High-throughput screening van Carbohydrate-afbrekende enzymen via innovatieve Onoplosbare chromogeen substraat Assay Kits

Samenvatting

Een high-throughput assay voor enzymscreening wordt beschreven. Deze multiplexed, gebruiksklare assaykit bestaat uit vooraf gekozen Chromogene Polymer Hydrogel (CPH) substraten en complexe Insoluble Chromogene Biomass (ICB) substraten. Doelenzym zijn polysacharide-afbrekende endo-enzymen en proteasen.

Samenvatting

Carbohydrate active enzymes (CAZymes) hebben meerdere rollen in vivo en worden veel gebruikt voor industriële verwerking in de biobrandstof-, textiel-, wasmiddel-, papier- en voedingsindustrie. Een dieper begrip van CAZymes is belangrijk vanuit zowel fundamenteel biologisch als industrieel oogpunt. Er bestaan enorm veel CAZymes in de natuur (vooral in micro-organismen) en honderdduizenden zijn gecatalogiseerd en beschreven in de carbohydrate active enzyme database (CAZy). Echter, de snelheid van ontdekking van vermeende enzymen heeft onze mogelijkheden om hun activiteiten biochemisch te karakteriseren overtroffen. Een reden hiervoor is dat vooruitgang in genoom- en transcriptoomsequentietechnieken, samen met bijbehorende bio-informaticatools, een snelle identificatie van kandidaat-CAZymes mogelijk maken, maar de technologie voor het bepalen van de biochemische kenmerken van een enzym is langzamer gevorderd. Om deze technologische kloof te overbruggen, wordt hier een nieuwe hoog-doorvoer assaykit beschreven die gebaseerd is op onoplosbare chromogene substraten. Er werden twee verschillende soorten substraten geproduceerd: Chromogeen Polymeer Hydrogel (CPH) substraten (gemaakt van gezuiverde polysacchariden en eiwitten) en Inoplosbare Chrogene Biomassa (ICB) substraten (gemaakt van complexe biomassamaterialen). Zowel CPH- als ICB-substraten worden geleverd in een 96-well hoog-doorvoer assaysysteem. De CPH-substraten kunnen in vier verschillende kleuren worden gemaakt, waardoor ze gemengd kunnen worden en zo de assaydoorvoer kunnen verhogen. Het protocol beschrijft een 96-well plaatassay en illustreert hoe deze assay kan worden gebruikt voor het screenen van de activiteiten van enzymen, enzymcocktails en brouwsels.

Inleiding

Technieken voor het delven van genomen en metagenomen zijn de afgelopen jaren snel ontwikkeld, evenals middel- en hoogdoorvoerstrategieën voor het klonen en uitdrukken van recombinante enzymen. Bovendien zijn bio-informaticabronnen en bijbehorende depots, zoals (CAZy)^1,2, enorm uitgebreid. Er zijn echter aanzienlijke uitdagingen inherent aan de exploitatie van microbiële enzymdiversiteit voor industriële doeleinden en de empirische bepaling van enzymactiviteiten is nu een serieuze knelpunt geworden. Het wordt bijvoorbeeld geschat dat we met de huidige methoden de activiteiten van niet meer dan 4% van de eiwitten binnen de CAZy-database veilig kunnen voorspellen. Hoewel er talrijke methoden beschikbaar zijn voor het bewaken van enzymactiviteiten, hebben ze allemaal enkele beperkingen. Er zijn goed gevestigde technieken op basis van chromatografie in combinatie met massaspectrometrie beschikbaar voor het beoordelen van de oligomere fragmenten van glycosyl hydrolase (GH) activiteiten^3,4. Deze benaderingen zijn echter arbeidsintensief en hebben over het algemeen een lage doorvoer. Methoden op basis van de meting van reducerende suikers, zoals de dinitrosalicylzuur⁵ en Nelson-Somogyi⁶ assays, worden veel gebruikt voor het beoordelen van GH-activiteiten. Deze tests hebben echter een beperkte doorvoer en kunnen vatbaar zijn voor nevenreacties. Individuele chromogene polysacharide substraten, zoals azurine cross-linked (AZCL) worden veel gebruikt voor de bepaling van enzymactiviteiten, maar het kopen van alle substraten afzonderlijk en het handmatig verdelen van de substraatpoeders in de testplaat kan omslachtig en duur zijn⁷.

We hebben een nieuwe generatie chromogene polymeerhydrogeel (CPH) substraten ontwikkeld op basis van chloortriazine kleurstoffen die, in combinatie met een 96-well filterplaat, een hoogdoorvoer testsysteem vormen. Aanvullende onoplosbare chromogene biomassa (ICB) substraten zijn ontwikkeld die informatie geven over de beschikbaarheid van substraten in complexe polymeermengsels, zoals die welke bestaan in lignocellulosische biomassa. Elke substraat kan in een van de vier kleuren worden geproduceerd en verschillend gekleurde substraten kunnen in een enkele put worden gecombineerd. In dit protocol wordt getoond dat deze methodologie kan worden toegepast op een breed scala aan polysachariden en eiwitten en het potentieel voor het screenen van GH's, lytische polysacharide monooxygenasen (LPMO's) en proteasen. Specifieke protocollen worden gegeven voor het gebruik van 96-well platen en representatieve resultaten illustreren de hoge efficiëntie van de CPH en ICB substraatkits als hulpmiddelen voor enzymscreening.

Een belangrijk voordeel van de beschreven testkits, ongeacht het substraat, is dat de kits binnen 15 minuten na de activeringsstap klaar zijn voor gebruik. Dit elimineert de noodzaak voor tijdrovende assemblage van de test uit ruwe substraatmaterialen zoals het geval is met sommige andere methoden⁷. De CPH en ICB substraten hebben uitstekende opslag (minstens een jaar bij kamertemperatuur), pH en temperatuur stabiliteit ⁸ en vereisen geen gespecialiseerde apparatuur of training. De CPH of ICB tests zijn gebaseerd op een 96-well filterplaat waarin de reactie met het enzym wordt uitgevoerd. Als het enzym actief is met een bepaald substraat, worden oplosbare gekleurde oligomeren gegenereerd, waardoor een gekleurde supernatant ontstaat die vervolgens kan worden gefilterd in een gewone heldere 96-well plaat met behulp van een vacuüm manifold of een centrifuge ⁸.

De substraten zijn gekleurd met chloortriazine kleurstoffen die absorberen in het zichtbare spectrum (VIS) bereik en individuele kleuren (rood, blauw, geel en groen) kunnen worden opgelost met lineaire regressie als verschillende CPH substraten van verschillende kleuren in een enkele put worden gemengd en het enzym op meer dan één substraat inwerkt. De resulterende plaat met de supernatanten kan worden gemeten met behulp van een standaard microtiter-plaat lezer die in staat is om absorptie in het VIS-bereik te meten. Het mengen van verschillende substraten met verschillende kleuren in één put verhoogt de doorvoer van het testsysteem, tot een totaal van 384 experimenten in een 96-well plaat (4 verschillende substraten van verschillende kleuren per put).

CPH substraten bieden een waardevol hulpmiddel voor het beoordelen van de specifieke activiteit van een enzym, terwijl ICB substraten worden gebruikt om de capaciteit van een enzym te evalueren om een component te verteren binnen de context van complexe substraatmengsels die enzymen meestal tegenkomen binnen biomassa. Hoewel ICB substraten geen informatie geven over individuele enzym specificiteiten, zijn ze toch nuttige hulpmiddelen voor het beoordelen van de commerciële prestaties van enzymen, cocktails of bouillon.

Protocol

1. chromogeenonderzoek met CPH substraten in een 96-well plaat formaat

1. Activering van de testkit plaat
   1. Activeer de 96-well filter (met blauwe CPH xylaan) bepalingskit plaat (List of Materials) door toevoeging van 200 ul activatoroplossing (verkregen bij de kit) aan elk putje, gevolgd door 10 minuten incubatie bij kamertemperatuur zonder roeren.
   2. Toepassen vacuüm met behulp van een vacuüm verdeelstuk (met afstandsblok binnen en elke standaard, transparante 96-well plaat een verzamelplaat) om bestaande activering oplossing te verwijderen. Het is ook mogelijk een centrifuge bij 2700 xg gebruik gedurende 10 min bij deze stap in plaats van het vacuüm spruitstuk.
   3. Was de CPH substraten door het toevoegen van 100 pi steriel water en toe te passen vacuüm (of centrifugale kracht) aan de stabilisator te verwijderen. Herhaal deze stap nog twee keer en de borden zijn nu klaar voor gebruik.
2. enzymreactie
   LET OP: Vermeld altijd bufferalleen als een negatieve controle en indien mogelijk eerder gekarakteriseerde enzymen als positieve controles. Gebruik een statistisch juiste aantal herhalingen. De CPH substraten zijn stabiel tussen pH 3,0-10,0 en de totale bufferuiteinde enzymoplossing in elk putje mag niet meer dan 180 pl. Plantenextract of kweekbouillon kan ook worden gebruikt in plaats van gezuiverde enzymoplossing.
   1. Voeg 150 ul 100 mM natriumacetaatbuffer, pH 4,5 en 5 ul endo -cellulase oplossing (tot een uiteindelijke concentratie van 1 U / ml) aan elk putje van de assay kit plaat.
   2. Plaats het product plaat (een duidelijke-wells plaat compatibel zijn met de microtiterplaat reader) onder de testkit plaat om eventuele lekkage van de reactie plaat te verzamelen tijdens het schudden.
   3. Incubeer de testkit plaat bij 25 ° C gedurende 30 min in een horizontale schudinrichting bij 150 rpm.
      Opmerking: Het mengen de reactie in de assay kit plaat gedurende de incubatie is cruciaal om een ​​consistente en reproduceerbare resultaat. CPH substraten zijn stabiel tot 90 ° C. De incubatietijd moet worden verhoogd tot 24 uur bij het testen van cultuur bouillon met onbekende enzym concentraties CPH substraten. Merk op dat geschikte incubatietijden afhangen van de activiteit van het enzym (en), maar in het algemeen als er geen detecteerbare activiteit in 24 uur, is het waarschijnlijk dat het enzym de geteste substraat niet zal degraderen. Een actief enzym wordt verslechtering van de onoplosbare Polysacchariden chromogene substraat van de CPH in oplosbare chromogene oligosachariden, die tot gekleurde supernatant zijn.
   4. Plaats de schone product plaat in het vacuüm spruitstuk met de afstandhouder blok binnen.
   5. Plaats de testkit plaat op de top en toe te passen vacuüm (maximale negatieve druk van -60 kPa). Het is ook mogelijk een centrifuge bij 2700 xg gebruiken gedurende 10 min.
      OPMERKING: Het filtraat dat de gekleurde oligosacchariden zoals reactieproduct nu uit productgroep dienblad verdere analyse ⁸ .
3. Detectie en kwantificering
   1. Controleer of de hoeveelheid vloeistof in elk putje van de plaat product ongeveer gelijk door visuele inspectie.
   2. Lees de absorptie van de verzamelplaat bij 595 nm voor blauw CPH-xylaan met een plaatlezer.
   3. Bij het doen gegevensanalyse, trek de buffergeheugen-negatieve controlewaarden van de waarden uit de putjes waarin een enzym werd toegevoegd. Bereken het gemiddelde en de standaardfout van middelen (SEM) van de herhalingsputjes ^8.

2. chromogeenonderzoek met ICB substraten in een 96 putjes format

1. enzymreactie
   1. Voeg 150 ul 100 mM natriumacetaatbuffer, pH 4,5 en 5 gl 31 U / ml endo -xylanase oplossing in elk putje van de assay kit plaat met rood ICB-tarwestro (uiteindelijke enzymconcentratie in de put: 1 U / ml) .
      LET OP: De testkit platen (96-well filter plAtes met ICB-substraten) worden vervaardigd, zoals beschreven in de literatuur (zie lijst van materialen). De ICB substraten zijn stabiel in buffers met een pH-bereik tussen pH 3,0-10,0. Vermeld altijd alleen buffer als een negatieve controle, commerciële enzymen als een positieve controle gebruikt en een statistisch voldoende aantal replica's.
      1. Niet activeert de ICB substraten zoals CPH substraatplaat, maar verwijdert de stabilisator door driemaal wassen met 100 pl water, gevolgd door vacuümfiltratie of centrifugatie.
   2. Zet het product plaat onder de substraatplaat om eventuele lekkage van de substraatplaat te verzamelen tijdens het schudden.
   3. Incubeer de reactie bij 25 ° C onder schudden bij 150 rpm gedurende 2 uur.
      LET OP: Een actieve enzym wordt verslechtering van de onoplosbare chromogene polysacchariden in de ICB substraat in oplosbare oligosacchariden, die zichtbaar als gekleurde supernatant zijn. ICB substraten zijn stabiel tot 90 ° C. De incubatie time moet worden verhoogd tot 24 uur of niet-gezuiverde enzymen zoals kweekmedia worden gebruikt.
   4. Plaats het product plaat in het vacuüm spruitstuk met de afstandhouder blok binnen.
   5. Plaats de testkit bovenplaat en toepassen vacuüm (maximale onderdruk van -60 kPa) of een centrifuge om het product uit de testkit plaat filtraat in de put van de plaat product.
      OPMERKING: Het filtraat dat de gekleurde oligosacchariden zoals reactieproduct is nu in de verzamelplaat ⁸ voor verdere analyse.
2. Detectie en kwantificering
   1. Controleer of de hoeveelheid vloeistof in elk putje van de verzamelplaat ongeveer gelijk door visuele inspectie.
   2. Lees de absorptie van de collectie plaat bij 517 nm voor rode ICB-tarwestro behulp van een plaat lezer.
   3. Bij het doen gegevensanalyse - aftrekken van de buffer - enige negatieve controlewaarden van de waarden uit de putjes waarin een enzymwas toegevoegd. Bereken het gemiddelde en de standaardfout van middelen (SEM) van de herhalingsputjes ^8.
      LET OP: In het geval van het screenen van onbekende enzymen, raden we het maken van een verdunningsreeks om meer gedetailleerde gegevens over het dynamisch bereik van de activiteit enzym te verkrijgen.

Resultaten

De high-throughput en multiplexing capaciteit van deze test is gebaseerd op de chromogene onoplosbaar polymeer (of eiwit) hydrogel (CPH) substraten die in 96-well filterplaten. Enzymen en negatieve controles worden toegevoegd aan de testkit plaat (figuur 1A) en de enzymen breken het overeenkomstige substraat vervaardigen van een gekleurde supernatant (Figuur 1B). Nadat de reactie is voltooid, wordt de bovenstaande vloeistof overgebracht in een duidelijke putjes plaat product en de absorptie kan direct worden gemeten met een spectrofotometer geschikt voor 96 putjes (Figuur 1C).

Een voorbeeld van een dosis respons van CPH-arabinoxylaan te xylanase bij verschillende concentraties van het enzym (0,00-0,75 U / ml) wordt getoond in figuur 1D, waar de afnemende enzymconcentratie visueel kan worden waargenomen. Een meer gedetailleerde spectrofotometrische quantcatie kan worden gebruikt om de absorptie versus enzymconcentratie (figuur 1E) plot. De signaalintensiteit overeen met de enzymactiviteit. De reproduceerbaarheid van de test wordt getoond door de foutbalken (standaardfout van het gemiddelde SEM van drie replica's). Verdere experimenten op de reproduceerbaarheid van deze test worden elders gepubliceerd ^8.

Figuur 1. xylanasebehandeling van CPH-arabinoxylaan. A) Een schema van de testkit plaat met de CPH substraat (bv, CPH-arabinoxylaan) net vóór de toevoeging van enzymen 1 en 2 en de buffer geladen in 96-well filterplaat putjes -alleen control (enzym 1 had endo -xylanase activiteit); B) Afbraak van CPH-arabinoxylaan door enzym 1 produceerde een gekleurd supernatant; C) bij het ​​vacuüm-assisted filtratie-ion van de supernatanten bij het ​​product plaat wordt de absorptie gemeten spectrofotometrisch D) product plaat waarop de reactieproducten na behandeling van CPH-arabinoxylaan in 4 verschillende kleuren met verschillende concentraties -β endo-1,4-xylanase in 100 mM natriumacetaatbuffer, pH 4,5 gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. E) Kwantificering van de reactie producten van D met behulp van spectrometrie klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Er zijn verschillende mogelijkheden voor het gebruik van deze assay enzym screening. Een optie is om een 96-wells plaat met verschillende polysacchariden voor screening, bijvoorbeeld een klein aantal (gezuiverd) endo -enzymes met onbekende activiteit gebruikt. In dit geval wordt het resultaat tonen die polysachariden zijn Degradkunnen de doelenzym. Dit principe tonen, werd een endo -cellulase getest tegen verschillende CPH substraten bij 25 ° C. Drie verschillende concentraties enzym (0,5 U / ml, 1,0 U / ml en 5 U / ml) werden gedurende 30 min. Het resultaat is duidelijk zichtbaar in de plaat product (Figuur 2A). Het product sheet voor deze endo -cellulase verstrekt door de leverancier specificeert side-activiteit xyloglucan (tamarinde), gerst β-glucaan, glucomannaan, berkenhout xylaan en lage kant-activiteit galactomannan. Consistent hiermee activiteit naast cellulase bleek tegen CPH-β-glucan (gerst), CPH-xyloglucan (tamarinde), CPH-xylaan (beukenhout) en lage activiteit tegen CPH-galactomannan (figuur 2B). Glucomannan werd niet getest. Dezelfde CPH substraten werden gedigereerd met commercieel verkrijgbare enzymen (drie verschillende enzymconcentraties: 0,1 U / ml, 0,5 U / ml en 1,0 U / ml) als positieve controles onder dezelfde omstandigheden dan de voorgaandeexperiment. Alle substraten werden afgebroken door het enzym positieve controle en de signaalintensiteit verhoogd overeenkomt met hogere enzymconcentratie (figuur 2C).

Figuur 2. Acht verschillende CPH substraten werden geïncubeerd onder schudden bij 25 ° C gedurende 30 min. A) Het product plaat van verschillende substraten CPH gedigereerd met endo -cellulase, bij verschillende concentraties. B) Kwantificering van de activiteit en verschillende nevenactiviteit van endo -cellulase. De foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde van drie replica C) activiteit van verschillende commerciële enzymen om de overeenkomstige CPH substraat (endo-cellulase en 2-HE-cellulose. E-Lamse en CPH-pachyman, CPH-curdlan, CPH- β-glucan (gerst); E-XYAN4 en CPH-xylaan, E-XEGP en CPH-xyloglucan, E-blaam en CPH-amylose, E-BMACJ en CPH-galactomannan; Alle enzymen uit Megazyme). De fout balken geven de standaardfout van het gemiddelde van twee replica's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De onoplosbare chromogene biomassa (ICB) substraten zijn een nuttige aanvulling op het chromogene substraat repertoire, omdat ze te behouden voor een deel van de natuurlijke inrichting van polysacchariden in celwanden van planten die het hoofdbestanddeel van biomassa zijn. CPH en ICB substraten dat in dit voorbeeld de uitgescheiden enzymen van Phanerochaete chrysosporium analyseren wanneer gekweekt in vloeibaar medium. De plaat opzet van de testkit plaat wordt getoond in figuur 3A, met 19 CPH substraten en 5 ICB substraten (4 wells voor elk substraat, figuur 3B). P. Chrysosporium was Cultivatored drie dagen waarna de kweeksupernatant onderzocht. Daarom werd 125 gl 200 mM buffer overgebracht naar elk putje en 25 ul kweeksupernatant toegevoegd. Drie verschillende pH-omstandigheden zijn getest met natriumacetaatbuffer pH 4,0, natriumfosfaatbuffer pH 6,0 of pH 8,0 (Figuur 3C). De plaat werd geïncubeerd onder schudden (150 rpm) bij 25 ° C gedurende 2 uur.

De reactieproducten werden overgebracht naar het product plaat (Figuur 3D) en geanalyseerd. P. Chrysosporium geproduceerde enzymen voor de afbraak van verschillende glucanen, zetmeel en xylanen (figuur 3E). Lagere signalen worden gedetecteerd voor hemicellulose arabinan (suikerbiet) en pectinestoffen galactan en voor RGI (sojabonen). De enzymen die actiever waren in zure omstandigheden (pH 4,0) dan bij neutrale of licht basische omstandigheden (pH 8,0). Lagere activiteit in de richting van ICB substraten (figuur 3F)toont aan dat wanneer de polysachariden in een natuurlijke omgeving, de efficiëntie van het enzym is niet hetzelfde als een zuivere polysaccharide en daarom ICB substraten vertonen een meer realistische inschatting enzymefficiëntie, als het wordt toegepast op ruwe of pre- behandelde plantmateriaal.

Figuur 3. Screening van een kweeksupernatant van een 3-dagen oude vloeibare cultuur van Phanerochaete chrysosporium met behulp van een multi-substraat plaat met 19 CPH en 5 ICB substraten. A) Een schema van de plaat opstelling met 4 putten voor elke individuele substraat (grijze achtergrond = CPH substraten, oranje achtergrond = ICB-substraten). B) Beeld van de assay plaat met de ondergrond. C) regeling met de buffer voorwaarden die volgens dat experiment (200 mM natriumacetaat pH 4,0, natriumfosfaat pH 6,0 en natriumfosfaat pH 8,0). D) foto te platen na 2 uur bij 25 ° C. E) absorpties werden gedetecteerd bij 517 nm en uitgezet voor elk CPH substraat en F ) ICB substraat resultaten voor de betreffende enzymen. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De chromogene substraten kunnen ook gebruikt worden om synergistische effecten te bestuderen door toepassing van een mengsel van verschillende gekleurde CPH substraten in één putje en analyse van de reactie supernatant na behandeling met één enzymen of enzym cocktails.

In het volgende voorbeeld getoond in figuur 4, werden rode CPH-cellulose en geel CPH-xylaan substraten samen een ongeveer equ gemengdAl verhouding in 96-well filterplaat putjes. Figuur 4A toont het gekleurde reactieproducten na 1 uur behandeld bij kamertemperatuur zonder enzymen (controle), cellulose cel (2 U / ml), xylanase Xyl (1 U / ml) en een mengsel van beide enzymen (3 replicaten van elke benadering) in 100 mM natriumacetaatbuffer pH 4,5. Voor analyse werd het reactieproduct spectrofotometrisch gekwantificeerd door het scannen van het absorptiespectrum van 350 nm tot 700 nm (figuur 4B). Vaak visuele inspectie alleen kan een indicatie of het enzym werkt op één of meerdere substraten geven echter opgenomen absorptie spectra die voortvloeien uit verschillende kleurstoffen kunnen ook worden opgelost met behulp van eenvoudige lineaire regressie ⁸ om een nauwkeuriger indicatie van de mate van afbraak van elk geven substraat uit het mengsel.

Gebruik CPH substraten hoofdzaak mengsels draagt ​​bij aan de verwerkingscapaciteit van de assay, zodat screening tegen maximaal 4 verschillende substraten in één experiment (één ook). In het getoonde voorbeeld zijn vier verschillende substraten gebruikt: blauw CPH-β-glucan (gerst), geel CPH-xylaan (beukenhout), groene CPH-amylose en rode CPH-pectine galactan (lupine). De indeling van de substraatplaat wordt getoond in figuur 4C en een foto van de testplaat in figuur 4D. De reactie werd uitgevoerd in 100 mM natriumacetaatbuffer pH 4,5 gedurende 30 minuten bij 25 ° C en 150 rpm. Eerste single enzymen met toenemende enzymconcentratie werden getest met de bijbehorende CPH substraat (Figuur 4E) en de gekleurde supernatant werd ontvangen zoals verwacht in het product plaat (Figuur 4F, rij 1A - 12D). Rij E bevatte twee verschillende substraten geel CPH CPH-xylaan en blauwe CPH-β-glucan, die werden afgebroken met verschillende verhoudingen van de overeenkomstige enzymen endo -xylanase en endo-glucanase. Na de reactie werd het resultaat visible in het product plaat: de kleur van het reactieproduct werd donkerder groen-blauw, wanneer meer endo glucanase aanwezig was (figuur 4F, 4E-6E) en omgezet in een lichtere geel-groen, wanneer het endo -xylanase concentratie verhoogd ( Figuur 4F, 10-12E). Hetzelfde is te zien in rij F, waarbij de twee substraten rode CPH-pectine galactan en geel CPH-xylaan werd afgebroken met endo -galactanase en endo -xylanase. Alle vier verschillende gekleurde CPH substraat aanwezig (figuur 4F, 1G-12F) en enkele enzymen afgebroken passende CPH substraat en doordat extra enzymen een combinatie van de gekleurde reactieproducten ontvangen.

Figuur 4. Een combinatie van twee verschillende substraten CPH, red CPH-cellulose en geel CPH-xylaan, behandeld met verschillende enzymen. EEN) Reactie supernatanten na behandeling van twee substraten met endo -cellulase (cel) of endo -xylanase (Xyl) of beide enzymen. B) De absorptie spectra van de reactie supernatanten. Een combinatie van vier verschillende CPH substraten behandeld met verschillende enzymen C) Regeling van de substraatplaat met de CPH substraten. Blue CPH-β-glucan (gerst), geel CPH-xylaan (beukenhout), groene CPH-amylose en rode CPH- pectinestoffen galactan (lupine) D) Afbeelding van de testplaat met de verschillende substraten CPH E) regeling van het product plaat toont de verhouding van de toegevoegde enzymen (nominale concentraties (NC):.. glu = 1 U / ml endo-glucanase, Xyl = 1 U / ml endo -xylanase, amy = 5 U / ml endo-amylase en gal = 0,5 U / ml endo -galactanase). F) Afbeelding van het product plaat na 30 min incubatie bij 25 ° C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Substraat	Bron
CPH-2-hydroxyethyl-	N / A
(CPH-2-HE-cellulose)
CPH-amylopectine	aardappel
CPH-amylose	aardappel
CPH-arabinan	suikerbiet
CPH-arabinoxylaan	tarwe
CPH-caseïne	koemelk
CPH chitosan	dierlijke oorsprong
CPH-curdlan	Alcaligenes faecalis
CPH-dextran	Leuconostoc spp.
CPH-galactomannan	sint
CPH-laminarine	Laminaria digitata
CPH-lichenan	IJslands mos
CPH-methylcellulose	N / A
CPH-pachyman	Poria cocos
CPH-pectinestoffen galactan	aardappel
CPH-pullulan	Aureobasidium pullulans
CPH-rhamnogalacturonan I (RG I)	aardappel
CPH rhamnogalacturonan-I (Gal) *	aardappel
CPH-rhamnogalacturonan	sojaboon
CPH-xylaan	beukenhout
CPH-xyloglucan	tamarinde
CPH-β-glucan uit gerst	gerst
CPH-β-glucaan van haver	haver-
CPH-β-glucan uit gist	gist
ICB-Arabidopsis	Rosette vertrekt uit Arabidopsis thaliana Col-0 (volwassen plant)
ICB-Arabidopsis zaden	Arabidopsis thaliana
ICB-bagasse	Saccharum officinarum (gedroogde volwassen plant, stengel en bladeren)
ICB-kristallijne cellulose (filterpapier)	commerciële Whatman 3MM Chr Chromatography papier
ICB-fenegriekzaden	Trigonella spp. Zaad
ICB-hennep	Cannabis spp. (Gedroogde volwassen plant, stengel en bladeren)
ICB-lupine zaden	Blauwe lupine zaden
ICB-pollen P. pratense	Phleum pratense pollen
ICB-spar	Picea spp. (Migevuld boomstam)
ICB-tabak	vertrekt vanaf Nicotiana benthamiana (jonge planten)
ICB-tarwestro	Triticum spp. (Gedroogde volwassen plant, stengel en bladeren)
ICB-wilg	Salix spp. (Gedroogde volwassen plant, gemalen boomstam)
ICB-Sorghum	Sorghum spp. (Vertrekt uit volwassen plant)
* (β-1,4-D-galactan zijketens verwijderd -β endo-1,4-D-galactanase)

Tabel 1. Lijst van de beschikbare Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) en onoplosbare Chromogenic Biomassa (ICB) substraten.

Discussie

We maken gebruik van een nieuwe generatie van multi-gekleurde CPH en ICB substraten die zijn gebaseerd op chlorotriazine kleurstoffen (volledige lijst van substraten in tabel 1) die in een speciaal ontworpen commerciële testkit. Enzymdigestie van de substraten oplevert kleine, oplosbare, geverfde producten die detecteerbaar in de testoplossing en kan worden gekwantificeerd met behulp van een plaatlezer ^9. Deze test is ontworpen voor het evalueren van endo-werkende enzymen en de gevoeligheid van de test is vergelijkbaar de ene met azurine verknoopt (AZCL) substraten ^10, terwijl andere methoden beschikbaar voor exo-werkende enzymen ^11,12. De beperking van deze testkit ligt in de detectie van endo -enzyme activiteit CPH alsmede de ICB substraten niet afbreekbaar door exo -enzymes waarschijnlijk door sterische hindering die door de kleurstof en crosslinker molecules ^8.

De test wordt uitgevoerd in een 96-well formaat en individuele reacties plaatsvinden in de putjes. De reactie is in de plaat te mengen reproduceerbare gegevens te ontvangen. De resulterende supernatanten worden gefilterd in een plaat product waarbij de absorptie van elk putje kan worden gekwantificeerd middels absorptie spectrometrie. De basisprincipes en de indeling van de assay worden getoond in figuur 1. De test bestaat uit een testplaat (een 96-well filterplaat) met de substraten en na incubatie met enzymen, wordt de bovenstaande vloeistof gefiltreerd in een duidelijke putjes en de absorpties uitgelezen verschaffen van een semi-kwantitatieve meting enzym specificiteit en activiteit. Aangetoond is, dat deze screeningstest gebruikt CPH substraten ook kunnen worden gebruikt in een agarplaat format, waarbij de oplosbare reactieproducten maakt een gekleurde halogeen na overnacht incubatie. ⁸

De testkits kunnen worden gebruikt om gezuiverde enzymen en hun mogelijke nevenactiviteiten scherm zoals aangetoond inFiguur 2. Nevenactiviteiten kan ontstaan ​​uit een enkel enzym en de promiscue specificiteit maar ook een feit dat het geanalyseerde monster een mengsel van verschillende enzymen en hun synergetische effect moet worden bestudeerd. Bovendien, zoals dat in eerdere studies is aangetoond dat enzym cocktails, darmflora ¹³ en kweekbouillon van fungi ⁸ en endogene plantenenzym en bacteriën (ongepubliceerde gegevens) kan worden gebruikt als een enzymbron.

ICB substraten te pakken complexe mengsels van celwand componenten vaak aangetroffen in industriële processen van afbraak biomassa. Deze substraten zijn ontworpen om polysaccharide beschikbaarheid te evalueren en geven informatie over hoe u degradatie cocktails effectief te optimaliseren voor een efficiëntere afbraak output. Zoals weergegeven in figuur 3 kan CPH en ICB substraten in enzym screenen naast elkaar worden gebruikt door side - het onthullen van een schat aan informatie over enzym specificiteit eend activiteiten in zowel de context van de voorkeursuitvoeringsvorm substraat (CPH) en een natuurlijker complex met andere componenten naast het voorkeurssubstraat beter nabootsen van een macromoleculaire assemblage die in de natuur (ICB). Het gebruik van meerdere kleuren maakt gelijktijdige detectie van verschillende enzymactiviteiten tegen verschillende substraten die de high-throughput en multiplexity van de test verhoogt. Spectra van verschillende kleurstoffen kunnen worden opgelost door eenvoudige lineaire regressie en meestal meerdere substraatactiviteit kan alleen worden waargenomen door visuele inspectie. Een gesimuleerd voorbeeld van een dergelijk experiment en de resultaten is weergegeven in figuur 4.

Deze test toolbox en de veelzijdigheid van de toepassing ervan zijn zeer goed geschikt voor eerste niveau screening van enzymen en kweekmedia met onbekende activiteiten. De belangrijkste aspecten van deze test zijn de hoge doorvoer natuur, aanpasbaarheid, gebruiksgemak en flexibiliteit. Met dat in gedachten, we geloven dat deze nieuwe set van tools sterk zal verbeteren en versnellen enzym screening processen in zowel industriële als academische toepassingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
assay kit plates	Glycospot		aangepaste assay kit plates
activation solution	Glycospot		voor het activeren van CPH substraten
350 ml receiver plate spacer block voor vacuüm manifold	Pall Corporation	5015	afstandsblok
96-well MultiScreen HV filter plate, 0.45 µm, helder, niet-steriele	Millipore	MSHVN4510	assay plate
96-Well Microplates, Polypropylene	Greiner Bio-One	651201	verzamelplaat na het wassen van de substraten
Nunc MicroWell 96-Well Microplates	Thermo Scientific	269620	productplaat
Diafragmapomp MZ 2 NT	Vacuubrand	732000	vacuümpomp gebruikt met het vacuüm manifold
Infors HT Ecotron	Infors HT	4950132 (Buch & Holm)	horizontale shaker
SpectraMax M5	Molecular Devices	10067-750 (VWR)	96-well plate absorbance reader
Vacuüm manifold	Pall Corporation	5017	vacuüm manifold
endo-cellulase (EGII) (Trichoderma longibrachiatum)	Megazyme	E-CELTR	cellulase [cel]
endo-β-1,4-mannanase (Cellvibrio japonicus)	Megazyme	E-BMACJ	mannanase [man]
endo-β-1,3-glucanase (Trichoderma spp.)	Megazyme	E-LAMSE	β-glucanase [glu]
endo-β-1,4-D-galactanase (Aspergillus niger)	Megazyme	E-EGALN	galactanase [gal]
endo-β-1,4-xylanase M4 (Aspergillus niger)	Megazyme	E-XYAN4	xylanase [xyl]
endo-xyloglucanase (GH5) (Paenibacillus sp.)	Megazyme	E-XEGP	xyloglucanase [xg]
α-amylase (Bacillus licheniformis)	Megazyme	E-BLAAM	amylase [amy]