Cel-adhesiviteit is essentieel voor veel benaderingen in biomateriaalonderzoek en weefselengineering. Er wordt een stapsgewijze techniek gepresenteerd die gebruik maakt van natte chemie voor de oppervlaktemodificatie van het belangrijke polymeer PTFE met peptiden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Natte Chemie en Peptide immobilisatie op Polytetrafluoroethyleen voor betere Cel-adhesie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Begiftigt materialen oppervlak met cell-hechtende eigenschappen is een gemeenschappelijke strategie in biomaterialen onderzoek en tissue engineering. Dit is vooral interessant voor reeds goedgekeurde polymeren die een langdurige toepassing in de geneeskunde omdat deze materialen zijn goed gekarakteriseerd en wetgeving die samenhangen met de introductie van nieuw gesynthetiseerde polymeren kunnen worden vermeden. Polytetrafluorethyleen (PTFE) is een van de meest gebruikte materialen voor het vervaardigen van vasculaire enten, maar mist de polymere cel adhesiebevorderende kenmerken. Endothelialisatie, dwz dat volledige dekking van de enten binnenoppervlak met een confluente laag van endotheelcellen beschouwd essentieel voor de optimale prestaties, vooral door het beperken trombogeniciteit van de kunstmatige interface.
Deze studie onderzoekt de groei van endotheliale cellen op peptide-gemodificeerde PTFE en vergelijkt deze resultaten met die verkregen met ongemodificeerde substraat. Koppeling met deendotheelcel lijm peptide Arg-Glu-Asp-Val (REDV) wordt uitgevoerd via activatie van de fluorin polymeer met het reagens natriumnaftalenide, gevolgd door achtereenvolgende conjugatie stappen. Celkweek wordt bewerkstelligd middels humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) en uitstekende celgroei on-peptide geïmmobiliseerd materiaal wordt aangetoond gedurende een periode van twee weken.
Inleiding
Verschillende polymeren gebruikt in de geneeskunde die zijn goedgekeurd voor enige tijd niet verbeterde biocompatibiliteit, dat wil zeggen, gebrek aan cel-kleverigheid, inductie van fibrotische inkapseling en trombogeniciteit vertonen, om een paar te noemen. Interacties tussen het biomateriaal en het biologische systeem voornamelijk plaatsvindt aan het oppervlak van het implantaat. Dientengevolge is onderzoek gericht op oppervlaktemodificatie teneinde passende eigenschappen te creëren voor een gewenste toepassing terwijl de bulk van het materiaal beïnvloed. Polytetrafluorethyleen (PTFE) als een fysiologisch inert polymeer wordt gebruikt in vele medische gebieden zoals hernia chirurgisch gaas 1, medische poorten 2 en, belangrijker, vasculaire transplantaten 3.
Vooral in bloed contact situaties de hydrofobe aard van PTFE zorgt onspecifieke adsorptie van plasmacomponenten en bijgevolg bloedplaatjesadhesie, vaak resulterend in thrombotic gebeurtenissen en occlusie van het implantaat 4. Bovendien PTFE, zoals de meeste polymeren, ondersteunt celadhesie en dekking die zou een wenselijke eigenschap voor de vorming van een gunstig laag van endotheelcellen (EC) op de binnenzijde (luminaal) oppervlak van het vasculaire transplantaat 5 induceren. Een biomimetische endotheel wordt verwacht dat veel van de functies van de natuurlijke equivalent, met name de antitrombogene eigenschappen 6 voldoen. Een algemene biomimetische modificatie strategie is gebaseerd op het concept van uitsluitend begiftigt het materiaal cel-kleverigheid terwijl de materialen bulkeigenschappen onaangetast. Bovendien kunnen bloedplaatjesadhesie worden verminderd door reeds adhesie (aangroeiwerende) kenmerken 7. Verschillende peptiden - meestal afgeleid van eiwitten van de extracellulaire matrix - beschreven die sterk verbeteren celadhesie door binding aan cellulaire receptoren, die behoren tot de klasse van integrinen 8. het zijnst bekend voorbeeld in dit verband is het peptide Arg-Gly-Asp (RGD) die samenwerkt met de meeste celtypen. Andere aminozuursequenties worden herkend door integrinen exclusief tot expressie op specifieke cellen. Bijvoorbeeld, Arg-Glu-Asp-Val (REDV) en Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) gevonden te binden aan EC aan een specifieke wijze 9. Covalente immobilisatie van dergelijke peptiden heeft op een overvloed aan inherent niet-zelfklevende materialen waaronder metalen en polymeren 10,11 uitgevoerd.
Poreus PTFE, nauwkeuriger geëxpandeerd PTFE (ePTFE) - samen met polyethyleentereftalaat (PET) - is de belangrijkste grondstof voor de productie van vasculaire transplantaten 12. Vastgesteld fysische technieken voor geschikte behandelingen, zoals plasma modificatie 13 of fotochemische methoden 14 worden bemoeilijkt doordat poreuze en / of buisvormige structuren zijn niet gemakkelijk te behandelen in de poriën of het lumen resp. natchemischeop PTFE is een moeilijke taak, omdat de zeer inerte aard van het fluorin bevattend polymeer dat de meeste chemische aanvallen 15 weerstaat.
In dit artikel beschrijven we een relatief gemakkelijke werkwijze voor covalente modificatie strategie. Aangepast van een procedure om PTFE bondable te maken, werden functionele groepen die zijn gemaakt op de materialen oppervlak die dienen als ankerpunten voor verdere vervoeging van biologisch actieve moleculen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van natriumnaftalenide activeren Solution en Oppervlakte Activering
Opmerking: Voer reacties in een goed geventileerde zuurkast. Volg de algemene regels voor het omgaan met licht ontvlambare oplosmiddelen en corrosieve metalen zoals metallisch natrium. Naftaleen heeft een zeer onaangename geur (mottenballen), zelfs in zeer kleine hoeveelheden! Tenzij anders aangegeven reacties worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. Natriumazide is zeer giftig! THF (99,9%, zie Lijst van Materials) werd opgeslagen meer dan ongeveer 20% (in volume) moleculaire zeef. Distilleren THF met een merkbare watergehalte over natrium. De vorming van natriumnaftalenide treedt niet op als kleine hoeveelheden water aanwezig zijn.
- Aan een oplossing van 1,4 g (10,9 mmol) naftaleen in 20 ml tetrahydrofuran (THF, gedroogd op 3 A moleculaire zeef), voeg 0,25 g (10,9 mmol) natriummetaal in een 100 ml glazen fles schroefdop uitgerust met een PTFE- beklede magnetische roerstaaf.
Opmerking: Dissolutie kan sterk worden verbeterd door het snijden van het natrium in kleine stukjes en bescheiden verwarmen (35-40 ° C). De uiteindelijke oplossing heeft een donkere, ietwat groenachtige kleur en kunnen onder strikt droge omstandigheden worden bewaard. - Pons PTFE schijven met een diameter van 12 mm van 0,5 mm dik folie materiaal. Mark de ene kant (bijvoorbeeld met behulp van een brief stempel punch) en schoon met iso-propanol.
- Incubeer PTFE-monsters afzonderlijk in de activerende oplossing (stap 1.1) voor 1-2 min met behulp van een tang. Opmerking: De kleurverandering van wit tot donkerbruin geeft aan een succesvolle behandeling.
- Vervolgens tweemaal met THF en spoel na met iso-propanol.
Opmerking: De naphthalenide oplossing is uitgeput wanneer de kleur verandert in een waterige lichtbruin. Ongebruikte naphthalenide oplossing (eventueel metallisch natrium) worden ontleed door langzaam toevoegen iso-propanol voorafgaand aan verwijdering. - Oxideren behandelde monsters in waterstofperoxide (30%) bevattende 20% (w / v) trichloorazijnzuur gedurende 3 uur. Wassenmet water en droog. Het oppervlak heeft nu een lichte bruinachtig uiterlijk. Opmerking: Activering en oxidatie resulteert in een drastisch toegenomen bevochtigbaarheid van het oppervlak. Deze bevinding werd in detail onderzocht eerder 14.
- Behandel geoxideerd schijven met 50% (v / v) hexamethyleendiisocyanaat (HMDI) in droog THF gedurende 2 uur, spoel met THF en laten drogen.
- Hydrolyseren isocyanaat lager monsters in water gedurende 2-3 uur en droog. Opmerking: De uiteindelijke aminogefunctionaliseerde PTFE oppervlak is veel stabieler dan de isocyanaat-dragende monsters en is compatibel met vele standaard verknopingsmiddelen voor verdere koppeling.
2. Peptide Immobilisatie
- Bereid een oplossing van 20% (v / v) diethyleenglycol diglycidyl ether (di-epoxide) in 50 mM carbonaatbuffer, pH 9.
- Plaats de geamineerd schijven met de gemarkeerde zijde naar boven individueel in een 24 well plaat en voeg 1,5 ml van het epoxide oplossing. Zorgen voor een volledige dekking van de monsters. Incubeer gedurende 2 uur en was tweemalen met water en eenmaal met carbonaatbuffer.
- Voeg 50 ul van een 0,5 mg / ml peptide (bijvoorbeeld REDV) in 50 mM carbonaatbuffer, pH 9 met 0,01% NaN3, onderaan naar individuele putjes van een nieuwe plaat met 24 putjes en plaats voorzichtig het epoxy-gefunctionaliseerde schijven ondersteboven -down (dwz gemarkeerde zijde naar beneden) op de daling van het peptide-oplossing. Zorg ervoor dat de ruimte tussen de bodem van de put en de PTFE schijf volledig bevochtigd door capillaire werking.
- Incubeer in een vochtige ruimte (bijvoorbeeld elke lasbare kunststof doos met een strakke sluitdeksel) met bevochtigde atmosfeer (door nat tissuepapier op de bodem) gedurende ten minste 3 uur of overnacht.
Opmerking: ondanks de REDV motief kan worden geacht goed gekarakteriseerd, gecodeerde of omgekeerde aminozuursequentie kan worden opgenomen als extra negatieve controle. - Was drie keer met water en steriliseer in 50% isopropanol / water gedurende 30 min. Voorafgaand aan het zaaien, rins cele de monsters in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
3. Cel zaaien
- Grow HUVECs met behulp van standaard celcultuur procedures 17,18.
- Plaats de peptide-geconjugeerde monsters met gemodificeerde naar boven in een 24 well platen. Gebruik onbehandelde PTFE-schijven als een controle.
- Zaad 5 x 10 4 HUVEC in 2 ml medium per putje en incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C en 5% CO2 in een incubator.
- Verwijder de schijven, spoel zorgvuldig losse cellen te verwijderen en over te dragen aan een nieuwe plaat met 24 putjes. Voeg 2 ml vers medium en incubeer gedurende de gewenste periode (bijvoorbeeld, 24 uur, 1 w, enz.). Verander medium om de twee dagen.
- Bereid een voorraadoplossing van 1 mg / ml calceïne-AM in dimethylsulfoxide (DMSO).
- Na kweken van de cellen te verwijderen het medium, wassen met PBS en voeg PBS dat 1 ui / ml calceïne-AM kleuring (bijvoorbeeld 1 pi van een voorraadoplossing per ml PBS). Schud voorzichtig en incubate bij 37 ° C gedurende 45 minuten in het donker.
- Was met PBS en onmiddellijk micrografische op een fluorescentiemicroscoop uitgerust met standaard FITC filters (Ex 488 nm, Em 515 nm). Gebruik 100-voudige vergroting. Voer drievoud van ongemodificeerde evenals behandelde monsters.
- Behulp ImageJ software bepaalt het gebied gekoloniseerd door de cellen. U kunt ook handmatig tellen van de cellen of gebruik ImageJ. Beide methoden zullen soortgelijke informatie over de aanhechting en groei van cellen op de respectievelijke oppervlakken geven.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De resultaten van de cruciale chemische reactiestappen werden gevolgd met IR-spectroscopie (figuur 1). De eerste activering met natriumnaftalenide genereert dubbele bindingen - en in mindere mate - OH-functionaliteiten. Het signaal dat C = C bindingen verdwijnen bij oxidatie, waardoor een oppervlak dat bijna uitsluitend hydroxylgroepen. Analyse van de verdere standaard vervoeging stappen worden hier niet weergegeven. De kleur verandert door activatie en oxidatie in overe...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De gedetailleerde beschrijving van oppervlaktemodificatie protocol PTFE bestaat uit opeenvolgende stappen beginnen met de verwijdering van fluor uit het polymeerskelet zoals weergegeven in figuur 6. Hierdoor wordt een laag gevormd die een overvloedige hoeveelheid geconjugeerde koolstof-koolstof dubbele bindingen bevat in overeenstemming met de donkere bruine kleur die ontwikkeld op naphthalenide behandeling. Standard oxidatie met zure waterstofperoxide levert een gehydroxyleerd oppervlak vergezeld van v...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen de hulp van Walter Scholdei (Max-Planck-Institut für Polymerforschung, Mainz, Duitsland) graag erkennen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| PTFE folie 0,5 mm | Cadillac Plastic | n/a | |
| REDV peptide | Genecust | n/a | custom synthese >95% zuiverheid |
| iso-propanol | Sigma Aldrich | 34965 | |
| tetrahydrofuraan (THF) | Sigma Aldrich | 401757 | |
| dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | D8418 | |
| moleculaire zeef 3 Å | Sigma Aldrich | 208574 | |
| natriummetaal | Sigma Aldrich | 483745 | |
| fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| naftaleen | Sigma Aldrich | 147141 | |
| waterstofperoxide 30% | Sigma Aldrich | 95321 | |
| trichloorazijnzuur | Sigma Aldrich | T6399 | |
| diethyleenglycol diglycidylether | Sigma Aldrich | 17741 | |
| hexamethyleendi-isocyanaat (HMDI) | Sigma Aldrich | 52650 | |
| Calcein-AM | Sigma Aldrich | 56496 | |
| natriumbicarbonaat | Sigma Aldrich | S6014 | |
| natriumazied | Sigma Aldrich | 71290 | |
| 24 well platen | Greiner-Bio-One | 662 160 | |
| ATR-FTIR spectrofotometer Nicolet Magna-IR 850 | Nicolet | n/a | |
| fluorescentiemicroscoop Olympus X-70 | Olympus | n/a | |
| endotheelcellen uit de navelstrengslagader (HUVECs) | Lonza | n/a | |
| ePTFE vaattransplantaat | Gore | n/a |
Referenties
- Doctor, H. G. Evaluation of various prosthetic materials and newer meshes for hernia repairs. J. Minim. Access Surg. 2, 110-116 (2006).
- Zaghal, A., et al. Update on totally implantable venous access devices. Surg. Oncol. 21, 207-215 (2012).
- Niu, G., Sapoznik, E., Soker, S. Bioengineered blood vessels. Exp. Opin. Biol. Th. 14, 403-410 (2014).
- Wang, M. -J., Tsai, W. -B. Biomaterials in Blood-Contacting Devices: Complications and Solutions. , Nova Science Publishers. 1 ed (2010).
- de Mel, A., Jell, G., Stevens, M. M., Seifalian, A. M. Biofunctionalization of biomaterials for accelerated in situ endothelialization: a review. Biomacromolecules. 9, 2969-2979 (2008).
- Zdrahala, R. J. Small caliber vascular grafts. Part I: state of the art. J. Biomat. Appl. 10, 309-329 (1996).
- Cleary, M. A., et al. Vascular tissue engineering: the next generation. Trends Mol. Med. 18, 394-404 (2012).
- Ruoslahti, E. RGD and other recognition sequences for integrins. Annu. Rev. Dev. Bi. 12, 697-715 (1996).
- Lei, Y., Remy, M., Labrugere, C., Durrieu, M. C. Peptide immobilization on polyethylene terephthalate surfaces to study specific endothelial cell adhesion, spreading and migration. J. Mat. Sci. Mater. M. 23, 2761-2772 (2012).
- Gabriel, M., et al. Covalent RGD Modification of the Inner Pore Surface of Polycaprolactone Scaffolds. J. Biomat. Sci.. Polym. E. 23, 941-953 (2012).
- Ceylan, H., Tekinay, A. B., Guler, M. O. Selective adhesion and growth of vascular endothelial cells on bioactive peptide nanofiber functionalized stainless steel surface. Biomaterials. 32, 8797-8805 (2011).
- Chlupac, J., Filova, E., Bacakova, L. Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery. Physiol. Res. / Academia Scientiarum Bohemoslovaca. 58, Suppl 2 119-139 (2009).
- Wise, S. G., Waterhouse, A., Kondyurin, A., Bilek, M. M., Weiss, A. S. Plasma-based biofunctionalization of vascular implants. Nanomedicine UK. 7, 1907-1916 (2012).
- Mikulikova, R., et al. Cell microarrays on photochemically modified polytetrafluoroethylene. Biomaterials. 26, 5572-5580 (2005).
- Gabriel, M., Dahm, M., Vahl, C. F. Wet-chemical approach for the cell-adhesive modification of polytetrafluoroethylene. Biomed. Mater. 6, 035007(2011).
- Gabriel, M., van Nieuw Amerongen, G. P., Van Hinsbergh, V. W., Amerongen, A. V., Zentner, A. Direct grafting of RGD-motif-containing peptide on the surface of polycaprolactone films. J. Biomat. Sci.. Polym. E. 17, 567-577 (2006).
- Larsen, C. C., Kligman, F., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. The effect of RGD fluorosurfactant polymer modification of ePTFE on endothelial cell adhesion, growth, and function. Biomaterials. 27, 4846-4855 (2006).
- Gabriel, M., Nazmi, K., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V., Zentner, A. Preparation of LL-37-grafted titanium surfaces with bactericidal activity. Bioconjugate Chem. 17, 548-550 (2006).
- Lotz, A., Heller, M., Brieger, J., Gabriel, M., Förch, R. Derivatization of Plasma Polymerized Thin Films and Attachment of Biomolecules to Influence HUVEC-Cell Adhesion. Plasma Process Polym. 9, 10-16 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
