Techniek Driedimensionale epitheelweefsels Embedded binnen extracellulaire matrix

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft een zachte lithografie gebaseerde techniek uniforme arrays van driedimensionale (3D) epitheliale weefsels gedefinieerde geometrische midden van extracellulaire matrix ingenieur. Deze methode is vatbaar voor een grote verscheidenheid aan celtypen en experimentele contexten en zorgt voor high-throughput screening van identieke herhalingen.

Samenvatting

De architectuur van vertakkende organen zoals de longen, nieren en borstklieren ontstaat door het ontwikkelingsproces van vertakte morfogenese, dat wordt gereguleerd door een verscheidenheid aan oplosbare en fysieke signalen in de micro-omgeving. Hier wordt een methode beschreven die is ontwikkeld om het proces van vertakte morfogenese te bestuderen door het vormen van geconstrueerde driedimensionale (3D) epitheelweefsels met een gedefinieerde vorm en grootte die volledig zijn ingebed in een extracellulair matrix (ECM). Deze methode maakt de vorming van arrays van identieke weefsels mogelijk en maakt de controle mogelijk van een verscheidenheid aan omgevingsfactoren, inclusief weefselgeometrie, afstand en ECM-samenstelling. Deze methode kan ook worden gecombineerd met veelgebruikte technieken zoals tractiekrachtmicroscopie (TFM) om meer informatie te verkrijgen over de interacties tussen cellen en hun omringende ECM. Het protocol kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan cel- en weefselprocessen te onderzoeken, inclusief kankerinvasie, die verder gaan dan vertakte morfogenese.

Inleiding

De ontwikkeling van vertakte epitheliale weefsels, zogenaamde vertakking morfogenese wordt geregeld door cel afkomstige, fysieke en omgevingsfactoren. In de melkklier, vertakkende morfogenese is een iteratief proces waarbij geleid collectieve celmigratie wordt een boom-achtige architectuur. De eerste stap is primair knopvorming uit de melkkanalen, gevolgd door tak initiatie en elongatie ^1,2. Invasie van takken in het omliggende stroma wordt geïnduceerd door de systemische afgifte van steroïde hormonen in de puberteit. Nieuwe primaire knoppen vervolgens initiëren van de uiteinden van de bestaande vestigingen, en dit proces blijft een epitheliale boom ³ te creëren. Hoewel veel belangrijke biochemische signalen zijn geïdentificeerd, een uitgebreide kennis van de celbiologische mechanismen die leiden dit complex ontwikkelingsproces wordt momenteel ontbreekt. Bovendien mechanistische studies over de invloed van specifieke signalen zijn moeilijk te ontleden van experigen in vivo, zo precies spatiotemporele verstoringen en metingen zijn vaak niet mogelijk.

Driedimensionale (3D) cultuur technieken, zoals hele orgelcultuur, primaire organoids en celcultuur modellen, zijn nuttige hulpmiddelen voor het systematisch onderzoek naar de mechanismen die ten grondslag liggen aan weefsel morfogenese ^4-6. Deze kunnen bijzonder nuttig zijn voor het bepalen van de invloed van bepaalde factoren afzonderlijk, zoals mechanische krachten en biochemische signalen, op een verscheidenheid van cel gedrag, zoals migratie, proliferatie en differentiatie. ⁶ Engineered celkweekmodellen name gemakkelijk mogelijk de verstoring van afzonderlijke cellen en hun micromilieu.

Een dergelijke cultuur model maakt gebruik van een microfabrication gebaseerde benadering van model borstklier epitheliale weefsels met gecontroleerde 3D-structuur die consistent en reproduceerbaar te vormen takken die samen migreren wanneer geïnduceerd met de een ingenieurppropriate groeifactoren. Het grote voordeel van het model is de mogelijkheid om precies te manipuleren en de effecten van fysische en biochemische factoren, zoals patronen van mechanische belasting, hoge statistische betrouwbaarheid te meten. Deze techniek, samen met computermodellen is al gebruikt om de relatieve bijdrage van fysische en biochemische signalen in de leiding van de normale ontwikkeling van mammaire epitheliale weefsels en andere epithelia vertakte ^7-11 bepalen. Hier voorgesteld is een gedetailleerd protocol voor het bouwen van deze model weefsels, die gemakkelijk kan worden uitgebreid tot andere typen cellen en extracellulaire matrix (ECM) gels en die dient als een potentieel middel voor het testen van geneesmiddelen.

Protocol

1. Voorbereiding van de Solutions

1. Een 5 mg / ml oplossing van insuline te bereiden, verdun het gepoederde insuline leverbaar met 5 mM zoutzuur (HCl) in dH ₂ O (500 mg insuline in 100 ml oplosmiddel). Bereid 100 ml oplosmiddel door toevoeging van 50 pi geconcentreerd HCl aan 100 ml gedestilleerd water (dH ₂ O).
2. Aan een oplossing van 1x PBS te verdunnen 10x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) stockoplossing aan 1x met dH ₂ O onder steriele omstandigheden.
3. Bereid de polydimethylsiloxaan (PDMS) elastomeeroplossing als volgt: meng de PDMS prepolymeer met het hardingsmiddel in een 10: 1 (w: w) verhouding.
4. Bereid het celkweekmedium als volgt: 500 ml van de Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F-12), voeg 10 ml steriel foetaal runderserum (FBS), 500 gl gentamicine reagens en 500 pl van 5 mg / ml insuline.
5. Tot 1% runderserumalbumine (BSA) bereiden in 1x PBS oplossing, voeg 1% (w: V) oplossing van BSA poeder tot 1x PBS en meng.
6. Een 4 mg / ml oplossing van geneutraliseerd bovine type I collageen bereid, voeg 50 ul 10 x Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) buffer, 30 pl 0,1 N natriumhydroxide (NaOH), 30 pi celkweekmedium en 400 ui voorraad collageen een gekoelde 1,5 ml microcentrifugebuis. Meng langzaam door en neer te pipetteren; voorkomen dat er bubbels. Eventuele luchtbellen te verwijderen, kort gecentrifugeerd mengsel bij 4 ° C.
7. Bereid een fixatief door verdunning van 16% paraformaldehyde 1: 4 (v: v) in 1x PBS.
8. Bereid een kernen etikettering oplossing door verdunning van de voorraad kernen etikettering oplossing 1: 1000 (v: v) in 1x PBS.
9. Bereid een 0,3% fosfaatgebufferde zoutoplossing en reinigingsmiddel (PBST) door mengen 1x PBS met 0,3% (v: v) detergent.
10. Bereid blokkerende buffer door verdunning van geit serum 01:10 (v: v) in 0,3% PBST.
11. Bereid een primaire antilichaamoplossing voor een bepaalde proteïne van belang door verdunning primary antilichaam (bijvoorbeeld konijn anti-focale adhesie kinase (FAK)) 1: 200 (v: v) in blokkeerbuffer.
12. Bereid een secundaire antilichaamoplossing door verdunning van een fluorescente probe-geconjugeerd antilichaam (bijvoorbeeld, geit anti-konijn) 1: 1000 (v: v) in blokkeerbuffer.

2. Voorbereiding van Elastomere Stempels voor 3D micropatterning

Opmerking: elastomeer postzegels zijn gemaakt met PDMS.

1. Maak een PDMS oplossing in dezelfde verhouding als beschreven in stap 1.3 en meng. Plaats het mengsel in een vacuümkamer gedurende 15-30 min om eventuele luchtbellen die tijdens het mengproces geïntroduceerd verwijderen.
2. Giet de ontgaste oplossing in een plastic wegen boot of petrischaal met een silicium meester die lithografisch een patroon met kenmerken van de gewenste geometrie. Voor het beste resultaat, genezen van de PDMS oplossing bij 60 ° C ~ 12 uur.
   Opmerking: De silicium meesters zijn zeer flexibel; Dit protocol maakt gebruik van rechthoekige structuren met afmetingen van 50urn x 200 urn x 50 urn afstand 200 urn uit elkaar. De silicium masters kunnen worden gemaakt met behulp van standaard fotolithografische technieken. Kort samengevat, een epoxybasis fotoresist spin-coating op een siliciumwafel. Een masker waarin de gewenste eigenschappen stempel wordt bovenop de fotoresist gecoate wafer, die vervolgens wordt blootgesteld aan UV-licht. De gewenste eigenschappen niet geblokkeerd door het masker wordt blootgesteld aan het licht en de fotolak op deze locaties wordt verknoopt, terwijl de rest van de fotoresist coating oplosbaar en kan worden weggespoeld.
3. Na de PDMS op de silicium meester is uitgehard om de gewenste eigenschappen, verwijdert u de PDMS en meester uit de plastic container. scheiden voorzichtig de PDMS van silicium wafer en verwijderen overtollige PDMS uit de hele bedrukt functies met een schone scheermesje.
4. Knip nu de PDMS patroon met ingedrukt functies in afzonderlijke rechthoekige stempels (~ 8-mm x 5 mm) met een scheermesje. Bewaar deze feature-side-up in een keleen 100-mm diameter petrischaal.
5. Daarnaast gebruikt u de PDMS oplossing in stap 1.3 beschreven dragers te maken voor de rechthoekige stempels.
6. Met behulp van een spinbekleder, verspreid -2-3 g PDMS oplossing gelijkmatig op een 100-mm diameter petrischaal en genezen van de PDMS voor ~ 12 uur bij 60 ° C zoals in stap 2,1. Dan, met behulp van een scheermesje, snijd de dunne laag van PDMS in rechthoeken (~ 5 mm x 2 mm).
   Opmerking: Twee dragers zijn nodig voor elke PDMS stempel in stap 2,3. De dragers kunnen worden opgeslagen in de 100-mm diameter petrischaal die de PDMS stempels bevat.
7. Voordat de PDMS postzegels en dragers kunnen worden gebruikt voor celkweek, steriliseren door onderdompeling in 70% ethanol en droog met behulp van een aspirator in een bioveiligheid kast (celkweek kap).

3. Bereiding van 3D epitheelweefsels

1. In een bio kast, voeg een daling van ongeveer 50 ui 1% BSA in PBS tot de bovenkant van de postzegel. Plaats de druppel die zegels bij 4 ° C voor een minivan minimum 4 uur zodat de BSA adsorbeert aan het oppervlak van de stempel.
2. Zuig BSA-oplossing uit de PDMS postzegels.
3. Was de oppervlakken van de stempels tweemaal met celkweekmedium (50 gl per wasbeurt per stempel moet voldoende zijn), opzuigen na elke wasbeurt.
4. Behandel de gesteriliseerde PDMS postzegels en ondersteunt het gebruik van gebogen roestvrijstalen pincet. In een bioveiligheid kast, lay-out van een 35-mm diameter weefselkweek schotel voor elke PDMS stempel. In elk gerecht, vast twee PDMS steunen gescheiden door een afstand iets minder dan de lengte van de PDMS postzegels.
5. Met de pincet, steriliseren zoveel ronde glazen dekglaasjes (15 mm diameter # 1) en er PDMS postzegels middels 70% ethanol. Zuig de overtollige vloeistof uit de dekglaasjes terwijl ze te houden met de pincet. Bewaar de gewassen dekglaasjes in een afzonderlijke 100 mm diameter petrischaal.
6. Verdeel ~ 50 pi van het collageen mengsel gelijkmatig bekleden van het oppervlak van elke PDMS stempel.
7. Oppakkenelk met collageen beklede PDMS stempel met de pincet en voorzichtig omkeren hen. Verlaag de omgekeerde stempels bovenop de PDMS steunt in 35-mm diameter weefselkweek vastgestelde voorgeschoteld zodat het collageen tussen de stempel en de onderkant van de weefselkweekplaat. Incubeer de schaaltjes 37 ° C gedurende 30 minuten.
8. Verdeel ~ 50 pi van het resterende collageen mengsel op elk van de ronde dekglaasjes en incubeer ze op 37 ° C gedurende 30 min (later, deze worden bovenop het gemanipuleerde weefsel om volledig inkapselen in collageen geplaatst).
9. Verkrijgen van een 100-mm diameter weefselkweekplaat met epitheelcellen (ex. EpH4 muizen mammaire epitheelcellen) en ~ 40% confluentie. Zuig het celkweekmedium en eenmaal wassen met 10 ml 1 x PBS. Voeg 2 ml trypsine om de cellen en incubeer bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten.
10. Voeg 8 ml vers kweekmedium weefselkweek schaal bevattende cellen getrypsiniseerd losmaken resterende hechtende cellen uit het schaaltje. Meng voorzichtig door pipetteren en beweeg het celmengsel een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten.
11. Zuig het supernatant van de conische buis en resuspendeer de celpellet in celkweekmedium. Met behulp van een hemocytometer, tel de cellen aan de concentratie van de suspensie te bepalen. Pas de vering volume tot een eindconcentratie van ⁶ ~ 10 -10 ⁷ cellen / ml te verkrijgen.
12. Verwijder de gegeleerde collageen monsters uit de incubator. Met behulp van de pincet, til de PDMS postzegels recht omhoog om ze los te maken van de gevormde collageen en gooi ze weg.
13. Verdeel ~ 30 pi van het geconcentreerde celsuspensie op het oppervlak van elke collageengel met holtes gevormd van de gewenste geometrie. Houd u aan de cellen onder een helderveld microscoop met een 10x / 0,25 NA doelstelling terwijl zachtjes schudden van de gerechten van links naar rechts naar cel afwikkeling van transacties binnen de holtes te promoten. De holten worden ingevuld op ~ 5 min.
14. aan rchrap overtollige cellen van rond de holten, kantelen elke weefselcultuurschaal op zijn kant en voorzichtig afzien ~ 400 pi celcultuurmedium over het oppervlak van de collageengel. Zuig de vloeistof en herhaal het wassen 1-2 keer, het controleren van de collageen gels onder de microscoop tussen elke wasbeurt.
15. Nadat de overtollige cellen zijn verwijderd uit hele-cel gevulde holten in de matrijs collageen, plaatst de weefselkweekschalen in een cel incubator bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Vervolgens, met de pincet voorzichtig omkeren van de met collageen beklede dekglaasjes klasse en plaats ze bovenop het cel collageen gevulde matrijzen zodat het collageen van de dekglaasjes vormt een kap over het cel gevulde holtes. Incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
16. Zodra de collageen kappen hebben gehecht aan het cel collageen gevulde mal afzien ~ 2-2,5 ml celkweekmedium langzaam via glazen dekglaasje bovenop de gels. Cultuur van de monsters bij 37 ° C gedurende 1-3 dagen.
    Notitie:24 uur na de eerste enting, kan de epitheliale weefsels worden behandeld met groeifactoren zoals epidermale groeifactor (EGF) of hepatocyt groeifactor (HGF) te induceren vertakking.

4. Immunofluorescentie en beeldanalyse

1. Zuig het celkweekmedium uit de weefselkweek schalen en voeg voldoende fixatief de celbevattende gels omvatten. Incubeer de schotels bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten op een schudinrichting bij 200 rpm.
2. Zuig het fixeermiddel, vul de weefselkweek schalen met 1 x PBS en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten op een schudinrichting bij 200 rpm. Herhaal dit twee keer voor drie totaal wasbeurten.
3. Om kernen label: Zuig het PBS uit de weefselkweek schotel en te vervangen door Hoechst-oplossing. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15-20 min. Om vlek voor FAK of een andere marker die detecteerbaar is met antilichamen, ga dan naar stap 4.5.
4. Zuig het nucleaire labelingoplossing en was de celbevattende gels driemaal met 1x PBS zoals in stap 4,2. Bevlekt monsters kunnen worden opgeslagen in 1x PBS bij 4 ° C tot verder gebruik.
5. De kleur wordt een eiwit van belang: Zuig het PBS uit de weefselkweekplaten, voeg 300 pl PBST 0,3%, en incubeer het monster bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
6. Zuig het PBS, bedekken de gels met een blokkeerbuffer, en incubeer op een schudapparaat (200 rpm) bij kamertemperatuur gedurende ~ 4 uur.
7. Zuig het blokkeerbuffer, bedekken de gels met primaire antilichaamoplossing en incubeer op een schudinrichting bij 200 rpm gedurende de nacht bij 4 ° C.
8. Zuig het primaire antilichaamoplossing, voeg 0,3% PBST oplossing en incubeer op een schudinrichting bij 200 tpm bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Zuig het PBST en herhaal elke 30 min gedurende 3-4 uur.
9. Herhaal de stappen 4,7 en 4,8, ditmaal incubatie met de secundaire antilichaamoplossing. Wikkel de weefselkweek gerechten met aluminiumfolie om fotobleken van het secundaire antilichaam te voorkomen. Na de final wassen, kunnen gekleurde monsters opgeslagen in 1x PBS bij 4 ° C tot verder gebruik.
10. Om monsters te visualiseren, gebruik dan een 10x / 0,30 NA doelstelling gericht op de mid-plane van de epitheliale weefsels.
11. Om celkernen, image gefixeerde monsters gelabeld met een nucleaire marker met behulp van een 10x / 0,30 NA doelstelling onder UV-belichting te visualiseren.
12. Om monsters gekleurd voor een eiwit van belang, beeld met behulp van een 10X / 0.30 NA objectief op een omgekeerde fluorescentie microscoop te visualiseren.
13. Om de frequentie kaarten van eiwit kleuring van meerdere weefsels (meestal 50 of meer) van identieke initiële geometrie, de eerste import elk van de beelden met behulp van standaard beeldanalyse software (zie Materials) en ze converteren naar 8-bits grijstinten.
14. Om drempel deze beelden, ze converteren naar binaire (dwz, halftone / zwart-wit) door het definiëren van een grijstinten cutoff punt; grijswaarden onder de drempel worden zwart, en die boven de drempel worden wit. Vervolgens combinerenelk van de afzonderlijke binaire afbeeldingen in een enkel beeld stack.
15. Vervolgens registreert de gestapelde foto's (dat wil zeggen, uitlijnen of match ze) in de analyse software. Veel beeldanalyse software pakketten komen met een vrij beschikbare registratie plugin.
    1. Gebruik elke afbeelding in een stapel als een sjabloon voor de uitlijning van de volgende afbeelding, zodat de beelden in de hele stack worden uitgelijnd door voortplanting. Tot slot, overlay (project) de beelden in de uitgelijnde afbeelding stapel op basis van gemiddelde intensiteit om een ​​enkel beeld met een pixel frequentie kaart te vormen. Dit beeld kan vervolgens worden kleurcodering met behulp van software voor beeldbewerking keuze ^10,11.

Resultaten

Algemeen schema van borstklieren epitheelweefsel microfabrication

Een algemeen schema van de microfabrication procedure waarin het experimentele workflow wordt weergegeven in figuur 1. Het resultaat is een array van epitheliale weefsels van identieke geometrie en afstand die volledig zijn ingebed in een gel ECM. Een representatief experiment gebruikt EpH4 muizen mammaire epitheliale cellen gekweekt in een gel van bovine type ...

Discussie

Het hierboven beschreven protocol schetst een methode om identieke epitheliale weefsels van vooraf bepaalde vorm te produceren, waardoor ruimtelijke controle mogelijk is over de mechanische stress die cellen in het weefsel ervaren. Een elastomerische mal wordt gebruikt om holtes in type I collageen te creëren die vervolgens worden gevuld met epitheelcellen en bedekt met een extra collageenlaag, zodat cellen volledig worden ingekapseld in een 3D collageenmatrixomgeving. Verdere cultivatie van deze weefsels en behandeling ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184
PDMS curing agent	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184
Lithographically patterned silicon master	zelf-gemaakt	N/A
Kunststof weegschaal	Fisher Scientific	08-732-115
Petrischalen met een diameter van 100 mm	BioExpress	D-2550-2
Ethyl Alcohol 200 Proof	Pharmco-Aaper	111000200	Maak een 70% EtOH (v:v) oplossing door te mengen met dH2O
Veiligheidsscheermesje	American Safety Razor	620179
1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1)	Hyclone	SH30023FS
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150H
10x Hank’s balanced salt solution (HBSS)	Life Technologies	14185-052
Insulin	Sigma Aldrich	I6634-500MG
Gentamicin	Life Technologies	15750-060
10x Phosphate-buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP399-500
Natriumhydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	221465-500G
Bovine type I collagen (niet-pepsinized)	Koken	IAC-50
Albumine uit runderserum (BSA)	Sigma Aldrich	A-7906
Gebogen roestvrijstalen pincet	Dumont	7
Weefselkweekschalen met een diameter van 35 mm	BioExpress	T-2881-6
Kegelbuisjes van 15 ml	BioExpress	C-3394-2
1,5 ml Eppendorf Safe-Lock-buis	USA Scientific	1615-5500
Ronde glazen dekglasjes van 15 mm diameter	Bellco Glass Inc.	Speciale bestelling
0,05% 1x Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
Paraformaldehyde	VWR	100503-916
Triton X-100	Perkin Elmer	N9300260	Detergens
HGF	Sigma Aldrich	H 9661	Opnieuw gesuspendeerd in dH2O bij 50 mg/ml
Konijnen anti-muis FAK-antilichaam	Life Technologies	AMO0672
Geiten anti-konijn Alexa 488-antilichaam	Life Technologies	A-11034
Adobe Photoshop	Adobe	N/A	Gebruikt voor het kleuren van pixelfrequentiekaarten.
FIJI (ImageJ)	NIH	N/A	Gratis beeldanalysesoftware die wordt gebruikt voor thresholding, registreren en het overlappen van afbeeldingen om een pixelfrequentiekaart te maken. De StackReg-plugin werd gebruikt voor het registreren van binaire afbeeldingen.