 O.
    2. polyacrylamide Voorbereiding
      1. Bereid een PA gel met een overeenstemming van 0,7 kilopascal (kPa) door toevoeging van 3,75 ml van 40% acrylamide, 0,3 ml 2% bis-acrylamide en 0,95 ml DDH 2 O.
      2. Bereid een 10% werkoplossing ammoniumpersulfaat (APS) en bewaar op ijs tot gebruik.
      3. De PA te bereiden voor 1 dekglaasje (totaal volume = 166,7 pl), voeg 0,83 pl DDH 2 O, 41,7 ui van het bis-acrylamide-oplossing (in stap 2.2.2.1), 124 pl 10% APS en0,25 ui TEMED.
      4. Onmiddellijk pipet 15 ul van PA oplossing op een hydrofoob glasplaatje (zie reagentia List) en dek af met een geactiveerde 22 mm No. 1.5 dekglaasje. Laat de PA polymeriseren 20 minuten bij kamertemperatuur.
      5. Verwijder het dekglaasje overgebracht in een 35 mm schaal. Was 3 maal met 2 ml 1x PBS. Slaan voor <2 weken bij 4 ° C.
      6. Om fibronectine aan de polyacrylamidegel binden, blootstellen-polyacrylamide gecoate dekglaasjes tot 2 mm sulfo-SANPAH met 7500 J van UV-licht (254 nm). Spoel eenmaal met DDH 2 O.
      7. Bereid een fibronectine / PBS mengsel door het mengen van 10 ul van fibronectine voorraad (1 mg / ml) met 990 pl PBS.
      8. Pipetteer 250 ul van de fibronectine / PBS mengsel op het dekglaasje (s) in een 35 mm petrischaal. Gelijkmatig op het oppervlak van het dekglaasje te dekken.
      9. Incubeer de schotel gedurende minimaal 3 uur bij 37 ° C en 3 maal spoelen met 2 ml 1x PBS vóór gebruik.
class = "jove_title"> 3. cDNA Transfectie en HUVEC Cultuur op Coverslip

  1. Compleet stappen 1,5-1,6.
  2. Met behulp van een hemocytometer, tel het aantal cellen en het verzamelen van een volume met 100.000 cellen / dekglaasje (voor niet-migratie experimenten) of 500.000 cellen / dekglaasje (voor de migratie-experimenten). Pellet de cellen via centrifugeren bij 1400 xg gedurende 4 min.
    Opmerking: Migratie protocol wordt beschreven in paragraaf 9 hieronder.
  3. Resuspendeer cellen worden getransfecteerd met 100 gl elektroporatiebuffer. Combineer met 1 ug cDNA en plaats in elektroporatiecuvet. Electroporate cellen: DNA mengsel met behulp van de voor HUVEC elektroporatie programma (bv programma #: A-034).
  4. Rescue getransfecteerde cellen met 500 pi compleet medium en endotheliale basale cellaag op een met fibronectine gecoate 22 mm No. 1,5 dekglaasje (zie Protocol 2.1, hierboven). Incubeer bij 37 ° C gedurende 3-4 uur tijd voor de expressie van cDNA constructen mogelijk.
le "> 4. Voorbereiding van Specimen for Imaging

  1. Snijd dubbelzijdige tape in 2,5 cm x 0,65 cm strips.
  2. Zorg voor een schoon glasplaatje. Neem twee stroken dubbelzijdig tape en zet ze horizontaal langs de boven- en onderrand van de schuif. Opmerking: Het is belangrijk dat een kleine ruimte tussen de band en de schuif rand zorgen voor het afdichten van de kamer zoals beschreven in stap 4,5).
  3. Mount dekglaasje (uit stap 3.4, cel naar beneden) zodat 2 randen van het dekglaasje rust op de band. Gebruik een tang om beneden te drukken voorzichtig aan het dekglaasje te beveiligen.
  4. Met behulp van een micropipet, voeg 40 ul beeldmedium (complete endotheliale basaal medium aangevuld met 25 uM HEPES) tussen het dekglaasje en glijbaan. Zorg ervoor dat de ruimte tussen het dekglaasje en schuif volledig is gevuld met imaging medium. Aspireren overmaat beeldmedium (indien nodig).
  5. Dicht alle randen met warm valap (1: 1: 1 vaseline: lanoline: paraffine). Controleer op lekkages door op gently op het glas dekglaasje.
  6. Place gemonteerd en afgedicht dekglaasje op voorverwarmde (37 ° C) microscoop podium.

5. Microscopie

  1. Met behulp van een draaiende schijf confocale microscoop uitgerust met een 60x, 1,40 numerieke opening (NA) Differentieel Interferentie Contrast (DIC) olie-immersie objectief, een automatische scherpstelling monitoring systeem (PFS), elektronische sluiter voor doorvallende verlichting, een X-en-Y motored stadium banddoorlaatfilters ondergebracht in een elektronische filterwiel, en een monolithische laser combinerende module, de focus van de microscoop bij het grensvlak van de cel / dekglaasje en gebruik de microscooptafel joystick naar één cel te lokaliseren.
  2. Klik op de "Camera-instellingen" paneel in de afbeelding softwareprogramma. Binnen de "exposure time" dropdown-venster van het paneel Camera-instellingen, selecteer 400 msec.
    Noot: De belichtingstijden kan variëren en moet empirisch worden bepaald.
  3. Klik op de "ND Acquisition" paneel in deimage softwareprogramma. Binnen het tabblad lambda (λ) van het paneel ND Acquisition, klikt u op de selectievakjes om de 488 en 561 nm lasers te selecteren. Binnen het tabblad 'tijd' van het paneel ND Acquisition, stelt de overname tijd om 2 sec en de totale tijd om 2 min.
  4. Klik op de "Run Now" knop in het paneel ND Acquisitie naar een 2 min time-lapse reeks afbeeldingen te verwerven op 2 sec acquisitie intervallen met behulp van een 400 msec belichtingstijd voor zowel de 488- en 561 nm verlichting.
  5. In het panel "Optical Config" van het beeld software en het gebruik van de camera-instellingen in stap 5.2 is beschreven, klikt u op de 405 nm laser-knop en klik vervolgens op "Ophalen" om een ​​enkele afbeelding van blauwe fluorescerend eiwit vast te leggen (BFP) gemerkte eiwitten .
    Opmerking: Het is over het algemeen aan te raden om de blootstelling cel (frequentie van het vastleggen van beelden en / of blootstelling tijd) tot 405 nm laser verlichting als deze golflengte kunnen de cellen beschadigen na verloop van tijd te beperken.
    1. Voor MCAK-shRNA studies, eencquire afbeelding een enkele 405 nm om de expressie van de BFP-gelabelde shRNA controleren.
  6. In het panel "Optical Config" van het beeld software en het gebruik van de camera-instellingen in stap 5.2 is beschreven, klikt u op de knop DIC en klik vervolgens op "Ophalen" om een ​​enkele DIC beeld van de cel vast te leggen voor het vertakken morfologische analyse (zie paragraaf 10 , hieronder).
  7. Volgende beeld overname, gebruik dan de "/ contrast helderheid" -functie in de afbeelding software programma om het beeldsignaal digitaal te verhogen.
  8. Exporteer de helderheid en het contrast bijgesteld beelden. Klik op "File" en klik op 'Opslaan als', klik vervolgens op ".tif" voor het type image-bestand te selecteren.
    Opmerking: Dit genereert typisch 61 tif beeldbestanden van een enkele 2 min time-lapse overname wanneer gevangen zoals beschreven in stap 5.4.

6. MT Dynamics Analyse

  1. Voor EB3 tracking, gebruik plusTipTracker software 35, een open-source,Matlab-gebaseerde, computer softwarepakket ontworpen voor automatische detectie, tracking, analyse en visualisatie van fluorescent gelabelde EBS.
  2. plusTipGetTracks Graphical User Interface (GUI)
    1. Om toegang te krijgen tot de plusTipGetTracks GUI, het type plusTipGetTracks.
    2. Voor EB3 komeet detectie, gebruik maken van de GUI te bladeren en selecteer de bovenliggende map die de .tif afbeeldingen bevat.
    3. Binnen het panel volgen parameters van de plusTipGetTracks GUI, voert u de volgende waarden: Zoeken Bereik Radius = 5-10; Minimum Sub-Track Length = 3; Max Gap Length (Frames) = 12; Max Factor Krimp = 1,0; Maximale hoek Forward = 25; Maximale hoek Achteruit = 10; Fluctuatie Radius (beeldpunten) = 2; Frame Rate (sec) = 2; Pixelgrootte (pm) = 110.
      Let op: Controleer eerst voor het optimaal volgen parameters met de plusTipParamSweepGUI op een representatieve set van tif beeldbestanden. De ingevoerde waarde voor de pixelgrootte is specifiek voor het objectief wordt gebruikt om de afbeelding van de time-lapse te verwervens (zie stappen 5,1-5,2, hierboven).
    4. Voor Region of Interest (ROI) selectie, creëren binaire maskers van de gehele cel door met de hand het traceren van de cel rand met behulp van de DIC beeld van de cel om een ​​polygoon te vormen.
    5. Voor Sub-Region of Interest (sub-ROI) selectie, maken toonaangevende en achterrand maskers door met de hand het tekenen van een 2-punts dikke lijn over de wond-edge cel van belang met een aangepaste plusTipTracker sub-ROI selectie tool.
      Opmerking: De lijn parallel met de wondrand op de plaats waar de cel plaats verder dan naburige wond-edge cellen 31 opgesteld.
  3. plusTipSeeTracks GUI
    1. Controleer en visueel te inspecteren het spoor overlays van de TIF beelden die zijn opgeslagen in de "ROI" map door te klikken op de "Plot Sporen" knop in de kolom Track overlays. Herhaal dit voor alle spoor overlays.
    2. Voer gegevens groeperen door te klikken op de knop "Create Groups" in de kolom Optionele instellingen. Selecteer de experimental gegevens die deel uitmaken van dezelfde dataset door te klikken op de gegevensbestanden. Sla de selectie door het geven van de "groep" een naam die gemakkelijk kan worden geïdentificeerd (bijvoorbeeld, "control group").
    3. Voor Sub-ROI MT groeidynamiek metingen, voer het minimum aantal beeldframes die ene EB3 komeet spoor binnen de sub-ROI moet worden gedetecteerd in aanmerking te komen als een "track" en pak MT groei excursies binnen de leidende en achterrand ROI door te klikken op "handmatige selectie" in de "Sub-ROI" panel van de GUI.
      Opmerking: Gebruik bijvoorbeeld 3 frames (6 sec) als het minimum detectie lengte worden gewonnen als een "baan." Onttrokken tracks van sub-ROI worden binnen de oorspronkelijke map ROI voor elke cel opgeslagen in een map sub-project.
    4. MT groei sub-spoor en subpopulatie analyse
      1. Bereken de gemiddelde MT groeisnelheid en de gemiddelde MT groei leven voor "groep" datasets (zie stap 6.3.2), voor elke ROI (zie step 6.2.4), en voor elke sub-ROI (zie stap 6.2.5).
    5. Binnen het Kwadrant Scatter Plots kolom van de plusTipSeeTracks GUI, klik op "Kies groepen" en klik op de groepen (gemaakt in stap 6.3.2) worden vergeleken.
      1. Selecteer "Groeisnelheid" voor de optie x-as en typ de gemiddelde waarde voor de groeisnelheid (van Stap 6.3.4) in de doos. Selecteer "Groei lifetime" voor de optie y-as en typ de gemiddelde waarde voor de groei levensduur (van Stap 6.3.4) in de doos.
    6. Vink het vakje naast 'tracks aan het begin / eind verwijderen "en naast" Batch-proces op groepen. " Klik op "Maak Plots" naar een profiel voor de distributie MT groei tracks voor de gehele cel, voorranden genereren, en aansnijding sub-ROI.
      Opmerking: Voor studies hier beschreven, worden de MT groei tracks verdeeld in vier subpopulaties: traag en van korte duur, traag en een lange levensduur, snel en van korte duur, en een snelle en een lange levensduur.
    7. Kopieer de gemiddelde waarden uit stap 6.3.4 in een spreadsheet programma en sla het bestand met de extensie .xls.
      1. Klik op "Data", klik dan op "Data-analyse" van de Data dropdown-venster. Selecteer "t-test: twee sample bij gelijke afwijkingen" te vergelijken betekenen MT groei snelheden en MT groei levens. Markeer data cellen in het werkblad waar de t-test vergelijkingen resulteren in een p-waarde <0,001.

7. colocalization Analyse

  1. Voor achtergrondinformatie aftrekken, met de "line tool" van de imaging software programma, trek je een Region of Interest (ROI) door te klikken op het scherm om een vierkante vorm die 10 micrometer 2 op de afbeelding groene kanaal (488 nm excitatie) aan te maken een plaats waar er geen mobiele fluorescentie (de achtergrond). Herhaal dit voor de afbeelding rode kanaal (561 nm excitatie) met behulp van de beelden van stap 5.8.
  2. Met behulp van de imaging software program, klik met de rechtermuisknop op de ROI uit stap 7.1 en kies je 'als achtergrond ROI. "Klik op" Beeld ", klik dan op' aftrekken achtergrond" uit het dropdown venster naar de gemiddelde achtergrondwaarden (uit stap 7.1) af te trekken van het hele beeld. Voer achtergrond aftrekken voor cellen die co-expressie Em-Aurora A en hetzij mCherry-MCAK, mapple-EB3 of mapple-tubuline.
  3. achtergrond afgetrokken het rode kanaal alleen, klikt u op de Binary lint en selecteer "Definieer Threshold" en selecteer het "per kanaal" -functie naar de aangewezen fluorescerende marker uit te sluiten.
    Opmerking: De drempelwaarden voor stap werd uitgevoerd op zowel de mCherry-MCAK, mapple-EB3, of afbeelding Mapple-tubuline te laten tekenen van lijnen die specifiek de thresholded object voor co-lokalisatie analyse (zie stap 7.4) gemarkeerd.
  4. Met behulp van de line tool in de imaging software, trek je een 2-punts dikke lijn over de uitgesloten objecten binnen het thresholded afbeelding.
  5. Selecteer de conclusies in stap 7.4 lijn objecten. Kopieer en plak de lijn objecten uit de rode kanaal op het het bijbehorende groene kanaal (Em-Aurora A).
  6. Meet de grijswaarden pixel intensiteit waarden onder de lijn naar de co-lokalisatie en de totale Em-Aurora-A-waarden voor elke individuele cel te berekenen door "maatregel" en vervolgens "Intensity Profile" te selecteren in het dropdown-venster binnen de imaging software programma-objecten.
    1. Het organiseren van de gegevens door de experimentele behandeling en sub-cellulaire regio door te exporteren naar een spreadsheet-programma en het bestand als type .xls besparen (bijvoorbeeld "control_grayscale_intensity.xls").
      Opmerking: De gegevens in dit geval door de co-lokalisatie fractie van de totale gemeten Em-Aurora-A per sub-cellulaire regio.
  7. Met behulp van de gemeten waarden uit stap 7.6, herhaalt u stap 6.3.7 om de statistische significantie berekenen met p <0,05 als de cutoff voor betekenis.
8. immunofluorescentie

  1. Fix-cellen (zie stap 3.4) met paraformaldehyde / glutaraldehyde co-extractie / fixatie buffer (PGF-PHEM; 4% paraformaldehyde, 0,15% glutaaraldehyde, 0,2% detergent in 60 mM PIPES, 27,3 mM HEPES, 10 mM EGTA en 8,2 mm magnesiumsulfaat 4, pH 7,0) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  2. Spoel 3 maal gedurende 5 minuten met 2 ml van 1 x PBS.
  3. Behandel 2 maal gedurende 15 min met 0,01 g / ml NaBH4 in 1x PBS om reactieve aldehyden te doven.
    Opmerking: NaBH4 vormen ballonnen die kunnen leiden tot de dekglaasjes te zweven. Het is essentieel dat de dekglaasjes ondergedompeld blijven in deze incubaties. Indien de dekglaasjes beginnen te zweven, een tang om een ​​rand van het dekglaasje verhogen zodat de bellen kunnen ontsnappen.
  4. Spoel 2 keer met 1x PBS voor blokkering met 5% vetvrije melk in 1x PBS op een schudapparaat gedurende 1 uur bij KT.
  5. Incubeer cellen in primaire antilichamen (konijn anti-pT288-Aurora A (1: 1000)) en rat anti-α-tubuline (1: 500) bereid in 1x PBS oplossing. Incubeer bij 4 ° C op een schommelende platform 's nachts.
  6. Verwijderen primaire antilichamen en spoel 3 maal gedurende 5 min in 1x PBS alvorens te incuberen met secundaire antilichamen (ezel anti-konijn (1: 1000) en geit anti-rat (1: 1000)) bereid in 5% vetvrije melk voor 2 uur bij 37 ° C.
  7. Mount dekglaasje op een glasplaatje in fluorescentie-geoptimaliseerde montage medium. Dicht de dekglaasje randen om de dia met behulp van duidelijke nagellak, en op te slaan in het donker bij 4 ° C.

9. Cel Migratie Assay

  1. Voer HUVEC cultuur voor migratie assays zoals hierboven beschreven (Protocol 3: cDNA Transfectie en HUVEC Cultuur op Coverslip, stappen 3,2-3,3).
  2. Na celtransfectie, redding getransfecteerde cellen met 80 pi compleet endotheliale basale medium. Pipetteer de 80 ul monster als enkele druppel op het midden van een gedroogde met fibronectine gecoate 22-mm rond dekglaasje Nr 1,5. Verspreiden zich niet de 80 ul Drop. Incubeer bij 37 ° C gedurende 3-4 uur tot tijd celadhesie toe in een confluente monolaag.
    Opmerking: Het drogen van het dekglaasje moet worden voorkomen dat de 80 ul druppel verspreiding bij contact van het dekglaasje. Deze aanpak maakt HUVEC's binnen een klein gebied van het dekglaasje te concentreren en bevordert daardoor de snelle vorming van een confluente monolaag van cellen.
  3. Spoel 2 keer in volledige endotheliale basaal medium om niet-gehechte cellen te verwijderen.
  4. Om een ​​"wondrand," create schraap de dekglaasje met een gesteriliseerde scheermes door zachtjes over de HUVEC monolaag te slepen een schone scheermesje (vanaf stap 9.2). Houd het dekglaasje voorzichtig op zijn plaats met een tang om slippen van het scheermesje tijdens schrapen voorkomen.
  5. Laat de cellen te herstellen in een 37 ° C incubator gedurende 3 uur. Assembleren en monteer dekglaasje (s) voor de beeldvorming (zie Protocol 4).
  6. Verwerven fase-contrast en 488 nm beelden met 10 min intervallen gedurende 12 uur op de microscoop met een10x 0,45 NA fase objectief en een 0,52 NA LWD condensor met behulp van de "ND Acquisition" panel van het beeld acquisitie software-programma (beschreven in stap 5.3).

10. Kwantificering van HUVEC Vertakkende en migratie

  1. Voor vertakking analyse en om te kunnen zelfs mobiele verlichting en onpartijdige kwantificering, het verwerven van een microscopisch beeld van een HUVEC getransfecteerde (zie Stap 3.3) en de uiting van de Mapple-C1 cDNA construct, een cel volume marker.
  2. Met behulp van de imaging software programma, opent beeld Mapple-C1 en label de positie aan beide zijden van het kantoor waar het membraan wordt de grootste hoek van de kromming. Sluit deze twee punten met een rechte lijn. Deze lijn is de "branch oorsprong."
  3. Met behulp van de line tool van de imaging software, visueel te identificeren takken die meten> 10 urn in lengte van de "branch origin" bepaald in stap 10.2. Bereken de scheutlengtes door de afstand van he "branch oorsprong" om de meest distale punt van het bijkantoor tip (zie figuur 4).
  4. Tel het aantal vertakte uitsteeksels met afmetingen> 10 urn lang te verkrijgen "cel filiaalnummer."
  5. Migratie analyse via de in fase 9,6 beelden visueel identificeren een wond-edge HUVEC basis van fysieke locatie (dwz elementen fysiek aan de rand van de wond) en expressieprofiel (dwz, selecteer een groene wondrand cel als het experiment omvat expressie van GFP).
  6. Met het fasecontrast beelden van de cel, visueel identificeren van de kern (de semi-transparante bolvormige structuur nabij het centrum van de cel), en vervolgens visueel de nucleolus (kleine donkergekleurde, bolvormige structuren in de kern) identificeren de eerste keer dat punt van de time-lapse beelden. Op de positie van de nucleolus naar de x- en y-coördinaten van de nucleolus label.
  7. Met behulp van imaging software, met de hand volgen denucleolus in opeenvolgende time-lapse beelden door te klikken op de positie van de nucleolus om de x- en y-coördinaten van de nucleolus label in elk frame van de time-lapse film (figuur 4).
  8. Met behulp van de imaging software, klikt u op "File" en klik vervolgens op Opslaan als "en klik vervolgens op om het type image-bestand selecteren" .xls. "
  9. Open de hand bijhouden databestand (van stap 10.8) met behulp van een spreadsheet-programma. Bereken het gemiddelde migratie snelheid en betekenen migratie afstand tot de oorsprong.
  10. Met behulp van een spreadsheet programma, klik op "Data", klik dan op 'Data Analysis "uit het dropdown-venster Data. Selecteer Bonferroni-gecorrigeerde, one-way analyse van de test strijd met> 95% betrouwbaarheid als de cutoff voor statistische significantie.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HUVEC cultuur live-cell microscopie
Levende cellen beeldvorming van HUVECs expressie fluorescerende eiwitten vereist dat HUVEC's in een omgeving die geschikt is voor normale groei en onderhoudscel, evenals normale eiwit expressie en functie gehandhaafd. Figuur 1 toont een schematische weergave van het protocol gebruikt voor het bereiden van een gebufferde en gesloten systeem dat handhaaft geoptimaliseerd optische kenmerken voor het verzamelen van time-lapse beelden van levende cellen. Dunne stroken dubbelzijdig tape geplaatst op een glasplaatje (figuur 1A) en het dekglaasje met de gekweekte HUVEC omgekeerd boven de band zodanig dat de cellen worden geconfronteerd met de schuif (figuur 1B). Zo levert de band een kleine opening tussen de beide oppervlakken en creëert een ruimte waarin de cellen worden gebaad in geschikte celkweekmedium (figuur 1C, zie Protocol 4, hierboven). ikna laatste stap wordt de glazen dekglaasje gelast aan het glaasje met een vaseline: lanoline: paraffinewas (1: 1: 1 mengsel, valap Figuur 1D) een gesloten systeem. Deze celkweek aanpak werd gebruikt voor zowel de kortere tijdreeks beeldvorming van EB3 kometen en voor de langere tijdreeks vertakking en migratie experimenten. Bovendien, de wasachtige consistentie van valap zorgt voor gemakkelijke verwijdering uit de glasplaatje en dekglaasje aan het einde van een imagingexperiment zodat aanvullende benaderingen zoals fixatie en immunolabeling (zie Protocol 8), kunnen worden uitgevoerd op dezelfde dekglaasje en celmonster die werd gevisualiseerd met behulp van de live-cell imaging aanpak.

figure-results-1
Figuur 1:. Methodologie van HUVEC cultuur live-cell microscopische imaging (A) Knip 2 stukken van dubbelzijdige tape in 0,65 cm x 2.50 cm rechthoekige strips en veilig een stuk dubbelzijdige tape horizontaal langs de bovenrand van de schuif, en het andere stuk, langs de onderrand van de schuif. Het is belangrijk dat een kleine ruimte tussen de band en de schuif rand zorgen voor het afdichten van de kamer zoals beschreven in (D). (B) Met behulp van een tang verwijder het dekglaasje met HUVECs en draai de dekglaasje (cel naar beneden) bovenop de stukken tape. (C) Een micropipet, voeg 40 pl beeldmedia (complete endotheliale basaal medium aangevuld met 25 uM HEPES) tussen het dekglaasje en het glaasje. Zorg ervoor dat de ruimte tussen het dekglaasje en schuif volledig is gevuld met imaging media en vermijd bubbels. Gebruik een aspirator langs de rand van het dekglaasje om overtollige media te verwijderen, indien nodig. (D) Met warm valap (1: 1: 1 vaseline: lanoline: paraffine) voor afdichting rondom de randen van het dekglaasje. Controleer op imaging media lekkages door te drukken rond voorzichtig op het dekglaasje. Gebruik extra valap te verhelpen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Geautomatiseerde bijhouden van fluorescent-gelabelde EB3 zorgt voor een uitgebreide analyse van de gehele cel en regionale dynamiek MT groei. De verzameling duidelijk onderscheiden en zeer tijd- en ruimte opgelost microscopische beelden van de EB3 eiwit essentieel is voor de analyse van EB3 stromingen binnen de cel. HUVEC expressie van fluorescent-gelabelde EB3 varieert sterk van cel naar cel en fluorescentie-intensiteit verhoogt meestal binnen dezelfde cel gedurende hr. Aldus is het belangrijk dat de deze veranderingen in expressieprofiel volgen om mogelijke effecten van verhoogde expressie EB op MT groeidynamiek identificeren. Dit wordt het beste bereikt door het evalueren van grijswaarden fluorescentie intensity profielen voor elke afgebeeld cel en gegevensanalyse beperkt tot die cellen die een bepaald bereik van grijswaarden expressieprofielen geven. Eerste evaluatie van expressieprofiel datasets is kritisch en moet worden vergeleken met MT groeidynamiek gegevens die verkregen door plusTipTracker software voor elke cel. Expressieprofielen kunnen worden uitgezet tegen MT groeisnelheid en MT groei levensduur van elke cel in een experimentele groep teneinde het gewenste bereik van grijswaarden expressie te bepalen en om mogelijke uitschieters te identificeren.

Figuur 2 hoogtepunten een HUVEC gekweekt op een fibronectine substraat (zie Protocol 2.1, hierboven) en tot expressie brengen in de buurt van een optimaal niveau van Mapple-gelabelde EB3. Fluorescerende EB3 kometen wordt in een time-lapse reeks beelden gedurende 12 seconden (Figuur 2A). Analyse van EB3 kometen met behulp van plusTipTracker software gaat om een ​​geautomatiseerd, beeld-voor-beeld EB3 komeet detectie (groene en gele stippen, figuur 2B). Kometen ontdekt binnen elk frame worden vervolgens gekoppeld, afhankelijk van hun verandering in de positie van het frame-to-frame, te EB3 tracks en een visuele EB3 spoor overlay (figuur 2C-F) te genereren. Track overlays zijn kleurcodering en de kleur onderscheid kan worden bepaald door parameters die door de gebruiker zijn ingevoerd. Gewoonlijk deze onderscheidingen gebruik maken van de wereldwijde gemiddelde van MT groeisnelheid en MT groei levenslange 5,31 en daarmee splitsing van de gegevens in vier groepen: traag en kortstondige (rood), traag en een lange levensduur (geel), snel en op korte gewoond (groen), en snel en langlevend MT groei (blauw; figuur 2G). PlusTipTracker-gemedieerde volgen van EB3-gelabelde MT groeidynamiek maakt het ook mogelijk de gebruiker gedefinieerde regio's van belang (ROI). PlusTipTracker haalt de MT groeispoor data vanuit de gebruiker gedefinieerde ROI (Figuur 2A, B en F), waardoor vergelijkingen van MT groei dynamics binnen verschillende gebieden van dezelfde cel.

figure-results-2
Figuur 2: EB3 komeet detectie, tracking en plusTipTracker data-uitgang (A) time-lapse film van een HUVEC uitdrukken mapple EB3.. Linker paneel toont een heel uitzicht cel en volledige cel masker (witte lijn) markeren van de cel grenzen. Rode doos staat voor het ingezoomde gebied in de time-lapse beelden (rechts panelen). Rechts panelen tonen ruwe grijstinten time-lapse beelden van EB3 kometen in opeenvolgende frames imaging (t = 0 sec - t = 12 sec). (B) plusTipTracker detectie van EB3 kometen van de in (A) beelden. Linker paneel toont een gehele cel weergave van gedetecteerde kometen (gele stippen). Rode doos staat voor het ingezoomde gebied in de time-lapse beelden (rechts panelen). Rechter panelen benadrukken vijf gedetecteerd EB3 kometen (rode pijlen) en sporenelementen die vijf kometen over de 12 sec imaging periode. Groen stippen vertegenwoordigen gedetecteerd EB3 kometen die niet bestonden (of werden niet gedetecteerd) in de voorgaande tijdsinterval. (C) Maximale intensiteitsprojectie van 61 frames (2 min film) van de EB3 kometen getoond in (A). (D) plusTipTracker MT spoor overlay van dezelfde 61 frames (2 min film) getoond in (C). (E) Zoom van maximale intensiteit projectie (rode doos in C). (F) Zoom van plusTipTracker MT spoor overlay van maximale intensiteit projectie (rode doos in D). (G) Kleur-gecodeerde legenda voor spoor overlays getoond in (D) en (F). Aanwijzing zo langzaam, snelle kortstondige of lange duur is gebaseerd op de gemiddelde waarde voor alle sporen groei gemeten in een groep van tien MAPPLE-EB3 expressie HUVEC. Voor eenvoudiger visualisatie zijn spoor overlays in (D) en (F) gegenereerd met omgekeerde pixelintensiteiten de afbeeldingscel getoond in (A). Schaalbalken = 20 urn./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

HUVEC vertakking en migratiepatronen zijn gevoelig voor mechanisch-fysieke signalen van de ECM.

HUVECs zijn bekend om te reageren op verschillende soorten signalering signalen en daarmee morfologische veranderingen die een geschikte cellulaire reactie op de specifieke signalering cue (s) 36,40-42 bepalen ondergaan. HUVECs gekweekt op fibronectine beklede glassubstraten (figuur 3A), of stijve 2-dimensionale polyacrylamidegel ECM's (55 kPa) typisch een ronde of langwerpige morfologie met weinig afzonderlijke vertakte uitsteeksels (figuur 3B) weergegeven. Echter, indien gekweekt op zacht 2-dimensionale polyacrylamidegel ECM (0,7 kPa), HUVEC's vertonen een sterk vertakte morfologie die bekend is gevolg van naleving geïnduceerde benedenregulering van myosine-II contractiliteit 4,5,31 (figuur 3C). Aldus HUVEC zelfregulering van celmorfologie met ECM mechanosensing, en dit wordt bereikt door gelokaliseerde modulatie van MT dynamiek en acto-myosine contractiliteit.

Omdat HUVECs diverse morfologische kenmerken weergeven, om HUVEC meten vertakking is het essentieel om eerst definiëren wat een vertakte uitsteeksel, en vervolgens te bepalen hoe een vertakte uitsteeksel objectief gemeten. Een techniek maakt gebruik van vier stappen benadering waarbij een celgrens of "masker" gegenereerd handmatig opsporen van de randen van de cel met een beeld van een cel die een fluorescerende volumemarkering de celranden (Figuur 3D) omschrijven. Na masker generatie zijn tak oorsprong gedefinieerd lokaliseren grootste hoek van de kromming tussen het vertakte uitsteeksel en het cellichaam. Een lijn wordt getrokken naar Demark de "branch origin" (paarse schuine lijnen Figuur 3E). Branch nummer is gewoon gemeten door het tellen van het aantal vestigingen met een bepaalde tak oorsprong (figuur 3F). Scheutlengtes wordt gemeten als de afstand van de tak oorsprong naar het distale uiteinde tak (Figuur 3G). Om opname van kleine lamellipodia projecties van gegevensanalyse voorkomen, aanvullend criterium dient branches langer ( "branch length") moet dan breed (de 'branch origin "), en die zich vertakt moet ten minste tien micron lengte 5 , 31.

figure-results-3
. Figuur 3: Analyse van HUVEC vertakking morfologie (A - C) DIC image voorbeelden van HUVEC's gekweekt op fibronectine gecoate glazen ECM (A) stijve (55 kPa) polyacrylamide ECM (B) en zachte (0,7kPa) polyacrylamide ECM (C). Vertakking is sterk toegenomen in HUVEC's gekweekt op 0,7 kPa polyacrylamide ECM (C) in vergelijking met stijvere ECM's (A, B). (D). DIC microscopische afbeelding (afbeelding links) van een getransfecteerde HUVEC uitdrukken van een mapple-C1 cDNA construct (een cel volume marker; rechter afbeelding). (E) Definieer de branche oorsprong door het lokaliseren van de grootste hoek van de kromming (dat wil zeggen de positie waar het membraan wordt de grootste kromming, paars-gekleurde lijnen) aan weerszijden van de branche en sluit vervolgens de hoeken met een rechte lijn (blauwe lijnen) . (F) te identificeren en te selecteren vertakte uitsteeksels die> 10 urn uit te breiden van de "branch origin" (zoals gedefinieerd in E). Tel het aantal vertakte uitsteeksels aan het verkrijgen van "branch-nummer." (G) Meet de afstand van het centrum van de 'branch oorsprong "naar de most distale punt van de branche met behulp van de line tool in de annotaties en metingen toepassing van NIS Elements Software om het verkrijgen van "branch lengte." Schaal bars = 20 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naast sensing ECM compliance, HUVEC ook voelen en te reageren op de afschaffing van de aangrenzende cellulaire contacten geïnduceerd door scratch verwonden. In de migratieanalyse, HUVEC's gekweekt in een monolaag worden onderworpen aan een kras wond en migratie karakteristieken worden gemeten (zie protocol 9 hierboven). Na inductie van de wond door krabben de monolaag, wond-edge HUVEC polariseren Door een stuwende voorrand die zich uitstrekt in de wond (figuur 4A, t = 0 uur). Over een tijdsverloop van 10-12 uur, gepolariseerde wond-edge HUVEC migreren in de wond gebied en vul dewond, de oprichting van een nieuwe samenvloeiende monolaag (Figuur 4A, t = 11 uur). Net als bij HUVEC vertakking, de huidige gegevens blijkt dat polarisatie en migratie is kritisch afhankelijk van de gecoördineerde reorganisatie van het MT en actine cytoskeletons 43-49. Dit wordt bereikt, deels door gelokaliseerde remming van MCAK geïnduceerde MT demontage aan de voorrand, maar niet aan de achterrand van wond-edge HUVEC 31. De gevoeligheid van MT dynamiek-wond geïnduceerde polarisatie wordt geïnitieerd door de Rac1 GTPase, waarin tal van downstream-regulator eiwitten, waaronder Aurora-A kinase dat fosforyleert en remt MCAK aan de voorste rand, en andere kinasen die in staat zijn tot het remmen of activeren van kaarten zijn doelen lokaal moduleren MT groei en krimp 18,31,36,48,50-53. Uitgebreid experimenteel bewijs ondersteunt het idee dat de coördinatie van de leading edge uitsteeksel en achterrand krimp wordt bestuurd door cycli van Rac1 activeringMT montage op de leading edge en RhoA activering Acto-myosine contractiliteit te bevorderen op de achterrand, waardoor gericht beweeglijkheid 9,41,51,52,54-58 rijden.

Tot op heden is er geen gevestigde methode voor het uitvoeren van geautomatiseerde volgen van celmigratie. Dit is een gevolg van de moeilijkheden bij het computationeel analyseren van cel-ECM grenzen die constant veranderen als wond-edge cellen polariseren en migreren. Hoewel veel software programma kan volgen fluorescent gelabelde cellen 59-64 zijn de populatie van fluorescent gelabelde HUVEC in opgewikkelde edge migratie experimenten ongeveer 30-40% van de totale bevolking HUVEC, en dus de meeste van de wond-randcellen must worden gevisualiseerd door fase-contrast beeldvorming of DIC. Daarnaast is het van belang bij het meten wond-edge migratie fluorescerende en niet-fluorescerende cellen evalueren binnen dezelfde wond om vast te stellen specifiekeeffecten van expressie constructen, zowel binnen de experimentele studiegroepen en tussen experimentele studie groepen. Momenteel is de beste aanpak om HUVEC migratie te meten is om een hand te volgen aanpak waarbij een wond-edge cel eerst wordt geïdentificeerd en vervolgens de kern en nucleolus geïdentificeerd (Figuur 4B) te gebruiken. De nucleolus wordt gebruikt als de positie bepalend voor cell tracking vanwege de hoge dichtheid en lichtverstrooiing relatief kleine omvang. Deze twee functies van de nucleolus gemakkelijker te identificeren en te verminderen meetfouten door beperking van het gebied waarin de gebruiker een afzonderlijk nummer posities plaatsen. HUVEC migratie tracks worden vervolgens gegenereerd door te klikken op de nucleolus in opeenvolgende time-lapse afbeelding frames. Tenslotte migratie snelheid en migratie afstand tot oorsprong worden gemeten en geanalyseerd voor de controle en experimentele celgroepen (figuur 4B).

figure-results-4
Figuur 4: Analyse van de wond-edge HUVECs en migratie volgen (A) 20X fase-contrast beelden van een 11 hr time-lapse imaging serie scratch wond-edge HUVEC (aka "Migratie Assay").. De wond en trekrichting aangegeven in panel t = 0 uur. HUVECs worden getoond aan de wond rand en verder steken in de wond totdat een monolaag van cellen wordt gevormd (t = 3,5 uur - t = 11 uur). (B) Analyse van migratieanalyse time lapse imaging (zie A) moet eerst de identificatie van een traceerbare wond-edge HUVEC gebaseerd op cellocatie (dwz elementen fysiek aan de rand van de wond) en expressieprofiel (i .e. selecteer een groene wondrand cel als het experiment gaat om de expressie van GFP). afbeelding van de fase contrast met behulp van, identificeren van de kern en de nucleolus. Hand volgen de nucleolus in opeenvolgende time-lapse beelden met behulp van de eennotaties en metingen toepassing in NIS Elements software om migratie snelheid en de afstand tot de oorsprong te bepalen. Schaal bars = 100 micrometer (A), 20 pm (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van HUVECs in morfologie en migratie experimenten.
Levende cellen beeldvorming van EB3 gemerkte MT groeidynamiek in HUVEC vereist geschikte en reproduceerbare celkweek voorwaarden om te meten en beoordelen veranderingen in MT groei en morfologie HUVEC, zodat ze vervolgens kunnen worden toegewezen aan een ECM-signalerend cue. HUVECs vertegenwoordigen een uitstekend model voor het bestuderen van de cel vorm en beweeglijkheid. Ze zijn zeer vatbaar voor transfectie met fluorescent gelabelde cDNA, ze vertonen dramatische morfologie in reactie op zowel oplosbare en fysieke signalering signalen, en ze behouden de mogelijkheid om zich te organiseren in vasculaire tubes indien passende celkweekomstandigheden 65-70. Primaire celkweken, zoals HUVEC, zorgvuldig worden behandeld en worden bewaakt cellen passage nummer om te bereiken de cellen gezond en dat ze gewoonlijk gedragen tijdens experimenteren. Bijvoorbeeld, bij het uitvoeren van experimenten die de cytoskeleton en / of celmorfologie dient HUVEC niet worden gebruikt voor experimenten na de tiende celcultuur passage, zoals HUVEC's beginnen meestal aan niet-uniforme morfologie rond doorgang twaalf tot vijftien weergegeven.

Celdichtheid is ook een kritische regulator van HUVEC gezondheid en proliferatie. HUVEC vertakking onderzoeken (zie protocol 10,1-10,4 hierboven) gebruikt relatief lage celdichtheid kweken teneinde de cellen fysieke ruimte om met ECM en vertakte uitsteeksels verlengen. In tegenstelling, in de wond-edge migratie studies (zie Protocol 10,5-10,8), HUVEC zijn cultuur in een monolaag voorafgaand aan de verwonding. Als zodanig gewikkeld rand HUVEC relatief niet-vertakte morfologie weergegeven verlengen voorrand uitsteeksels en vertonen cel-cel interacties met hun directe buren als ze migreren in de wond.

Voorbehoud en voordelen van Tracking MT Dynamiek in Living HUVEC's.
Draaiende schijf microscopie is een uitstekende benaderingtesten experimentele hypothesen die confocale helderheid van het beeld met een hoge tijdsresolutie vereisen. Met de juiste camera en laser module, dit microscopie benadering is gevoelig voor lage emissie fluorescentie en kan helpen bij verminderde fotobleken vergelijking met andere soorten van fluorescentie microscopie. Belangrijk is dat deze benadering ook zeer geschikt voor matige tot hoge tijdsresolutie beeldvorming zoals vereist voor het genereren van uitgebreide metingen van MT groeidynamiek met de EB3 labeling benadering in verschillende celtypen.

Terwijl de EB3 methode etikettering groeiende MT plus-uiteinden heeft verschillende voordelen boven andere methoden van fluorescent labeling MTS, maar heeft ook unieke nadelen. Zo is er een deel van de MT array niet actief groeit op een bepaald moment, zowel de populatie demonteren MT en de populatie van stabiele, niet-dynamische MT 71-74. EB3 zouden deze twee populaties van MT's labelen endus de bijdrage van deze twee populaties zouden niet bij experimentele gegevensanalyse. Alternatieve methoden voor het evalueren van de gehele matrix MT gericht op expressie van fluorescent gelabeld tubuline, die wordt opgenomen in alle populaties van MT en kunnen worden vastgesteld groeien, krimpen en stabiele MT. Vanwege de relatief hoge dichtheid van de MT matrix nabij het centrum van de cel en grenzend aan het microtubule organiserende centrum (MTOC) merken van het gehele MT matrix creëert een nadeel uitvoeren beeldanalyse van MT uiteinden die niet vlak bij de cel periferie 75-77. Experimenten met twee-color co-labeling met fluorescerende MTS tubuline en fluorescerende EB3 in levende cellen is gebleken, kwalitatief, dat de overgrote meerderheid van tubuline-gelabelde MTs ook EB3-gelabelde 78. Daarnaast is er geen efficiënte methode geautomatiseerd volgen van MT gelabeld met fluorescerende tubuline geweest. Dit betekent dat de gegevens inzametie en metingen van MT dynamica in cellen die fluorescent tubuline vereisen kant volgen van individuele MTS, een proces dat foutgevoelig en vervelend. Daardoor is geautomatiseerde computeranalyse van EB3 gemerkte MT worden de geprefereerde methode voor het meten MT dynamiek kan worden toegepast op MT dynamiek experimenten in talrijke celsoorten en bij verschillende experimentele regimes 35,79.

Het koppelen van MT groeidynamiek om HUVEC morfologie en migratie.
Vanuit een cytoskelet onderzoeker, een uiterst nuttig aanpassing van de plusTipTracker geautomatiseerde analyse volgen is het vermogen te meten en zowel volledige cellen en regionale veranderingen in MT groeidynamiek evalueren. De eis voor een cel om gepolariseerd is een essentiële voorwaarde voor directionele cel migratie. Als zodanig gepolariseerd signalering signalen zijn al lange tijd bekend als de belangrijkste drijvende factoren voor gerichte celmigratie 30,31,51,54,56,80,81 . Oplosbare signaalmoleculen zoals VEGF induceren actine polymerisatie en MT groei naar de cue VEGF in endotheliale celsoorten 2,82-87. Bovendien, als reactie op fysieke interactie met de ECM (bijvoorbeeld compliance en dimensionaliteit mechanosensing), HUVEC moduleren hun MT dynamiek van lokaal regelen MAPs MT groei te bevorderen binnen verlengen vertakte uitsteeksels en dit dient om HUVEC migratie begeleiden in de richting van de cue 5,31,88. Aldus polarisatie in respons op extracellulaire signalen signalen benadrukt de noodzaak experimentele evaluatie van gelokaliseerde veranderingen in cytoskelet dynamiek.

Tegelijkertijd live-cell imaging van MT groeidynamiek (de EB3 benadering) en HUVEC celmigratie is uiterst moeilijk zijn omdat MT groeien op een tijdschaal van seconden, terwijl veranderingen in celmorfologie en gerichte migratie plaatsvinden op een tijdschaal van uren. Maar beide processen zijn nauw linked. Bovendien, continue, snelle beeldvorming van fluorescent gelabelde EB3 op de tweede tijdschaal leidt tot fotobleken van de EB3 signaal. Pogingen om dit probleem op te lossen door het uitvoeren van beeldvorming korte reeks EB3 (1-2 min acquisitie serie) elke 30 minuten waren succesvol, maar kon slechts worden bereikt in een klein aantal EC dat optimale expressie van EB3 hadden en die niet weergegeven nadelige effecten herhaalde laserbelichting 5.

Een alternatieve benadering die het mogelijk maakt voor interpretaties van hoe MT groeidynamiek bijdragen aan veranderingen in de cel morfologie en migratie is de plusTipTracker Region of Interest (ROI) gereedschap 35 (zie Protocol 6.6). Deze methodologie maakt volledige cellen MT groei circuits onderverdeeld in door de gebruiker gedefinieerde gebieden waaruit MT groei titels dan kunnen worden geëxtraheerd en geanalyseerd worden. Zo zijn vergelijkingen van "vertakte" versus "niet-vertakte" gebieden van de cel bleek dat MT groeien sbescheiden en aanhoudend binnen vertakte gebieden vergeleken met de niet-vertakte celperiferie 5. In gepolariseerde wond-edge HUVEC's, een vergelijking van de voorrand en achterrand groeidynamiek edge MT bleek dat-MCAK geïnduceerde MT demontage specifiek wordt geremd binnen de leading edge, maar niet de achterrand. Regionale evaluatie van de leidende en achterrand MT groeidynamiek in HUVEC uitdrukken Rac1 en / of fosforylering mutanten van MCAK verder bleek dat Rac1-geïnduceerde activering van Aurora-A kinase specifiek en lokaal MCAK activiteit remt binnen de leading edge om HUVEC polarisatie en directionele migratie rijden 31. Zo is de combinatie van geautomatiseerde volgen van MT groeidynamiek en regionale evaluatie van MT groei dynamiek binnen de vertakte uitsteeksels en / of de voorste rand van de wond-edge HUVEC heeft ons toegelaten om MT groeidynamiek koppelen aan HUVEC morfologie en migratie.

De beschreven protocollen zijn designed om een ​​over het algemeen eenvoudig en zeer herhaalbare methodologie voor HUVEC cultuur en experimenteel onderzoek te bieden. Desalniettemin zijn veel van de protocol details zijn ingewikkeld en tijdrovend, hetgeen op zijn beurt biedt de kans op fouten of moeilijkheden bij het uitvoeren van de experimentele methode. Hoewel het werd geprobeerd om potentiële problemen aan te pakken in het hele protocol, hier is aanvullende, gedetailleerde oplossen van mogelijke problemen die minder vaak of anderszins afgekort als noten binnen de methodologie protocollen.

Gerelateerd aan coating dekglaasjes met polyacrylamide substraten (2,2 Protocol), een gemeenschappelijk probleem dat zich voordoet is de complexiteit activeren dekglaasjes, polyacrylamide koppelen aan het glas, activerende polyacrylamide en vervolgens koppelen ECM het polyacrylamide. Een bijzonder moeilijk en potentieel problematische stap kweken van HUVEC op de fibronectine / polyacrylamidegel na blootstelling van de polyA-Crylamide beklede dekglaasjes tot 2 mM sulfo-SANPAH (stap 2.2.2.6 hierboven). Het is cruciaal voor het succes van het kweken van HUVEC volgende substraten die sulfo-SANPAH volledig verwijderd uit het volgende experimentele systeem ECM conjugatie. Dit kan het best worden bereikt door wassen met DDH 2 O en incuberen van de dekglaasjes in DDH 2 O op een schudder overnacht. Als cellen gekweekt op de polyacrylamide ECM niet overleven, of als levensvatbaarheid lager dan verwacht, vergroot en herhaald wassen van sulfo-SANPAH na conjugatie fibronectine (stap 2.2.2.9) wordt aanbevolen om mogelijk dit probleem te verlichten.

Protocol 3 (cDNA transfectie en HUVEC cultuur op een dekglaasje) gerelateerd, een grote invloed op het succes van de elektroporatie werkwijze is de behandeling van de HUVEC zowel tijdens trypsine van de cellen om ze uit de kunststoffles verwijderen en na het sluiten van de elektroporatie (stappen 3,3-3,4, hierboven). Het is cruciaal om zorgde HUVECs volledig controleren terwijl in trypsine, en niet de tijd die nodig is voor de cellen "round-up" op het oppervlak van de kolf (typisch 1-2 min) overschrijden. Veel tijd in trypsine is een belangrijke oorzaak van dood HUVEC, die doorgaans niet gerealiseerd totdat de cellen op met fibronectine gecoate dekglaasjes (stap 3,4) uitgeplaat en vervolgens niet hechten aan het substraat.

Even belangrijk, niet HUVEC's (en de meeste primaire celtypes) niet goed doen als geschorst voor lange tijd in de elektroporatie buffer. Tijdens grootschalige experimenten, bijvoorbeeld wanneer de gebruiker vijf of meer aandoeningen die elektroporatie vereist, is het beter om de cellen gepelleteerd in afzonderlijke buizen (1 tube per transfectie) één-per-tijd houden en te mengen, in de elektroporatie buffer onmiddellijk vóór elektroporatie. Deze aanpak minimaliseert de incubatietijd in elektroporatie buffer en maximale HUVEC overleven. Daarnaast onmiddellijke redding in volledige cultuur media is ook critical na elektroporatie. Redding vertraging van één minuut of meer elektroporatie kan tot vrijwel volledige HUVEC dood en derhalve moeten worden vermeden.

Verwante celmigratie assay (Protocol 9), de techniek van het kweken van HUVEC's bij extreem hoge dichtheid hangt kritisch modificatie van de traditionele HUVEC celkweek methode (in Protocol 3 beschreven) (in stap 9.2 beschreven) dat drogen van de fibronectine gecoate dekglaasje vereist om HUVEC cultuur staat in een zeer klein gebied van het dekglaasje. Vaak wanneer het dekglaasje niet volledig gedroogd of vooraf bekleden van het dekglaasje met fibronectine (stappen 2,1 en 2,2) was niet efficiënt, het medium dat cellen bevat die is geplaatst op het dekglaasje zal de oppervlaktespanning verliezen en uit te breiden naar de randen van het dekglaasje, waardoor de dichtheid van cellen op het dekglaasje verminderen. Eén methode om dit potentiële probleem op te lossen is om de media te zuigen uit het dekglaasje enPlaats het dekglaasje (nog in de 35 mm gerecht) in de achterkant van de bioveiligheid kast voor 5-10 min. Deze aanpassing kan helpen om de luchtstroom binnen de kast mogelijk te helpen bij het drogen van de schotel. Als zichtbare vloeistof op het dekglaasje na drogen aan de lucht blijft, zuig het vloeibare vlekken en weer laat aan de lucht drogen voor 5-10 extra min in de bioveiligheid kast. Het is belangrijk op te merken dat er geen manier om dit potentiële probleem volledig te vermijden, maar wel minder een probleem met herhaalde oefening van het protocol worden. Het is ook een aanbeveling van het oplossen van problemen die bij de voorbereiding dekglaasjes voor de celmigratie assay (of een test, in het algemeen), om extra dekglaasjes bereiden en extra HUVEC's ready-to-go in geval van problemen langs de weg.

Met deze problemen overwegingen in gedachten, is het ook belangrijk om de bruikbaarheid van de beschreven protocollen en hun gevolgen voortaan celbiologie onderzoek benadrukken. De toepasselijkheid van het polyacrylamide benadering is breed en omvat niet alleen tweedimensionale studies van cel-ECM engagement (hierboven beschreven), maar ook driedimensionale 5 onderzoeken. Deze toepassing is van cruciaal belang voor het vergroten van ons begrip van hoe HUVECs reguleren cel vorm en migratie in fysiologische omgevingen en moeten onderzoekers geven een fundamenteel begrip van hoe morfologische veranderingen worden gecoördineerd met het cytoskelet veranderingen. Hoewel de hier beschreven protocollen zijn gericht op metingen van MT groeidynamiek, de meeste protocollen kunnen en moeten worden aangepast om een ​​aantal andere microscopisch meetbare aspecten van cel-ECM interacties te meten. Wat MT dynamiek er tal MAPs, waarvan ten minste 14 families van kinesins 89, elk met een mogelijke rol bij HUVEC polariteit en gerichte migratie en die allemaal kunnen worden onderzocht met behulp van protocollen gepresenteerd.

Toekomstig onderzoek moet eenLSO worden gericht op de cel-ECM engagement in normale versus zieke staten. HUVEC protocollen die hier van toepassing zijn op onderzoeken van normale vasculaire homeostatische processen, alsmede ziektetoestanden waaronder hartaandoeningen, retinopathie, tumorgroei en metastase, een paar te noemen. Vervoegen van zichtbaar transparante ECM's en polyacrylamide substraten van vatbaar naleving van microscopische studies zal zorgen voor cel-ECM betrokkenheid studies zodanig dat endotheelcellen vasculaire angiogenese kan worden gecontroleerd met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Deze soorten experimentele benaderingen zijn al begonnen met belangrijke verschillen in endotheliale cellen vorm, polariteit, migratie, en de effecten van eiwitten die deze processen reguleren 5,31,90 onthullen. Toekomstige inspanningen moeten gericht zijn om te bepalen hoe de combinatie van ECM compliance en dimensionaliteit mechanosensing kan dienen om lokaal de controle eiwitten die zich richten en reguleren cytoskelet dynamiek.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met speciale dank aan Dr. Clare M. Waterman voor mentorschap en discussies, Michelle Baird en Mike Davidson voor het verstrekken van veel van de tl-cDNA constructen gebruikt in deze studies, en Kathryn Applegate en Gaudenz Danuser voor het ontwikkelen van plusTipTracker MT analyse software. Dit werk werd ondersteund, gedeeltelijk, door een subsidie ​​aan KAM van het National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) en de National Institutes of Health (NIH). (Grant: 4K22HL113069).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Aurora A Inhibitor ISelleck ChemicalsS1451
2% Bis solutionBio-Rad1610142
3-aminopropyltrimethyloxysilaneSigma-AldrichA3648
40% acrylamideBio-Rad1610140
405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner moduleAgilent Technologies99462
Ammonium persulfateSigma-AldrichA3678
anti–mouse IgG immunoprecipitation beadsTrueBlot Reagents; Rockland Inc.88-1688-31
anti–rabbit IgG immunoprecipitation beadsTrueBlot Reagents; Rockland Inc.88-7788-31
ET455/50m, DAPI-ET Emission FilterChroma Technology Corp.ET455/50m
ET525/36m Emission FilterChroma Technology Corp.ET525/36m
ET605/70m Emission FilterChroma Technology Corp.ET605/70m
ET700/75m Emission FilterChroma Technology Corp.ET700/75m
Bovine Serum Albumin Fraction VRPI ProductsA30075-100.0
Clara cooled charge-coupled device cameraAndor Technology77026010
Cy3 donkey anti-rabbitJackson ImmunoResearch711-165-152
DPBSThermo Fisher Scientific14190250
Dyelight 649 goat anti-ratJackson ImmunoResearch112-496-068
EGM-MV SingleQuot Supply & Growth Factors (contents shown below)LonzaCC-4143
Fetal bovine serum 25 ml
Bovine brain extract 2.0 ml
Gentamycin sulfate 0.5 ml
Epidermal growth factor 0.5 ml
Hydrocortisone 0.5 ml
Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 µg Strep/ml)  10.0 ml
EGTASigma-AldrichE3884-100G
Electronic shutterSutter instrument77016099
FibronectinEMD MilliporeFC010
GlutaraldehydeThermo Fisher ScientificS80026
HALT Protease inhibitorThermo Fisher ScientificPI-78425
HEPESSigma-AldrichH4034
HRP goat anti-mouseJackson ImmunoResearch115-036-062
HRP goat anti-rabbitJackson ImmunoResearch111-036-045
Immuno-Blot PVDF MembraneBio-Rad162-0174
LanolinThermo Fisher Scientific8006-54-0
Magnesium sulfateSigma-AldrichM2643-500G
MicroscopeNikon TiEMEA53100
Motorized stageASI TechnologiesMS-2000
Mounting mediumDakoCS70330-2
Mouse anti-Aurora AAbcamab130156
Mouse anti-GAPDHAbcamab9484
Mouse anti-MCAKAbcamab50778
Mouse anti-tubulin (DM1A)Cell Signaling Technology3873S
Nail PolishElectron Microscopy Sciences72180
NIS Elements softwareNikonMQS310000
Nucleofector Kit VLonzaVACA-1003Bevat de elektroporatiebuffer
ParaffinThermo Fisher ScientificP31-500
Penicillin-Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 µg Strep/ml)MP Biomedicals91670249
Petroleum jellyDow Corning2021854-1113
PipesSigma-AldrichP6757-100G
plusTipTracker
Rabbit anti-GFPAbcamab290
Rabbit anti–pT288–Aurora AAbcamab18318
Rat anti–α-tubulinAbD SerotecMCA78G
Sodium borohydrideThermo Fisher Scientific678-10
Spinning disk Andor TechnologyYokagawa CSU-X1
Sulfo-SANPAHThermo Fisher ScientificPI-22589
SuperSignal West Pico Chemiluminescent SubstrateThermo Fisher Scientific34080
Triton X-100Thermo Fisher ScientificBP151-500
TrypsinCorningMT25053CI
Tween-20Thermo Fisher ScientificBP337

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gerhardt, H., Betsholtz, C. How do endothelial cells orientate? EXS. 94, 3-15 (2005).
  2. Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. J Cell Biol. 161, 1163-1177 (2003).
  3. Bayless, K. J., Johnson, G. A. Role of the cytoskeleton in formation and maintenance of angiogenic sprouts. J Vasc Res. 48, 369-385 (2011).
  4. Fischer, R. S., Gardel, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Waterman, C. M. Local cortical tension by myosin II guides 3D endothelial cell branching. Curr Biol. 19, 260-265 (2009).
  5. Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. J Cell Biol. 192, 321-334 (2011).
  6. Rodriguez, O. C., et al. Conserved microtubule-actin interactions in cell movement and morphogenesis. Nat Cell Biol. 5, 599-609 (2003).
  7. Waterman-Storer, C. M., Salmon, E. D. Actomyosin-based retrograde flow of microtubules in the lamella of migrating epithelial cells influences microtubule dynamic instability and turnover and is associated with microtubule breakage and treadmilling. J Cell Biol. 139, 417-434 (1997).
  8. Waterman-Storer, C. M., Salmon, E. D. Microtubule dynamics: treadmilling comes around again. Curr Biol. 7, R369-R372 (1997).
  9. Wittmann, T., Bokoch, G. M., Waterman-Storer, C. M. Regulation of leading edge microtubule and actin dynamics downstream of Rac1. J Cell Biol. 161, 845-851 (2003).
  10. Ahmad, F. J., Pienkowski, T. P., Baas, P. W. Regional differences in microtubule dynamics in the axon. J Neurosci. 13, 856-866 (1993).
  11. Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).
  12. Dent, E. W., Kalil, K. Axon branching requires interactions between dynamic microtubules and actin filaments. J Neurosci. 21, 9757-9769 (2001).
  13. Dehmelt, L., Nalbant, P., Steffen, W., Halpain, S. A microtubule-based, dynein-dependent force induces local cell protrusions: Implications for neurite initiation. Brain Cell Biol. 35, 39-56 (2006).
  14. van Veen, M. P., van Pelt, J. Dynamic mechanisms of neuronal outgrowth. Prog Brain Res. 102, 95-108 (1994).
  15. Myers, K. A., He, Y., Hasaka, T. P., Baas, P. W. Microtubule transport in the axon: Re-thinking a potential role for the actin cytoskeleton. Neuroscientist. 12, 107-118 (2006).
  16. Stehbens, S., Wittmann, T. Targeting and transport: how microtubules control focal adhesion dynamics. J Cell Biol. 198, 481-489 (2012).
  17. Stehbens, S. J., et al. CLASPs link focal-adhesion-associated microtubule capture to localized exocytosis and adhesion site turnover. Nat Cell Biol. 16, 561-573 (2014).
  18. Wittmann, T., Waterman-Storer, C. M. Spatial regulation of CLASP affinity for microtubules by Rac1 and GSK3beta in migrating epithelial cells. J Cell Biol. 169, 929-939 (2005).
  19. Kumar, P., et al. GSK3beta phosphorylation modulates CLASP-microtubule association and lamella microtubule attachment. J Cell Biol. 184, 895-908 (2009).
  20. Al-Bassam, J., Chang, F. Regulation of microtubule dynamics by TOG-domain proteins XMAP215/Dis1 and CLASP. Trends Cell Biol. 21, 604-614 (2011).
  21. Desai, A., Verma, S., Mitchison, T. J., Walczak, C. E. Kin I kinesins are microtubule-destabilizing enzymes. Cell. 96, 69-78 (1999).
  22. Hunter, A. W., et al. The kinesin-related protein MCAK is a microtubule depolymerase that forms an ATP-hydrolyzing complex at microtubule ends. Mol Cell. 11, 445-457 (2003).
  23. Lee, T., Langford, K. J., Askham, J. M., Bruning-Richardson, A., Morrison, E. E. MCAK associates with EB1. Oncogene. 27, 2494-2500 (2008).
  24. Walczak, C. E., Mitchison, T. J., Desai, A. XKCM1: a Xenopus kinesin-related protein that regulates microtubule dynamics during mitotic spindle assembly. Cell. 84, 37-47 (1996).
  25. Maney, T., Hunter, A. W., Wagenbach, M., Wordeman, L. Mitotic centromere-associated kinesin is important for anaphase chromosome segregation. J Cell Biol. 142, 787-801 (1998).
  26. Lan, W., et al. Aurora B phosphorylates centromeric MCAK and regulates its localization and microtubule depolymerization activity. Curr Biol. 14, 273-286 (2004).
  27. Ganem, N. J., Upton, K., Compton, D. A. Efficient mitosis in human cells lacking poleward microtubule flux. Curr Biol. 15, 1827-1832 (2005).
  28. Wordeman, L., Wagenbach, M., von Dassow, G. MCAK facilitates chromosome movement by promoting kinetochore microtubule turnover. J Cell Biol. 179, 869-879 (2007).
  29. Kline-Smith, S. L., Walczak, C. E. The microtubule-destabilizing kinesin XKCM1 regulates microtubule dynamic instability in cells. Mol Biol Cell. 13, 2718-2731 (2002).
  30. Moore, A. T., et al. MCAK associates with the tips of polymerizing microtubules. J Cell Biol. 169, 391-397 (2005).
  31. Braun, A., et al. Rac1 and Aurora A regulate MCAK to polarize microtubule growth in migrating endothelial cells. J Cell Biol. 206, 97-112 (2014).
  32. Tanenbaum, M. E., Medema, R. H., Akhmanova, A. Regulation of localization and activity of the microtubule depolymerase MCAK. Bioarchitecture. 1, 80-87 (2011).
  33. Kushner, E. J., et al. Excess centrosomes disrupt endothelial cell migration via centrosome scattering. J Cell Biol. 206, 257-272 (2014).
  34. Siekmann, A. F., Affolter, M., Belting, H. G. The tip cell concept 10 years after: new players tune in for a common theme. Exp Cell Res. 319, 1255-1263 (2013).
  35. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. J Struct Biol. 176, 168-184 (2011).
  36. Montenegro Gouveia, S., et al. In vitro reconstitution of the functional interplay between MCAK and EB3 at microtubule plus ends. Curr Biol. 20, 1717-1722 (2010).
  37. Honnappa, S., et al. An EB1-binding motif acts as a microtubule tip localization signal. Cell. 138, 366-376 (2009).
  38. Stout, A., D'Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker software to measure microtubule dynamics in Xenopus laevis growth cones. J Vis Exp. , e52138(2014).
  39. Waterman-Storer, C. M. Microtubule/organelle motility assays. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13(2001).
  40. Kutys, M. L., Yamada, K. M. An extracellular-matrix-specific GEF-GAP interaction regulates Rho GTPase crosstalk for 3D collagen migration. Nat Cell Biol. 16, 909-917 (2014).
  41. Friedl, P., Wolf, K., Zegers, M. M. Rho-directed forces in collective migration. Nat Cell Biol. 16, 208-210 (2014).
  42. Hellstrom, M., et al. Dll4 signalling through Notch1 regulates formation of tip cells during angiogenesis. Nature. 445, 776-780 (2007).
  43. Semina, E. V., et al. T-cadherin activates Rac1 and Cdc42 and changes endothelial permeability. Biochemistry (Mosc). 74, 362-370 (2009).
  44. Liang, Z. W., et al. Nestin-mediated cytoskeletal remodeling in endothelial cells: novel mechanistic insight into VEGF-induced cell migration in angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol. 308, C349-C358 (2015).
  45. Kamath, K., Smiyun, G., Wilson, L., Jordan, M. A. Mechanisms of inhibition of endothelial cell migration by taxanes. Cytoskeleton (Hoboken). 71, 46-60 (2014).
  46. Pasquier, E., et al. Antiangiogenic concentrations of paclitaxel induce an increase in microtubule dynamics in endothelial cells but not in cancer cells. Cancer Res. 65, 2433-2440 (2005).
  47. Sun, X., et al. Regulation of tumor angiogenesis by the microtubule-binding protein CLIP-170. Protein Cell. 4, 266-276 (2013).
  48. Lyle, K. S., Corleto, J. A., Wittmann, T. Microtubule dynamics regulation contributes to endothelial morphogenesis. Bioarchitecture. 2, 220-227 (2012).
  49. Ganguly, A., Yang, H., Zhang, H., Cabral, F., Patel, K. D. Microtubule dynamics control tail retraction in migrating vascular endothelial cells. Mol Cancer Ther. 12, 2837-2846 (2013).
  50. Wittmann, T., Bokoch, G. M., Waterman-Storer, C. M. Regulation of microtubule destabilizing activity of Op18/stathmin downstream of Rac1. J Biol Chem. 279, 6196-6203 (2004).
  51. Waterman-Storer, C. M., Worthylake, R. A., Liu, B. P., Burridge, K., Salmon, E. D. Microtubule growth activates Rac1 to promote lamellipodial protrusion in fibroblasts. Nat Cell Biol. 1, 45-50 (1999).
  52. Pasapera, A. M., et al. Rac1-dependent phosphorylation and focal adhesion recruitment of myosin IIA regulates migration and mechanosensing. Curr Biol. 25, 175-186 (2015).
  53. Cooper, J. R., Wagenbach, M., Asbury, C. L., Wordeman, L. Catalysis of the microtubule on-rate is the major parameter regulating the depolymerase activity of MCAK. Nat Struct Mol Biol. 17, 77-82 (2010).
  54. Hu, Y. L., et al. Roles of microtubule dynamics and small GTPase Rac in endothelial cell migration and lamellipodium formation under flow. J Vasc Res. 39, 465-476 (2002).
  55. Davis, G. E., Koh, W., Stratman, A. N. Mechanisms controlling human endothelial lumen formation and tube assembly in three-dimensional extracellular matrices. Birth Defects Res C Embryo Today. 81, 270-285 (2007).
  56. Spaargaren, M., Bos, J. L. Rab5 induces Rac-independent lamellipodia formation and cell migration. Mol Biol Cell. 10, 3239-3250 (1999).
  57. Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125, 5917-5926 (2012).
  58. Westenskow, P. D., et al. Ras pathway inhibition prevents neovascularization by repressing endothelial cell sprouting. J Clin Invest. 123, 4900-4908 (2013).
  59. Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14, (2008).
  60. Tarnawski, W., et al. A robust algorithm for segmenting and tracking clustered cells in time-lapse fluorescent microscopy. IEEE J Biomed Health Inform. 17, 862-869 (2013).
  61. Rambaldi, D., Pece, S., Di Fiore, P. P. flowFit: a Bioconductor package to estimate proliferation in cell-tracking dye studies. Bioinformatics. 30, 2060-2065 (2014).
  62. Cordelieres, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLoS One. 8, e81266(2013).
  63. Henry, K. M., et al. PhagoSight: an open-source MATLAB(R) package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model. PLoS One. 8, e72636(2013).
  64. Klein, J., et al. TLM-Tracker: software for cell segmentation, tracking and lineage analysis in time-lapse microscopy movies. Bioinformatics. 28, 2276-2277 (2012).
  65. Gerhardt, H., Betsholtz, C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell Tissue Res. 314, 15-23 (2003).
  66. Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
  67. Davis, G. E., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Koh, W. Molecular basis for endothelial lumen formation and tubulogenesis during vasculogenesis and angiogenic sprouting. Int Rev Cell Mol Biol. 288, 101-165 (2011).
  68. Tung, J. J., Tattersall, I. W., Kitajewski, J. Tips stalks, tubes: notch-mediated cell fate determination and mechanisms of tubulogenesis during angiogenesis. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a006601(2012).
  69. Davis, G. E., et al. Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes. Methods Mol Biol. 1066, 17-28 (2013).
  70. Kim, D. J., Martinez-Lemus, L. A., Davis, G. E. EB1, p150Glued, and Clasp1 control endothelial tubulogenesis through microtubule assembly, acetylation, and apical polarization. Blood. 121, 3521-3530 (2013).
  71. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 83-117 (1997).
  72. Drechsel, D. N., Kirschner, M. W. The minimum GTP cap required to stabilize microtubules. Curr Biol. 4, 1053-1061 (1994).
  73. Schulze, E., Kirschner, M. Dynamic and stable populations of microtubules in cells. J Cell Biol. 104, 277-288 (1987).
  74. Kirschner, M., Mitchison, T. Beyond self-assembly: from microtubules to morphogenesis. Cell. 45, 329-342 (1986).
  75. Malikov, V., Cytrynbaum, E. N., Kashina, A., Mogilner, A., Rodionov, V. Centering of a radial microtubule array by translocation along microtubules spontaneously nucleated in the cytoplasm. Nat Cell Biol. 7, 1213-1218 (2005).
  76. Wieczorek, M., Bechstedt, S., Chaaban, S., Brouhard, G. J. Microtubule-associated proteins control the kinetics of microtubule nucleation. Nat Cell Biol. 17, 907-916 (2015).
  77. Wiese, C., Zheng, Y. Microtubule nucleation: gamma-tubulin and beyond. J Cell Sci. 119, 4143-4153 (2006).
  78. Shin, W. D., Fischer, R. S., Kanchawong, P., Kim, Y., Lim, J., Myers, K. A., Nishimura, Y., Plotnikov, S. V., Thievessen, I., Yarar, D., Sabass, B., Waterman, C. M. Live cell imaging: A laboratory. , 2nd, 119-138 (2010).
  79. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
  80. Gundersen, G. G., Bulinski, J. C. Selective stabilization of microtubules oriented toward the direction of cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5946-5950 (1988).
  81. Wittmann, T., Waterman-Storer, C. M. Cell motility: can Rho GTPases and microtubules point the way? J Cell Sci. 114, 3795-3803 (2001).
  82. Jakobsson, L., Bentley, K., Gerhardt, H. VEGFRs and Notch: a dynamic collaboration in vascular patterning. Biochem Soc Trans. 37, 1233-1236 (2009).
  83. Blanco, R., Gerhardt, H. VEGF and Notch in tip and stalk cell selection. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a006569(2013).
  84. Gerhardt, H. VEGF and endothelial guidance in angiogenic sprouting. Organogenesis. 4, 241-246 (2008).
  85. Napione, L., et al. Unraveling the influence of endothelial cell density on VEGF-A signaling. Blood. 119, 5599-5607 (2012).
  86. Benedito, R., et al. Notch-dependent VEGFR3 upregulation allows angiogenesis without VEGF-VEGFR2 signalling. Nature. 484, 110-114 (2012).
  87. Czeisler, C., Mikawa, T. Microtubules coordinate VEGFR2 signaling and sorting. PLoS One. 8, e75833(2013).
  88. Howes, S. C., Alushin, G. M., Shida, T., Nachury, M. V., Nogales, E. Effects of tubulin acetylation and tubulin acetyltransferase binding on microtubule structure. Mol Biol Cell. 25, 257-266 (2014).
  89. Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).
  90. Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nat Protoc. 7, 2056-2066 (2012).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

HUVEC kweekEB3 trackingPlusTipTracker softwarespinning disk confocale microscopiecelmigratie assaywondrandmigratievertakking van endotheelcellenfluorescentiemicroscopie

Gerelateerde artikelen